鸡蛋溶菌酶提取
蛋清溶菌酶提取实验报告
一、实验目的1. 了解溶菌酶的生物学特性及其在食品、医药等领域的应用价值。
2. 掌握从鸡蛋清中提取溶菌酶的方法和操作步骤。
3. 学习蛋白质分离纯化的基本原理和实验技术。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种能够水解细菌细胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键的碱性酶。
它主要存在于鸟类和家禽的蛋清中，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
本实验采用盐析法从鸡蛋清中提取溶菌酶，通过改变溶液的离子强度，使溶菌酶从溶液中析出。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜鸡蛋、去离子水、硫酸铵、盐酸、pH试纸、玻璃棒、滤纸、烧杯、漏斗、电子天平、移液管、离心机、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。
2. 实验试剂：硫酸铵、盐酸、去离子水等。
四、实验步骤1. 鸡蛋清制备：将4-5个新鲜鸡蛋打破，分离出鸡蛋清，加入两倍体积的去离子水，搅拌拌匀，过滤杂质。
2. 盐析：向鸡蛋清溶液中加入适量硫酸铵，搅拌溶解，使硫酸铵浓度达到60%左右。
将溶液静置一段时间，使溶菌酶析出。
3. 沉淀分离：用滤纸过滤析出的沉淀，收集滤液。
4. 洗涤：向沉淀中加入少量去离子水，搅拌洗涤，去除杂质。
重复洗涤2-3次。
5. 离心：将洗涤后的沉淀转移到离心管中，以3000r/min离心10分钟，收集上清液。
6. 蛋白质浓度测定：采用紫外可见分光光度计测定上清液中蛋白质浓度。
7. 溶菌酶活性测定：采用溶菌酶活力测定试剂盒测定溶菌酶活性。
五、实验结果与分析1. 蛋白质浓度测定：上清液中蛋白质浓度为1.5mg/mL。
2. 溶菌酶活性测定：溶菌酶活性为200U/mL。
根据实验结果，从鸡蛋清中提取的溶菌酶蛋白质浓度为1.5mg/mL，活性为200U/mL，说明本实验提取的溶菌酶纯度和活性较高。
六、实验讨论1. 盐析法是一种简单、有效的蛋白质分离纯化方法，适用于溶菌酶的提取。
2. 在实验过程中，要注意控制硫酸铵的加入量，以免影响溶菌酶的活性。
如何从蛋清中提取溶菌酶
常用方法
• 盐析法 • 实验原理：高浓度的中性 盐溶液中存在着大量的带 电荷的盐离子，它们能中 和生物分子表面的电荷， 使之得以稳定的双电层受 损，从而破坏分子外围的 水化层；另外，大量盐离 子自身的水合作用降低了 自由水的浓度，从另一方 面压缩了水化层的浓度， 降低了它的亲水性，从而 沉淀析出。 • 离子交换法 • 实验原理：离子交换剂与 溶液中离子或离子化合物 的反应主要以离子交换方 式进行，或者借助离子交 换剂上电荷基团对溶液中 离子或离子化合物的吸附 作用进行，离子交换剂由 基质、电荷基团(或功能基 团)和反离子构成。
从蛋清中提取溶菌酶的方法
溶菌酶作用机制
• 溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶。 • 它作用于N一乙酰氨基葡萄糖胺和N一乙酰胞壁酸 之间的B一1，4糖苷键，能使某些细菌细胞中粘 多糖成分分解。因而具有溶菌能力。 • 溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，处理革 兰氏阳性细菌可得到原生质体。溶菌酶是一种无 毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用， 因此可用作食品烧杯中，边搅拌边加入蛋白质5％的 食盐粉末，促使氯化钠细粉及时溶解，以避免局部浓度过 高或沉淀于容器底部，否则会引起蛋白质的变性而产生大 量的白色沉淀．溶解后再用0．1mol／L的NaOH溶液调节 pH9．5-pH10.0。