从鸡蛋清中提取溶菌酶 讲义PPT课件
鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定2012课件
一旦我单位在贵局承办的“海峡两岸 渔业资 源增殖 放流活 动”放 流苗种 招标中 中标， 我单位 将严格 按照招 标方案 的要求 和合同 的约定 执行
我国的食品工业、精细化工业、医药工业对溶菌酶 具有较大的需求。我国于上世纪70年代采用离子交 换法生产溶菌酶。 目前国内有大连生化、天津东原、烟台金梓等厂家 生产，初步满足了国内科研及医药工业的需求。 进口溶菌酶，存在着价格较高，进口环节复杂等诸 多方面的限制。 国产溶菌酶工业刚刚起步，生产规模小，工业水平 落后，产品的质量与国际标准差距较大。存在提取 率低，处理量小和产品比活低等缺点。
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4.1 直接结晶法
优点： 操作简单，原料便宜，设备投资小。最早应用于蛋清溶菌酶的工业生 产，使产品的成本大大降低，为其医药应用作出了贡献。 缺点： （1）生产周期长。 （2）由于蛋白质在其等电点不稳定，因此生产过程中溶菌酶易失活。 （3）由于存在溶解平衡，而使不少溶菌酶残留于母液。因此不能用 以分离微量的溶菌酶。 （4）收率低，活性低。 （5）处理后的蛋清难以再利用。此点导致溶菌酶成本大幅上升。
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2.2 酶工程上的应用 近年来，溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少 的工具酶，用以提取菌体内的活性物质如核酸、酶及 活性多肽等。
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溶菌酶PPT课件
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1.3 植物溶菌酶：目前已从木瓜、无花果、芜菁、大麦等植物中分 离出溶菌酶，其分子量较大，约为24000～29100。植物溶菌酶对 溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3，但对胶体状甲壳 质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。 1.4 微生物产生的溶菌酶：人们从60年代开始，发现微生物也能产
丙酮
(6) 溶菌酶标准品；Sephadex G50 ⑺ N-乙酰葡萄糖胺；硫酸铜；硫酸亚铁；硫酸锌； 氯化镁；氯化钙；氢氧化钠；盐酸
⑻ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂；蛋白含量测定 （福林法）试剂
⑼ 聚乙二醇-20000、两性电解质
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【实验操作】
1.蛋清的制备
将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清
生溶菌酶，并且进展很快。目前微生物产生的溶菌酶大体上分以下 5种：（1）内N-乙酰已糖胺酶，此酶同于鸡蛋清溶菌酶，破坏细菌 细胞壁肽聚糖中的β-1，4糖苷键。（2）酰胺酶，切断细菌细胞壁 肽聚糖中NAM与肽“尾”之间的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸键。（3） 内肽酶，使肽“尾”及肽“桥”内的肽键断裂。（4）β-1，3、β-1， 6葡聚糖酶和甘露聚糖酶，此酶分解酵母细胞的细胞壁。（5）壳多 糖酶，这是分解霉菌细胞壁一种溶菌酶。
流出（鸡蛋清pH值不得小于8），轻轻搅拌5分钟，
使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带
溶菌酶
• 组员.刘英炜，甘文圣 ，牛根坡，石方.
