鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定2012课件

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4.2 亲和色谱法
优点： 分离提纯的倍数较高，得到的溶菌酶纯度高，还能分离纯化经化学修饰 而失活的溶菌酶以及具活性的溶菌酶，亦能用于检测酶与底物相结合的 氨基酸残基。对于浓缩与精制微量的溶菌酶，区分天然溶菌酶和修饰酶， 或探索与底物结合的酶分子氨基酸残基状况等问题，这是很有效的方法。 缺点： 由于亲和吸附剂的制作较为复杂，成本高，而且操作难度大，限制了它 在工业上的大规模利用。
鸡蛋清溶菌酶的提取及电 泳鉴定
药学院 2010-12-19
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实验目的：
1 了解鸡蛋清溶菌酶的性质、常用制备方法及原理 2 掌握盐析法分离蛋白质原理及操作 3 掌握SDS-PAGE鉴定蛋白纯度的原理及操作
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4.4 超滤法
超滤法的早期应用主要是对溶菌酶的浓缩精制。它利用膜两侧的压力差， 使水分、盐类及糖类等小分子透过膜，而溶菌酶等蛋白质大分子物质留在 膜内不能透过，从而达到浓缩效果。它的优点是无相变、操作简单、操作 费用低、产品不易失活。 溶菌酶的分子量仅 14300，而蛋清中其它蛋白质的分子量则在 30000 以上， 因此可选择适当的分离膜，以超滤法滤出溶菌酶。而残留的大量蛋清则可 直接应用于食品加工。
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1 溶菌酶的性质
溶菌酶 (Lysozyme, EC 3.2.1.17) 由英国细菌学家弗莱明 (Fleming)在1922年在人的眼泪、唾液中发现的。
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我国的食品工业、精细化工业、医药工业对溶菌酶 具有较大的需求。我国于上世纪70年代采用离子交 换法生产溶菌酶。 目前国内有大连生化、天津东原、烟台金梓等厂家 生产，初步满足了国内科研及医药工业的需求。 进口溶菌酶，存在着价格较高，进口环节复杂等诸 多方面的限制。 国产溶菌酶工业刚刚起步，生产规模小，工业水平 落后，产品的质量与国际标准差距较大。存在提取 率低，处理量小和产品比活低等缺点。
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3 溶菌酶的生产现状及前景
上世纪50年代，国外开始了溶菌酶的工业化生产。 采用从鸡蛋清中直接结晶得溶菌酶，产品用来制作 口服药剂。 上世纪60年代，又开发了离子交换法，进一步降低 了生产成本，提高了产品质量，达到了注射级药品 质量要求。 上世纪70年代，开发了亲和色谱技术，主要用于高 纯度生化试剂的生产。 近来超滤法与其它方法相结合，进一步提高了溶菌 酶的生产工艺水平。
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4.3 离子交换法
离子交换法具有简便、高效、成本低且可自动化连续操作的优点，目前 大部分溶菌酶生产厂家都采用离子交换法。这种方法在实际应用中收率 较高，降低了生产成本。 要注意选择合适的离子交换介质。早期有 Amberlite IRC-50 树脂 ，724 树脂。目前采用Doulite C-464、磷酸纤维素（PC）、羧甲基纤维素 （CMC）和羧甲基琼脂糖（CMS）等离子交换剂，对溶菌酶都有较强 的吸附能力。
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鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是 目前了解最清楚的溶菌酶之一。
白色、无臭结晶粉末，味甜，易溶于水，遇碱易破 坏，不溶于丙酮、乙醚中。
其分子是由 129 个氨基酸残基排列构成的单一肽链， 有四对二硫键，分子量为14300。
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我国是世界上最大的产蛋国家，原料来源丰富，目 前鲜蛋基本作为初级食品食用，深加工不足。而发 达国家的鲜蛋加工业可以加工鲜蛋总产量的 40%。 1kg鸡蛋大约8元，提取出溶菌酶，可以得到3.5g， 溶菌酶纯品售价60 元/1g左右。因此，进行溶菌酶的 提取工艺研究，有着重大的科学意义和现实意义。
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2.5 科学研究中的应用 利用溶菌酶专一性地水解细胞壁的特点, 了解微生 物细胞壁的构造，分解细胞壁后制备原生质体，从 而用于微生物育种以及微生物分类等学术研究的领 域。
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4 溶菌酶的提取工艺
蛋清的组成成分 蛋清又称蛋白，是一种胶体物质，约占蛋重的 45%～ 60%，颜色为微黄色。 鸡蛋清实际分为四层，由外向内的结构是： 第一层为外稀薄层，贴附在蛋清膜上，占整个蛋清的 23.3%； 第二层为外浓厚层（亦称中层浓厚蛋白层），约 57.2%； 第三层为内稀薄层，约占 16.8%； 第四层为系带膜状层（亦称内浓厚层），为一薄层， 加上与之连为一体的两端系带，约占 2.7%。