置于4℃环境中，数天后即有溶菌酶结 晶出现，将酶晶体过滤，收集结晶沉淀粉，用丙酮脱水， 真空干燥即为粗产品。将制得的粗品用pH4．6的醋酸溶 解，然后让酶液静置24小时，接着过滤除去不溶物，收集 滤液并量出体积，按每100毫升液体加5毫克NaCl的比例 加入，然后用0．1mol／L的NaOH溶液缓慢地将其pH值 调节到10．8后，低温下静置结晶。为加速结晶过程可向 酶液中加入溶菌酶晶种，待结晶完全后再倾去上清液，用 布氏漏过滤可得溶菌酶结晶。如纯度不高，可重复操作提 纯，直至达到所需的纯度为止，结晶于30—40℃得溶菌酶 产品。
鸡蛋清溶菌酶提取实验具体步骤
从鸡蛋中提取溶菌酶的步骤1.鸡蛋清样品制备及粗分离将4～5 个（为一个小组，同时两个小组共同进行试验）新鲜鸡蛋打入烧杯然后用矿泉水瓶子吸出蛋黄，分离得鸡蛋清（鸡蛋清pH 值不得小于8.0），量其体积（量筒50ml），加入两倍蛋清体积的（可用双蒸水替代）去离子水，边加边缓慢搅拌，拌匀后用两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，然后用1 mol ／L 的HCl 溶液调pH 值至7.0 左右，再用脱脂棉过滤收集滤液。
2. 724 弱酸性阳离子交换树脂的再生及层析1.吸附：将处理好的蛋清约200 mL，加入32 g再生的724 树脂中，缓慢搅拌吸附6 h。
2.洗涤、洗脱：待分层后，将蛋清液倒去，用去离子水反复冲洗，以去除杂蛋白，滤干树脂，用等体积的0.15mol ／L pH 值为6．5 的磷酸缓冲液洗涤，加入等量的10％（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30 min，使溶菌酶从树脂上洗脱下来，收集洗脱液，4℃冰箱静置过夜。
第二天，有白色沉淀析出，离心（15 min，10 000r ／min）收集沉淀，沉淀物为溶菌酶粗产品浓缩1·透析除盐、去碱性蛋白：4℃条件下，用去离子水透析24 h 左右（1天）直到透析完全（用BaCl2与透析液发生反应直到没有浑浊产生为止）。
离心去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加入1 mol ／L 氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH 值上升至8．0～9．0，如有白色沉淀，即离心去除；（碱性蛋白在此pH条件下会到等电点然后就会沉淀）2·聚乙二醇浓缩：盐析物用1 倍去离子水溶解成稀糊状，装入透析袋，在装有聚乙二醇的试管中吸水浓缩，收集浓缩液；3·冷冻干燥：用3 mol ／L 盐酸调pH值至5．0，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。
溶菌酶纯度检测SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法①凝胶板的制备：用30％分离胶贮液、pH 值为8.9 分离胶缓冲液、10％浓缩胶贮液、pH 值为6.7浓缩胶缓冲液、10％SDS、1％TEMED、重蒸馏水、10％APS 溶液配制而成；②溶菌酶的处理：用磷酸缓冲液制成50 μg ／mL 的溶液，取10~80 μL 点样于凝胶板上③电泳：电流为10 mA，时间4 h；④固定、染色和脱色：电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，分别在固定液与染色液中浸泡10～30 min，用水漂洗干净，再用脱色液脱色。
鸡蛋溶菌酶提取实验报告
一、实验目的1. 掌握鸡蛋溶菌酶的提取方法。
2. 了解溶菌酶的性质和功能。
3. 培养实验操作技能，提高实验分析能力。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于生物体内的碱性蛋白质，主要来源于鸟类的蛋清、哺乳动物的泪液、唾液等。
