一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法
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(10)授权公告号 (45)授权公告日 2014.11.12
C N 103114082
B (21)申请号 201310069093.9
(22)申请日 2013.03.04
C12N 9/36(2006.01)
(73)专利权人浙江工业大学
地址310014 浙江省杭州市下城区潮王路
18号
(72)发明人张健 金志敏 夏春年 姚小武
张岩
(74)专利代理机构杭州天正专利事务所有限公
司 33201
代理人黄美娟 王兵
CN 1108381 C,2003.05.14,
陈若飞.从蛋壳中提取溶菌酶的研究..《沈
阳化工学院院报》.2008,
卢庆祥.用聚丙烯酸凝聚提取溶菌酶..《化
学教学》.1995,
M. Sternberg 和D. Hershberger.Separation of proteins with polyacrylic acids..《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure 》.1974,(54)发明名称
一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法
(57)摘要
本发明公开了一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的
方法:用水将鸡蛋清溶解,调节pH 至4.0~5.0
并加热至80℃左右,使杂蛋白沉淀、过滤除去,获
得滤液;再在弱酸性条件下,用木质素磺酸钠与
滤液中的溶菌酶进行聚合、沉淀;然后,将沉淀物
在碱性条件下溶解,用聚丙烯酰胺水溶液使其解
离,过滤得滤液;最后,向滤液中加入无水乙醇使
其结晶,过滤、干燥即得溶菌酶;本发明使用的原
材料价格低、工艺简单、条件温和、便于操作控制、
生产周期短,比以往的沉淀法更经济,更适合于工
业化生产。(51)Int.Cl.(56)对比文件
审查员 孙彦珂
权利要求书1页 说明书5页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利权利要求书1页 说明书5页(10)授权公告号CN 103114082 B
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1.一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法,其特征在于所述方法按以下步骤进行:
(1)将鲜鸡蛋清用水稀释后,搅拌均匀,调节pH 值至4.0~5.0后立即加热至80~85℃,保温10~15min ,水浴冷却至20~35℃后静置6~10h ,过滤,获得滤液a ;
(2)将步骤(1)获得的滤液a 调pH 值至4.5~6.5,搅拌下,缓慢加入木质素磺酸钠至有沉淀生成,静置3~9小时,过滤,取滤饼用Na 2CO 3水溶液溶解完全后,再缓慢加入聚丙烯酰胺水溶液至无沉淀产生,静置4~8小时,过滤,获得滤液b ;所述木质素磺酸钠以质量浓度10%~20%的木质素磺酸钠水溶液的形式加入,所述木质素磺酸钠水溶液与滤液a 的体积比为0.4~1.2:1;
(3)向步骤(2)获得的滤液b 中缓慢加入无水乙醇至产生白色沉淀,静置,过滤,将滤饼冷冻干燥,获得所述溶菌酶。
2.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法,其特征在于步骤(1)用质量浓度5%的盐酸来调节pH 值。
3.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法,其特征在于步骤(2)中将步骤
(1)获得的滤液a 用质量浓度5%的NaOH 水溶液调pH 值。
4.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法,其特征在于:步骤(2)中的木质素磺酸钠的相对分子量为4000~10000。
5.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法,其特征在于:步骤(2)中Na 2CO 3水溶液的质量浓度为3~10%。
6.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法,其特征在于:步骤(2)中聚丙烯酰胺水溶液的质量浓度为5%~25%。
7.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法,其特征在于步骤(2)加入木质素磺酸钠的温度为15~40℃,所述加入聚丙烯酰胺水溶液的温度为15~40℃。
8.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法,其特征在于步骤(2)中聚丙烯酰胺的相对分子量为300万~800万。
9.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法,其特征在于步骤(3)所述加入无水乙醇的温度为15~40℃。权 利 要 求 书CN 103114082 B
一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法(一)技术领域
[0001] 本发明涉及一种溶菌酶的制备方法,特别涉及一种鸡蛋清中分离溶菌酶的方法。
(二)背景技术
[0002] 溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶,具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。溶菌酶在临床上是有效的消炎剂,在食品防腐和基因工程等方面也有广泛的应用。溶菌酶来源很广,在人、动物、植物和微生物中均有发现,其中鸡蛋清中含量最高,因此,工业生产溶菌酶常以鸡蛋为原料。
[0003] 从鸡蛋中溶菌酶的提取方法报道很多,有直接结晶法、亲和色谱法、离子交换法、沉淀法、双水相萃取、超滤法等。各种方法优缺点不一,产品的质量和生产成本也有所不同。目前,沉淀法是一种工业上应用比较成熟的提取方法,其在技术要求和生产成本上都比较好。
[0004] 其中,生吉萍等【中国食品学报,2003年增刊,10~14】用等电点沉淀法,即先将获取的蛋清液用NaCl 溶液稀释,再用1mol/L 的NaOH 溶液将蛋清pH 值调到9.5~11.0,使其接近溶菌酶的等电点,并4℃下静置,从而使溶菌酶沉淀下来。这种方法操作简单,在工业生产中可以使产品的成本大大降低。但是其生产周期较长,产率相对偏低,纯度不高,高纯度产品获取过程复杂,需要增加较多步骤。
[0005] 康旭、邓川等采用盐析沉淀法【畜牧与饲料科学,2010,31(5),91~92】,即用pH 值为6.5的磷酸盐缓冲液(PBS)将蛋清稀释5倍,在搅拌和除去杂蛋白后,用硫酸铵对上清液分级沉淀,取40%~80%饱和度部分的沉淀,得溶菌酶。得到的溶菌酶纯度达到电泳纯,其中用80%左右饱和度硫酸铵时收率最好。此法得到的溶菌酶纯度和产率都比较高,但是依旧存在沉淀速度慢及不完全的问题,因而使得溶菌酶的活性降低了很多。
[0006] 陈若飞用聚丙烯酸沉淀法从蛋壳中提取溶菌酶【沈阳化工学院学报,2008年9月第22卷第3期222~225】,在除去杂蛋白后,加入NaOH 溶液调pH 至6.0,加入聚丙烯酸,产生乳白色胶状物。将聚合物用Na 2CO 3将其溶解,并pH 调至9.5,加入质量分数为5%的CaCl 2液将溶菌酶聚丙烯酸解离,接着过滤得到澄清溶液。最后加入NaOH 溶液调pH 为10.5左右,使溶菌酶结晶析出。此法选择性好,得到的溶菌酶纯度很高,但是聚丙烯酸价格较贵,而且水溶液的黏性较大,不方便大规模生产。
[0007] 文章军和钱生球在其专利【一种分离溶菌酶的方法】中描述,以蛋清为原料,加水稀释后,搅拌均匀,用酸调pH 至4.0~5.0,静置,除去沉淀,再将溶液升温至75~80℃,冷却静置,过滤得上清液,然后用碱调pH 至7.5~8.0,加入乙醇至产生沉淀,静置6~10小时后过滤,干燥沉淀溶菌酶。其工艺步骤简单、生产周期短、除杂蛋白效果较好、收率也比较高,但是最后所得酶的活性不是特别高。
[0008]
国外,研究者用N-异聚丙烯酰胺与丙烯酸单体的共聚物从蛋清中,【Journal of Biotechnology ,87(2001),95~107】,虽然得到的产品纯度高、收率高、活性也比较好,但是生产的成本高,而且操作十分复杂。