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一·溶菌酶定义：溶菌酶（lysozyme） 又称 胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚 糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏 多糖的碱性酶。
实验3 溶菌酶分离提纯
（一）分离提纯
【目的和要求】 目的和要求】
1.了解并掌握从鸡蛋清中粗制备溶菌酶的原理及方法。 了解并掌握从鸡蛋清中粗制备溶菌酶的原理及方法。 了解并掌握从鸡蛋清中粗制备溶菌酶的原理及方法 2.了解并掌握离子交换层析法分离提纯蛋白质的一般 了解并掌握离子交换层析法分离提纯蛋白质的一般 原理和操作方法。 原理和操作方法。
【实验方法】 实验方法】
1．取20ml ddH2O，用醋酸调pH值为 ，水浴加热 ℃。 ． 值为3.5，水浴加热85℃ ，用醋酸调 值为 加入10ml新鲜蛋清，在搅拌条件下加热 分钟。 新鲜蛋清， 分钟。 加入 新鲜蛋清 在搅拌条件下加热5分钟 2．将所得液体10000g 离心 ．将所得液体 离心10min，收集上清液，由此得到 ，收集上清液， 溶菌酶粗提液。 溶菌酶粗提液。 3．装柱：取聚丙烯层析柱（1ml），关闭层析柱出口。自 ．装柱：取聚丙烯层析柱（ ），关闭层析柱出口 ），关闭层析柱出口。 顶部徐徐加入2ml CM Sepharose FF悬浮液，待凝胶颗粒沉降 悬浮液， 顶部徐徐加入 悬浮液 放出过量的溶液。 倍柱床体积） 柱床， 后，放出过量的溶液。用ddH2O（5-8倍柱床体积）冲洗柱床， （ 倍柱床体积 冲洗柱床 去除乙醇。冲洗完毕，关闭柱子出口， 去除乙醇。冲洗完毕，关闭柱子出口，保持液面高出凝胶表面 1cm。 。
【实验原理】 实验原理】
【实验原理】 实验原理】
1. 溶菌酶的粗提 鸡蛋清液
酸性条件， 酸性条件，85℃
溶菌酶带正电荷，与酸根负离子生成可溶性盐 溶菌酶带正电荷，与酸根负离子生成可溶性盐 溶菌酶耐热性较高 溶菌酶耐热性较高，而其它杂蛋白在高温下变性沉淀 耐热性较高，
离心
使溶菌酶与其他蛋白质分开， 使溶菌酶与其他蛋白质分开，得到溶菌酶的粗提液
鸡蛋清中溶菌酶的提取与抑菌作用4
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1 3 4 溶菌酶提取率测定 用万分之一电子天平称取冷冻干燥后溶菌酶
晶体质量, 减去作为晶种加入的溶菌酶质量, 除 以蛋清液体积。 1 3 5 溶菌酶对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的抑 制作用 [ 7 - 8 ]
采用滤纸片法。用打孔器打出直径 5mm 滤纸 圆片, 高压灭菌。分别吸取 0 1mL 大肠杆菌与金 黄色葡萄球菌菌悬液加在已倒好的牛肉膏蛋白胨 平板培养基表面, 涂布均匀。用无菌镊子夹取已 在溶菌酶溶液中浸渍 30m in滤纸片, 放到上述含 菌平皿上, 每皿三片, 于 37 恒温培养 24h 后取 出, 量取 抑菌圈 直径, 取其 平均 值作 为实 验结 果。
固定蒸馏水添加量为蛋清体积的 2倍, 氯化 钠加入量为蛋清溶液的 5% , 在 4 下静置 1w 结 晶, 分 别 调 节 酶 液 pH 为 8 5、 9、 9 5、 10、 10 5, 测得溶菌酶粗提取率的结果见图 2。由图 2 可见, 酶液 pH 可选 9 5、 10 0、 10 5 作为正 交 试验的条件。
过滤并混匀, 按蛋清体积加入蒸馏水, 轻轻搅拌 5m in, 使蛋清溶液的稠度均匀。之后向蛋清溶液 中缓慢加入氯化钠细粉并轻轻搅拌。加完氯化钠 后, 再用氢氧化钠溶液调节 pH, 加入定量标准溶 菌酶结晶作为晶种。 4 下静置。待结晶完全后, 用布氏漏斗 滤出结 晶, 即得到 粗制 的溶 菌酶 晶 体。
在单因子试验的基础上, 选用 L9 ( 33 ) 正交 表, 进行正交试验, 优化溶菌酶粗提取的工艺参 数表。因素水平见表。
表 1 盐析法提取蛋清酶溶菌酶的因素水平表 L9 ( 33 )
水平
蒸馏水添加量 (倍 ) ( 因素 A )
溶菌酶提取
溶菌酶提取第一篇：溶菌酶提取方法对比讲稿用 2.1 结晶法溶菌酶具有耐热、耐酸的特性，并且易溶解在盐溶液，稳定性好，通过改变盐溶液的条件，可使溶菌酶以晶体形式析出而得以分离，结晶法也因此成为制备溶菌酶晶体最为传统的方法之一。
该方法的主要过程可简述如下，向富含溶菌酶的蛋清中加入(NH4)2SO4等中性盐，依据溶菌酶的等电点区，用氢氧化钠调节蛋清溶液的 pH，再加入溶菌酶晶体进行诱导，4℃放置大概 2 周，即可析出大部分的溶菌酶晶体，而与其它杂蛋白质得以分离。