溶菌酶具有水解细菌细胞壁的作用，能够有效抑制细菌生长，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
本实验采用鸡蛋清作为溶菌酶的提取原料，通过酶解、离心、透析等步骤提取溶菌酶。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜鸡蛋、NaCl、NaOH、丙酮、硫酸铵、蒸馏水等。
2. 实验仪器：高速离心机、恒温水浴锅、玻璃棒、烧杯、漏斗、滤纸、透析袋等。
四、实验步骤1. 酶解：将新鲜鸡蛋打破，取出蛋清，加入适量的NaCl溶液（浓度为0.5mol/L），搅拌均匀，置于恒温水浴锅中，温度控制在37℃，酶解1小时。
2. 离心分离：将酶解后的溶液以3000r/min的速度离心10分钟，收集上清液。
3. 盐析：在上清液中加入适量的硫酸铵固体，搅拌溶解，使蛋白质沉淀。
静置2小时，收集沉淀。
4. 透析：将沉淀用蒸馏水洗涤，去除杂质，然后将其放入透析袋中，置于蒸馏水中，透析24小时，去除小分子物质。
5. 浓缩：将透析后的溶液在50℃下减压浓缩，使蛋白质浓度提高。
6. 纯化：将浓缩后的溶液加入适量的丙酮，使蛋白质沉淀。
静置2小时，收集沉淀。
7. 干燥：将沉淀在50℃下真空干燥，得到溶菌酶粉末。
五、实验结果与分析1. 酶解过程中，蛋清逐渐变得透明，表明溶菌酶开始释放。
2. 离心分离后，上清液中溶菌酶浓度较高，下清液中含有其他杂质。
3. 盐析过程中，蛋白质沉淀较多，表明溶菌酶在硫酸铵溶液中具有较好的溶解性。
4. 透析过程中，透析袋中的溶液逐渐变得清澈，表明小分子物质已被去除。
5. 浓缩过程中，蛋白质浓度逐渐提高，有利于后续的纯化。
6. 纯化过程中，丙酮沉淀的蛋白质较多，表明溶菌酶在丙酮中具有较好的溶解性。
7. 干燥后，得到白色粉末，表明溶菌酶已被成功提取。
鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定
进口溶菌酶，存在着价格较高，进口环节复杂等诸 多方面的限制。
国产溶菌酶工业刚刚起步，生产规模小，工业水平 落后，产品的质量与国际标准差距较大。存在提取 率低，处理量小和产品比活低等缺点。
我国是世界上最大的产蛋国家，原料来源丰富，目 前鲜蛋基本作为初级食品食用，深加工不足。而发 达国家的鲜蛋加工业可以加工较高，得到的溶菌酶纯度高，还能分离纯化经化学修饰 而失活的溶菌酶以及具活性的溶菌酶，亦能用于检测酶与底物相结合的 氨基酸残基。对于浓缩与精制微量的溶菌酶，区分天然溶菌酶和修饰酶， 或探索与底物结合的酶分子氨基酸残基状况等问题，这是很有效的方法。 缺点： 由于亲和吸附剂的制作较为复杂，成本高，而且操作难度大，限制了它 在工业上的大规模利用。
目前美国、加拿大、荷兰、法国、德国、丹麦、意 大利、日本等国家均生产溶菌酶，其产量与日俱增。 近年来，溶菌酶被用作天然防腐剂，极大的促进了 其市场需求，每年以10%的速率增长，现在市场规模 约为700吨。
我国的食品工业、精细化工业、医药工业对溶菌酶 具有较大的需求。我国于上世纪70年代采用离子交 换法生产溶菌酶。
（2）非酶学测定法： 电泳法使用历史较长，测定的溶菌酶含量包括有活 性及失去活性的溶菌酶总量。
免疫法技术的发展而产生的。此类方法灵敏度高， 为定性也较好。但是这类方法需要制备抗体，实验 条件较酶学法复杂，因此大大限制了该类方法的应 用。
盐析法
1878年Hammarster首次使用，是粗分离蛋白质的重 要方法之一。
价廉易得，分段效果比其他盐好，性质温和，即使浓 度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。
实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1。 盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或 1饱和度的百分之几，即称为为该蛋白盐析的饱和度。
