鸡蛋溶菌酶提取

鸡蛋溶菌酶提取

溶菌酶（又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶）

是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。

性质：

白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适

pH值6.5。稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96℃， pH值为3条件下，15min后活力保持87%。抑制剂有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。1%水溶液在281.5nm 处的吸光系数为26.4。通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌

作用：

溶菌酶的用途极为广泛，在医药上，可与血液中的病毒结合，阻止流感、腺病毒等的繁殖；能分解粘多糖，有利于脓汁、痰液的排出；能清除坏死组织、增进抗生素的药效以及促进肠道有益细菌如乳酸菌的繁殖等作用；另外，它与抗生素联合应用还可治疗支气管炎、肺炎、白喉、小儿急性肾炎等多种疾病。在食品上，卵清溶菌酶是无毒的蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解，而对其他物质无反应，人们利用它来代替有害健康的化学防腐剂（如苯甲酸及其钠盐），以达到保存食物的目的，是一种天然防腐剂；溶菌酶添加于牛乳，可使牛乳人乳化，提高了牛乳的营养价值。

提取工艺：

（一）鸡蛋清中提取溶菌酶

方法一——食盐盐析

一．材料：

原料：鸡蛋、NaOH、NaCl、丙酮、（市售溶菌酶粉剂）

仪器与设备：搅拌器（200-300r/min）,离心机（4000r/min），抽滤机

二．工艺流程：

原料→ 清洗→ 去蛋壳→ 分离蛋清→ 搅拌→ 过滤→ 加盐→ 调节pH

值→ 结晶→ 干燥→ 成品→ 包装

三．实验步骤：

1选择新鲜鸡蛋，蛋清的pH值不能低于8.0，否则不能用。

2清洗:用水洗掉蛋壳表面的不洁之物。

3将鸡蛋的两端各敲一个小洞，使蛋清流出。

4用搅拌机搅拌，将蛋清搅拌稠度均匀即可，以不引起泡沫为宜，防止由于起泡引起蛋白质的泡沫变性，而影响溶菌酶活性及产率。

5过滤：用双层纱布将稠度均匀的蛋清过滤，滤除蛋清溶液中的脐带块及蛋壳等。

6加盐：按50:1的比例（NaCl:蛋清液），向蛋清液中加入NaCl细粉，边搅拌边加入促使NaCl细粉及时溶解，以避免NaCl沉于容器底部，而因局部浓度过高而产生大量的白色沉淀

7 结晶：用1mod/l的NaOH溶液调节PH为9.5-10.0,边搅拌边加，避免过碱引起蛋白质变性。于4℃条件下静置过夜，至结晶析出。为加速其结晶过程，可加入适量溶菌酶晶种（晶种制备：将市售溶菌酶粉剂配制成５％水溶液，每10mL 加入Nacl 0.5g，滴加１Ｍ NaOH溶液调ｐＨ值至9.5—10.0，置4℃冰箱中，结晶析出即成）。不加晶种两周左右结晶率最高，反之７２—９６ｈ最高。

8结晶过滤或分离：用滤纸或尼龙布过滤，或用离心机离心10min，得到溶菌酶结晶。 9结晶洗涤：用丙酮将溶菌酶结晶洗涤数次（一般3次即可）。

10干燥：将溶菌酶结晶在常温或（50-60）℃条件下干燥制成成品，水分含量质量分数约为（2-3）%。

方法二——离子交换法

一．材料

原料与试剂：鲜鸡蛋（市售）、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、丙酮、724型阳离子交换树脂等，以上药品均为分析纯。

主要仪器：分光光度计（７２３０Ｇ型）、搅拌器（２００～３００ｒｐｍ）、离心机（4000rpm）。

二．工艺流程

三．实验步骤

１蛋黄与蛋清的分离。取新鲜的鸡蛋，去壳，经分离器后，使蛋清与蛋黄分离。打破蛋壳时应避免蛋黄破散，使两者完全分离。

２蛋清的预处理。将分离后的蛋清加入到搅拌器中，200-300 rpm下搅拌10min，再将蛋清搅拌稠度均匀即可，以不引起发泡为宜。最后用2-3层纱布过滤，以除去残余蛋壳和少量蛋黄。

３吸附。将过滤后的蛋清冷至５℃后移入搪瓷捅中，然后在搅拌下加入已处理好的树脂（14%加入），使其悬浮在蛋清中，在０～５℃下，搅拌吸附５ｈ，然后在０－６℃静置２０ｈ以上，等分层后，弃去上清液后的树脂用清水反复冲洗２－３次。以除去杂蛋白，最后晾干树脂，移入一个搪瓷缸中。

４酶的洗脱。在上述树脂中加入同体积的0.15 mol/L的pH 6.5磷酸盐缓冲液，搅拌洗脱20min，过滤洗脱液，除去一部分杂质。再重复洗脱２次。将除去杂质的树脂加入等量浓度为10%的硫酸铵溶液，搅拌洗脱 30min，滤出洗脱液，重复洗脱３次，滤出的洗脱液一起倒入沉淀缸中沉淀。

５沉淀。在沉淀缸中按洗脱液的体积加入32％固体硫酸铵，搅拌使其溶解，在４℃放置过夜。第２天，用虹吸法取出上清，4000rpm离心10min分离沉淀物。

６透析。将沉淀物用蒸馏水全部溶解，然后放入透析袋中，在10℃水中透析过夜，以除去沉淀中的硫酸铵。收集透析液。

７盐析。将透析液移入一容器内，用0.1mol/L的NaOH调溶液ｐＨ至８．５~９．０，有白色沉淀时，应立即离心除去沉淀。用２mol/L HCl调ｐＨ至3.5，搅拌，并在0℃放置４８ｈ，同上离心收集沉淀物。

８成品的干燥。将上述沉淀物加入到丙酮，搅拌。放置２ｈ，收集沉淀，用冷冻干燥法干燥沉淀即得产品。干燥的溶菌酶可在室温下长期保存。其纯品为白色或微黄色的结晶体或粉末，无臭，味甜，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚等有机溶剂。

方法三——离子交换法

一．实验材料

鸡蛋（新鲜）磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、氯化钠、丙酮、硫酸铵、724 型阳离子交换树脂等。

二．工艺流程

硫酸洗脱

蒸馏水，溶解

pH=3.5，固体NaCl

盐析

三．实验步骤