如要得到到更高纯度的溶菌酶，可将析出的溶菌酶晶体过滤，重新溶解，再利用上述同样的方法进行重结晶即可。
结晶法操作简单、成本低，是目前从蛋清中提取分离溶菌酶的首选方法，但它要求溶菌酶的含量要相对高，因此不适宜溶液中微量溶菌酶的分离。
此外，晶体的形成，蛋白质结晶既受到自身分子结构的影响，又受到结晶条件的影响，结晶过程中只要有细微的差别，晶体的产量和质量都将受到很大影响（结晶过程不好控制），所以蛋白质结晶是一个宏观看似简单而实际微观极为复杂的物理化学过程。
为进一步完善结晶法分离纯化溶菌酶，研发人员越来越重视膜结晶法的研究与应用。
相比于常规结晶方法，膜结晶法对蛋白质初始浓度要求低、结晶诱导时间较短、尤其是结晶过程可控，因而具有明显优势。
2.2 离子交换法离子交换法是借助溶液中各种蛋白质等粒子的带电差异，而与离子交换剂之间具有强弱不一的结合力，达到分离纯化物质的操作技术。
依据原料及分离纯化的不同要求，可分别选择羧甲基琼脂糖、羧酸纤维素和羧甲基纤维素等离子交换剂。
离子交换法操作简单，成本较低，可实现自动化连续操作，适用于大规模生产，是目前溶菌酶生产的常用方法。
（联用层析法因分离速度快、处理量大等优势而受到研发人员的广泛关注，包括膜亲和层析法、离子交换层析法等。
尤其是离子交换层析法 20 世纪 80 年代便开始广泛应用于溶菌酶地分离纯化。
此方法操作简便、成本低、高效、可实现自动化操作，是溶菌酶生产中的常用方法之一。
南师大蛋清中提取溶菌酶实验
蛋清中提取溶菌酶南京师范大学生命科学学院姓名：穆旭学号：09130333摘要：本实验通过离子交换层析提取蛋清中的溶菌酶，掌握静态和动态离子交换的方法；和从生物材料中提取活性蛋白质方法，并用超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶，掌握超滤分离技术的原理和操作。
并且用SDS-PAGE检测溶菌酶的纯度和含量，从而掌握SDS－PAGE的原理和操作。
关键词：溶菌酶，柱层析，离子交换树脂，超滤，盐析，SDS-PAGE研究材料与实验方法1.柱层析前的准备工作实验材料：树脂：724型阳离子交换树脂、层析柱：φ1.6cm×30cm、溶液：0.1M NaOH，0.1M HCl、其他材料：布氏漏斗，抽滤瓶，铁架台，恒流泵，核酸蛋白检测仪等。
1.1预处理724型阳离子交换树脂碱－酸－碱的方法（Na型），每次用0.1N NaOH或者0.1N HCl溶液（体积约为树脂的2—3倍）浸泡树脂10—15min后，都要用蒸馏水将碱液、酸液冲洗掉。
1.2装填离子交换层析柱（重力沉降法）固定层析柱，保持层析柱垂直；将蒸馏水倒入层析柱中，以排出管道中的空气，当蒸馏水高度约为层析柱高的一半时，将层析柱下端的塑料管夹紧；用玻璃棒将树脂搅拌均匀，倒入层析柱内，松开下端的塑料管，树脂自然沉降，最后保持蒸馏水面高于树脂表面约2cm。
1.3配制0.1M磷酸钠缓冲液pH7.0先配制 1M Na2HPO4 57.7mL，1M NaH2PO4 42.3mL将两者混合后稀释至1000mL，装于试剂瓶中。
1.4平衡离子交换树脂0.1M磷酸钠缓冲液恒速缓慢流经树脂，直至流出液的pH值与缓冲液相同，平衡结束。
2.柱层析法提取溶菌酶实验材料：起始缓冲液：0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.0）洗脱液：50mM NaCl溶液200mL（溶剂：起始缓冲液）、500mM NaCl溶液150mL （溶剂：起始缓冲液）再生溶液：0.5M NaOH溶液仪器：磁力搅拌器等其他材料：新鲜鸡蛋2.1样品的预处理取2个新鲜鸡蛋，在其一端敲一个小洞，收集蛋清，加入约其体积1.5倍的起始缓冲液，搅拌均匀，用4层纱布过滤除去不溶性物质，检查其pH值是否为7.0，否则用0.5M酸、碱调节。
鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化
四、实验材料和方法
四、实验材料和方法
1、实验材料：新鲜鸡蛋、磷酸缓冲液（PBS）、乙酸乙酯、正丁醇、蛋白酶 抑制剂、透析袋。
四、实验材料和方法
2、实验设备：高速离心机、真空泵、氮气仪、色谱柱。 3、实验方法： （1）鸡蛋卵清的收集：将新鲜鸡蛋打破，分离出卵黄和卵清， 收集卵清备用。 （2）粗提：将收集的卵清加入磷酸缓冲液（PBS），搅拌均匀 后进行高速离心，取上清液即为粗提液。 （3）沉淀：向粗提液中加入等体积的 乙酸乙酯，充分混合后静置分层，取下层沉淀。 （4）
鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与 纯化
目录
01 一、背景介绍
03 三、实验原理
02 二、研究目的 04 四、实验分析
07 参考内容
06 六、结论与展望
一、背景介绍
一、背景介绍