蛋清溶菌酶分离实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握溶菌酶的提取、分离纯化技术。
2. 掌握电渗析/超滤内在耦合（EDUF）技术在分离蛋白中的应用。
3. 分析实验过程中影响分离效果的因素，优化实验条件。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种天然碱性蛋白质，具有抗菌、消炎和抗病毒等功能。
溶菌酶广泛存在于鸡蛋清中，含量丰富。
本实验采用EDUF技术，利用溶菌酶与卵白蛋白（OVA）在特定pH条件下的荷电性及分子量差异，从鸡蛋清中分离提取溶菌酶。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：鸡蛋清、PVDF100超滤膜、氯化钠、磷酸缓冲液、溶菌酶标准品等。
2. 实验仪器：电渗析/超滤装置、电子天平、pH计、分光光度计、离心机、恒温水浴锅等。
四、实验步骤1. 预处理：将鸡蛋清用4层纱布过滤，去除杂质。
2. 调节pH值：将过滤后的鸡蛋清用1 mol/L的HCl溶液调节pH值至7.0。
3. 电渗析/超滤：将调节pH值后的鸡蛋清加入EDUF装置中，设置操作电压为5.0V，原料室和回收室料液流量均为50mL/min，进行电渗析/超滤。
4. 收集溶菌酶：将电渗析/超滤后的溶液用离心机离心，收集沉淀。
5. 纯化：将沉淀用磷酸缓冲液（pH值为8.0）溶解，通过离子交换树脂纯化溶菌酶。
6. 活性测定：采用分光光度法测定溶菌酶的活性。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶回收率：在操作电压为5.0V，采用PVDF100超滤膜，原料室和回收室料液流量均为50mL/min的条件下，溶菌酶的回收率可达21.05%。
2. 溶菌酶纯度：经纯化处理后，溶菌酶的纯度可达100%。
3. 溶菌酶活性：通过分光光度法测定，溶菌酶的活性为2.30U/mg。
4. 影响分离效果的因素分析：（1）pH值：溶菌酶在pH值为8.0时活性最高，因此在纯化过程中将pH值调节至8.0。
（2）操作电压：操作电压越高，溶菌酶的回收率越高，但电压过高会导致溶菌酶变性，因此选择5.0V为最佳操作电压。
（3）超滤膜材料：PVDF100超滤膜对溶菌酶的截留效果较好，因此选择该膜材料。
提取溶菌酶的实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握溶菌酶的提取方法；2. 了解溶菌酶的分离纯化过程；3. 掌握酶活力和蛋白浓度的测定方法；4. 学习溶菌酶纯度鉴定与分子量测定。
二、实验原理溶菌酶是一种胞壁质酶，主要存在于鸡蛋清中。
溶菌酶能够水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁质，导致细菌细胞壁破裂，从而起到杀菌作用。
本实验通过提取鸡蛋清中的溶菌酶，对其进行分离纯化，并测定其酶活力、蛋白浓度、纯度和分子量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：鸡蛋、硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、考马斯亮蓝G-250、邻苯二甲酸氢钾、苯酚、硫酸铜、氢氧化钠、无水乙醇等；2. 实验仪器：高速离心机、恒温水浴锅、分光光度计、pH计、电子天平等。
四、实验方法1. 溶菌酶的粗提取（1）取新鲜鸡蛋清，用4倍体积的0.1mol/L的NaOH溶液溶解；（2）将溶液搅拌均匀，置于4℃冰箱中过夜；（3）次日，将溶液用等体积的4倍体积的0.1mol/L的HCl溶液调节pH至4.5；（4）将溶液置于高速离心机中，以10000r/min离心30分钟；（5）取上清液即为粗提溶菌酶。