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水分 蛋白质 碳水化合物 维生素和色素 灰分 脂质 酶
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2.2 酶工程上的应用 近年来，溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少 的工具酶，用以提取菌体内的活性物质如核酸、酶及 活性多肽等。
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4.1 直接结晶法
优点： 操作简单，原料便宜，设备投资小。最早应用于蛋清溶菌酶的工业生 产，使产品的成本大大降低，为其医药应用作出了贡献。 缺点： （1）生产周期长。 （2）由于蛋白质在其等电点不稳定，因此生产过程中溶菌酶易失活。 （3）由于存在溶解平衡，而使不少溶菌酶残留于母液。因此不能用 以分离微量的溶菌酶。 （4）收率低，活性低。 （5）处理后的蛋清难以再利用。此点导致溶菌酶成本大幅上升。
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4.5 反胶团萃取法
反胶团的主要应用是萃取蛋白质。目前研究使用最多的是阴离子表面活性 剂 AerosolOT(丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠，简称 AOT)。该表面活性剂价 廉易得，分子极性头小，有双链，形成反胶团时不必加入助表面活性剂， 形成的反胶团极性核大，有利于蛋白质分子的进入。 AOT/异辛烷/水体系是最常用的反胶团萃取体系，对于分离溶菌酶这类相 对较小的分子来说，具有较好的分离效果。但是对于分子量大于 30000的 蛋白质则不易分离。 1998 年，反胶团萃取法从蛋清中直接分离溶菌酶。在离心管中将蛋清稀释 液与等体积的有机相（AOT/异辛烷）混合，恒温水浴，高速摇动，混合50 分钟后，在 3000rpm 下离心 5 分钟。分离得上层即反胶团萃取液，加入等 体积的 pH11.8 磷酸盐缓冲液，震荡 45 分钟，进行反萃取。离心后，收集 下层水溶液，分析溶菌酶浓度，测定溶菌酶的酶活力。此法的溶菌酶回收 率达 90%，活性达73000u/mg，比大多数商业产品活性高。
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目前美国、加拿大、荷兰、法国、德国、丹麦、意 大利、日本等国家均生产溶菌酶，其产量与日俱增。 近年来，溶菌酶被用作天然防腐剂，极大的促进了 其市场需求，每年以10%的速率增长，现在市场规模 约为700吨。
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2.1 食品工业上的应用 选择性的分解微生物的细胞壁，而不能作用于其 它物质，主要应用于海产品、水产品、乳制品和 干酪的保鲜，低度酒、糕点及饮料的防腐，以及 水产熟制品及肉类熟制品的防腐保鲜。 加入到饮料中，如钙奶、乳酸饮料中, 也可起到防 蛀牙、爽口的作用。 为弥补奶粉的不足，可以向其中添加适量溶菌酶， 制成母乳化奶粉，可以加强婴幼儿的抗感染能力， 可以促进婴儿胃内乳酪蛋白形成细微凝乳，有利 于婴儿的消化吸收。特别对早产婴儿，有防止体 重减轻、预防消化器官疾病、增进体重等功效。
广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪液、 唾液、血浆、尿、乳汁、其它体液中及白细胞和组织 （如肝、肾）细胞内，而且部分植物、微生物中也含 有此酶。
人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活 力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为0.3%0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶 是从蛋清中提取的。
碱性球蛋白，碱性氨基酸残基及芳香族氨基酸如色 氨酸残基的比例很高。其等电点为 pH10.7；其最适 pH 值为 pH7 左右，最适温度为50℃。
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不规则的椭圆体，比较容易结晶，结晶形状随结晶 条件而异，有菱形八面体、正方形六面体及棒状结 晶等。用X射线衍射测得此酶的体积为45×30×30Ǻ。
2.3 发酵工业上的应用 溶菌酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的收率， 还可以大大缩短酵母膏的制备时间。 溶菌酶还可用于菌体内含物质的提取。
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2.4 医学上的应用 溶菌酶制备的口腔药片或漱口液 治疗副鼻窦炎、口腔溃疡、扁平苔藓和渗出性中耳 炎等疾病。 作口服剂可抑制流行性感冒和腺病毒的生长、抗感 染及抗炎症，还具有多种药理作用。 还具有一定的保健作用；有促进血液凝固和止血作 用；有组织再生和瘢痕形成促进作用等。