溶菌酶是一种广泛存在于生物体内的天然抗菌酶，具有抗菌、抗炎、抗病毒 等多种生物活性。近年来，随着人们对食品安全和药物研发的度不断提高，从天 然生物资源中提取和纯化溶菌酶成为了一个热门领域。鸡蛋卵清作为一种丰富的 天然资源，具有较高的溶菌酶含量，因此成为了提取和纯化溶菌酶的重要来源。 本次演示旨在探讨鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化方法，以期为相关领域的研究 提供参考。
四、实验材料和方法
复溶：将沉淀物真空干燥后，加入适量正丁醇溶解，再加入透析袋中透析去 除小分子杂质。 （5）色谱分离：将透析后的溶液通过色谱柱进行分离，收集流 出液，检测其中溶菌酶的纯度和含量。 （6）鉴定：采用光谱分析、分子量测定 等方法对纯化的溶菌酶进行鉴定。
五、实验结果及分析
五、实验结果及分析
二、研究方法与技术
1、材料与设备
1、材料与设备
本研究采用新鲜鸡蛋作为原料，使用离心机、分光光度计、电泳仪等设备进 行实验。
鸡蛋中溶菌酶的提取
鸡蛋中溶菌酶的提取This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020鸡蛋中溶菌酶的提取，纯化及纯度鉴定李莹姝蒋华云*（南京师范大学生命科学学院，南京 210046）摘要：从蛋清中用724弱酸性阳离子交换树脂提取溶菌酶，然后用硫酸铵溶液洗脱，盐析得到溶菌酶。
用葡聚糖凝胶层析（SephadexG-75）纯化溶菌酶，收集峰值处样品。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳鉴定个步骤留样及所得溶菌酶样品的纯度。
溶菌酶得率为100ml（kg）；葡聚糖凝胶层析过程纯化样品得到了洗脱峰曲线，但未能收集到峰值处样品；电泳结果显示在纯化过程中溶菌酶纯度不断升高。
本实验溶菌酶得率较低，提取工艺有待改进，需进一步减少样品损失；层析过程需进一步熟练掌握，以更好达到纯化效果。
关键词：溶菌酶；离子交换树脂，凝胶层析；SDS-PAGEExtraction, purification and purity of Egg lysozymeYings LiHuay Jiang*(College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China) Abstract:From egg white, with 724 weak acid cation exchange resin extraction of lysozyme, and then eluted with ammonium sulfate, salting to be lysozyme. With dextran gel chromatography (SephadexG-75) purified lysozyme, the peak of the sample collection. By SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) electrophoresis and identified steps to stay kind of purity of the samples from lysozyme. Lysozyme yield 100ml kg); dextran gel chromatography purified samples obtained during elution peak curve, but failed to collect samples at the peak; electrophoresis showed that the purification process of lysozyme enzyme purity rising. In this study, lysozyme was the low rate of extraction process could be improved, the need to further reduce sample losses; chromatography process needs further proficiency in order to better achieve purification.Key words:lysozyme, Ion exchange resin, Gel chromatography, SDS-PAGE 溶菌酶( Lysozyme , 1,4－β－N－溶菌酶) 是一种专门作用于革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的β-1,4- 糖苷键的水解酶, 因而又称为胞壁质酶或者N- 胞壁质聚糖水解酶。