2. 溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定（1）取粗提溶菌酶溶液，用硫酸铵饱和溶液进行盐析，调节硫酸铵浓度为0.5mol/L；（2）将溶液置于4℃冰箱中过夜；（3）次日，将溶液用高速离心机以10000r/min离心30分钟，取沉淀；（4）将沉淀用0.1mol/L的pH 7.0的磷酸缓冲溶液溶解，得纯化溶菌酶溶液；（5）测定酶活力和蛋白浓度，酶活力单位以每分钟产生1μmol的产物为1个单位，蛋白浓度采用考马斯亮蓝G-250法测定。
3. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定（1）取纯化溶菌酶溶液，进行SDS-PAGE电泳分析；（2）根据电泳结果，计算溶菌酶的分子量；（3）根据纯化溶菌酶溶液的蛋白浓度和酶活力，计算溶菌酶的纯度。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶的粗提取通过实验，成功提取了鸡蛋清中的溶菌酶，提取率为0.5%。
鸡蛋中溶菌酶的提取
鸡蛋中溶菌酶的提取，纯化及纯度鉴定李莹姝蒋华云*（南京师范大学生命科学学院，南京 210046）摘要：从蛋清中用724弱酸性阳离子交换树脂提取溶菌酶，然后用硫酸铵溶液洗脱，盐析得到溶菌酶。
用葡聚糖凝胶层析（SephadexG-75）纯化溶菌酶，收集峰值处样品。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳鉴定个步骤留样及所得溶菌酶样品的纯度。
溶菌酶得率为0.0474mg/100ml（0.03g/kg）；葡聚糖凝胶层析过程纯化样品得到了洗脱峰曲线，但未能收集到峰值处样品；电泳结果显示在纯化过程中溶菌酶纯度不断升高。
本实验溶菌酶得率较低，提取工艺有待改进，需进一步减少样品损失；层析过程需进一步熟练掌握，以更好达到纯化效果。
关键词：溶菌酶；离子交换树脂，凝胶层析；SDS-PAGEExtraction, purification and purity of Egg lysozymeYings Li Huay Jiang*(College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China)Abstract:From egg white, with 724 weak acid cation exchange resin extraction of lysozyme, and then eluted with ammonium sulfate, salting to be lysozyme. With dextran gel chromatography (SephadexG-75) purified lysozyme, the peak of the sample collection. By SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) electrophoresis and identified steps to stay kind of purity of the samples from lysozyme. Lysozyme yield 0.0474mg/100ml (0.03g/kg); dextran gel chromatography purified samples obtained during elution peak curve, but failed to collect samples at the peak; electrophoresis showed that the purification process of lysozyme enzyme purity rising. In this study, lysozyme was the low rate of extraction process could be improved, the need to further reduce sample losses; chromatography process needs further proficiency in order to better achieve purification.Key words:lysozyme, Ion exchange resin, Gel chromatography, SDS-PAGE溶菌酶( Lysozyme , 1,4－β－N－溶菌酶) 是一种专门作用于革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的β-1,4- 糖苷键的水解酶, 因而又称为胞壁质酶或者N- 胞壁质聚糖水解酶。
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鸡蛋溶菌酶提取溶菌酶（又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶）是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
性质：白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。
稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96℃， pH值为3条件下，15min后活力保持87%。
抑制剂有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。
1%水溶液在281.5nm 处的吸光系数为26.4。
通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌作用：溶菌酶的用途极为广泛，在医药上，可与血液中的病毒结合，阻止流感、腺病毒等的繁殖；能分解粘多糖，有利于脓汁、痰液的排出；能清除坏死组织、增进抗生素的药效以及促进肠道有益细菌如乳酸菌的繁殖等作用；另外，它与抗生素联合应用还可治疗支气管炎、肺炎、白喉、小儿急性肾炎等多种疾病。
在食品上，卵清溶菌酶是无毒的蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解，而对其他物质无反应，人们利用它来代替有害健康的化学防腐剂（如苯甲酸及其钠盐），以达到保存食物的目的，是一种天然防腐剂；溶菌酶添加于牛乳，可使牛乳人乳化，提高了牛乳的营养价值。
提取工艺：（一）鸡蛋清中提取溶菌酶方法一——食盐盐析一．材料：原料：鸡蛋、NaOH、NaCl、丙酮、（市售溶菌酶粉剂）仪器与设备：搅拌器（200-300r/min）,离心机（4000r/min），抽滤机二．工艺流程：原料→ 清洗→ 去蛋壳→ 分离蛋清→ 搅拌→ 过滤→ 加盐→ 调节pH值→ 结晶→ 干燥→ 成品→ 包装三．实验步骤：1选择新鲜鸡蛋，蛋清的pH值不能低于8.0，否则不能用。
2清洗:用水洗掉蛋壳表面的不洁之物。
3将鸡蛋的两端各敲一个小洞，使蛋清流出。
4用搅拌机搅拌，将蛋清搅拌稠度均匀即可，以不引起泡沫为宜，防止由于起泡引起蛋白质的泡沫变性，而影响溶菌酶活性及产率。
5过滤：用双层纱布将稠度均匀的蛋清过滤，滤除蛋清溶液中的脐带块及蛋壳等。
6加盐：按50:1的比例（NaCl:蛋清液），向蛋清液中加入NaCl细粉，边搅拌边加入促使NaCl细粉及时溶解，以避免NaCl沉于容器底部，而因局部浓度过高而产生大量的白色沉淀7 结晶：用1mod/l的NaOH溶液调节PH为9.5-10.0,边搅拌边加，避免过碱引起蛋白质变性。
于4℃条件下静置过夜，至结晶析出。
为加速其结晶过程，可加入适量溶菌酶晶种（晶种制备：将市售溶菌酶粉剂配制成５％水溶液，每10mL 加入Nacl 0.5g，滴加１Ｍ NaOH溶液调ｐＨ值至9.5—10.0，置4℃冰箱中，结晶析出即成）。
不加晶种两周左右结晶率最高，反之７２—９６ｈ最高。
8结晶过滤或分离：用滤纸或尼龙布过滤，或用离心机离心10min，得到溶菌酶结晶。
9结晶洗涤：用丙酮将溶菌酶结晶洗涤数次（一般3次即可）。
10干燥：将溶菌酶结晶在常温或（50-60）℃条件下干燥制成成品，水分含量质量分数约为（2-3）%。
方法二——离子交换法一．材料原料与试剂：鲜鸡蛋（市售）、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、丙酮、724型阳离子交换树脂等，以上药品均为分析纯。
主要仪器：分光光度计（７２３０Ｇ型）、搅拌器（２００～３００ｒｐｍ）、离心机（4000rpm）。
二．工艺流程三．实验步骤１蛋黄与蛋清的分离。
取新鲜的鸡蛋，去壳，经分离器后，使蛋清与蛋黄分离。
打破蛋壳时应避免蛋黄破散，使两者完全分离。
２蛋清的预处理。
将分离后的蛋清加入到搅拌器中，200-300 rpm下搅拌10min，再将蛋清搅拌稠度均匀即可，以不引起发泡为宜。
最后用2-3层纱布过滤，以除去残余蛋壳和少量蛋黄。
３吸附。
将过滤后的蛋清冷至５℃后移入搪瓷捅中，然后在搅拌下加入已处理好的树脂（14%加入），使其悬浮在蛋清中，在０～５℃下，搅拌吸附５ｈ，然后在０－６℃静置２０ｈ以上，等分层后，弃去上清液后的树脂用清水反复冲洗２－３次。
以除去杂蛋白，最后晾干树脂，移入一个搪瓷缸中。
４酶的洗脱。
在上述树脂中加入同体积的0.15 mol/L的pH 6.5磷酸盐缓冲液，搅拌洗脱20min，过滤洗脱液，除去一部分杂质。
再重复洗脱２次。
将除去杂质的树脂加入等量浓度为10%的硫酸铵溶液，搅拌洗脱 30min，滤出洗脱液，重复洗脱３次，滤出的洗脱液一起倒入沉淀缸中沉淀。
５沉淀。
在沉淀缸中按洗脱液的体积加入32％固体硫酸铵，搅拌使其溶解，在４℃放置过夜。
第２天，用虹吸法取出上清，4000rpm离心10min分离沉淀物。
６透析。
将沉淀物用蒸馏水全部溶解，然后放入透析袋中，在10℃水中透析过夜，以除去沉淀中的硫酸铵。
收集透析液。
７盐析。
将透析液移入一容器内，用0.1mol/L的NaOH调溶液ｐＨ至８．５~９．０，有白色沉淀时，应立即离心除去沉淀。
用２mol/L HCl调ｐＨ至3.5，搅拌，并在0℃放置４８ｈ，同上离心收集沉淀物。
８成品的干燥。
将上述沉淀物加入到丙酮，搅拌。
放置２ｈ，收集沉淀，用冷冻干燥法干燥沉淀即得产品。
干燥的溶菌酶可在室温下长期保存。
其纯品为白色或微黄色的结晶体或粉末，无臭，味甜，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚等有机溶剂。
方法三——离子交换法一．实验材料鸡蛋（新鲜）磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、氯化钠、丙酮、硫酸铵、724 型阳离子交换树脂等。
二．工艺流程硫酸洗脱蒸馏水，溶解pH=3.5，固体NaCl盐析三．实验步骤（1）树脂处理：将724 树脂先用 w（ NaOH）= 7%的溶液浸泡 2h，滤出树脂凉干，再用 c（HCI）= 0.1moI / L的溶液浸泡 8 h，滤出树脂凉干后，用w（NaCI）= 10% 的溶液浸泡 8 h，滤出树脂凉干备用。
（2）缓冲液配制：取30 . 0 g NaH2 PO4 及 35.8 g Na2 HPO4 溶于 1 L 水中即得 pH = 6.5 的磷酸盐缓冲液。
（3）原料处理：新鲜的蛋清用 pH 试纸测其 pH值应为 8 . 0 左右。
（4）吸附：用冰水冷却并搅拌蛋清，使温度降到5 ℃，缓缓加入 724 型树脂，在不断搅拌下使树脂完全悬浮于蛋清中，保持温度0 ~ 10 ℃ ，继续搅拌 5 h，然后将蛋清在0 ~ 10 ℃静置 12h以上。
（5）洗涤、洗脱：把上层蛋清倾出，下层树脂用清水洗去附着的蛋白质，先后共洗涤四次，最后将树脂滤去水分，用磷酸盐缓冲液分三次加入搅拌，每次搅拌 15 min 后抽滤去水分，然后用ψ（H2 SO4）=1% 的稀硫酸分四次洗脱溶菌酶，合并洗脱液，在洗脱液中加入 w〔（NH4）2 SO4〕=40% 的溶液，析出白色沉淀。
在0 ~ 10 ℃静置 12 h 以上，过滤出沉淀。
（6）透析：将沉淀溶于蒸馏水中，在0 ~ 10 C℃透析 24 h，除去大部分硫酸铵。
（7）盐析：用滴管慢慢加入氢氧化钠溶液， pH 使= 8 . 5 ~ 9 . 0，如有白色沉淀，应即离心除去，然后在搅拌下加入 c（HCI）= 3.0 mOI / L 的盐酸，使溶液 pH= 3.5。
按盐析液的体积缓缓加入 w（NaCI）=5% 的固体氯化钠，则有白色沉淀生成，0 ~ 10 ℃静置 48h，抽滤得到溶菌酶粗品。
（8）精制：将粗品溶菌酶溶入0 ℃无水丙酮中，控制溶液的ρ（粗溶菌酶）= 100 g / L，缓慢搅拌使颗粒松细，在0 ~ 10 C℃静置数小时，滤去丙酮，沉淀真空干燥，即得溶菌酶精品。
如果不用丙酮脱水，将透析液冷冻干燥可得不含氯化钠的溶菌酶。
按蛋清质量计收率为 0.14% 。
方法四——离子交换法（改进工艺）1．将新鲜鸡蛋洗净、控干水、敲破小头、收集蛋清，4℃放置1h以上。
2.724树脂的处理：用1mol/L HCl浸泡树脂2h，用去离子水洗至近中性，再用1mol/L NaOH 浸泡2h ，用去离子水洗至近中性（用过的树脂直接用1mol/L NaOH 浸泡，用去离子水洗至近中性）再用0.15mol/L pH6.5的磷酸盐缓冲液浸泡过夜，滤后备用。
3.吸附。
将冷蛋清加入处理好的 724树脂（每千克蛋清需要未处理树脂160g）大力搅（冰浴中）吸附6h，4℃静置，次日离心（3000r/min，15min），收集树脂，回收蛋清。
4.洗去杂蛋白。
树脂先用去离子水洗至洗液无浑浊，再用等体积的0.15mol/L pH6.5的磷酸盐缓冲液搅拌洗涤20min（冰浴下）搅拌洗涤应重复 2次，最后1次滤除树脂水分。
5. 洗脱溶菌酶。
树脂用等体积的10%的（NH4）2SO4浸泡，4℃下过夜，次日搅拌30min，洗脱液经尼龙布过滤，准确量取体积。
再加入体积10%的（NH4）2SO4重复洗脱2次，合并洗脱液。
6.盐析溶菌酶。
每83ml洗脱液加32g磨细的固体（NH4）2SO4，在搅拌下缓慢加入，待（NH4）2SO4完全溶解后，4℃放置过夜。
次日，离心（3000r/min，15min），收集沉淀。
7.透析除盐。
将盐析沉淀装入透析袋，用蒸馏水透析24h以上，其间换2次蒸馏水。
8. 去杂质。
取出透析袋中的透析液，用 2mol/L HCl调整pH4.6，离心，收集上清液。
其沉淀加少量蒸馏水（约为沉淀的5倍）搅匀，再重复处理 2次。
合并上清液、调整pH5.5，再加,1mol/L NaHPO4—KH2PO4 缓冲液（pH5.5）,达终浓度为10mmol/L，静置10min、离心、弃沉淀，收集纯化液。
9.浓缩与干燥。
纯化液在（40±2）℃真空旋转蒸发，变浊时倒出、冷冻，室温真空干燥。
方法五——阳离子交换法一．实验材料1.阳离子交换树脂（７３２）树脂，聚丙烯酰胺凝胶（ｓＤｓ—ＰＡＧＥ）2.乙酸和配缓冲液用的磷酸钠与氢氧化钠等试剂均为分析纯（ＡＲ级）。
3.鸡蛋从自由市场上随机购买，新鲜无异常。
二．实验步骤1按照国家有关标准方法配置ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８、ｐＨ９的四种磷酸缓冲液。
2鸡蛋清样品处理方法去蛋壳，手工分离得鸡蛋白，分别加ｐＨ６到ｐＨ９的缓冲液充分浸泡蛋白，均质处理上述缓冲液处理过的蛋白液（四种磷酸缓冲蛋白液）。
3 分离层析柱制备及溶菌酶分离方法７３２树脂经多重蒸馏水处理后，小心灌人1X30 cm的柱中，再以ＰＨ６到９的缓冲液分别洗涤，制得四种缓冲能力的７３２树脂分离柱。
将上述四种磷酸缓冲蛋白液分别移入相应ｐＨ值缓冲液处理过的分离柱，以相应缓冲液洗脱一定时间后，再以0.1 mol/L的乙酸洗脱，在整个洗脱过程中，洗脱液每10 ml收集一管，收集到的洗脱液立即经280nm检验溶菌酶和其它杂蛋白的洗脱顺序。