鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定2012

不规则的椭圆体，比较容易结晶，结晶形状随结晶 条件而异，有菱形八面体、正方形六面体及棒状结 晶等。用X射线衍射测得此酶的体积为45×30×30Ǻ。
性质非常稳定：当 pH 值在1.2-11.3 范围内剧烈变化 时，其结构几乎不变。 遇热也很稳定，pH 值 4-7、100℃处理1分钟仍保持 原酶活性；pH值 5.5、50℃加热 4 小时后，酶活不受 影响。但是，在碱性条件下，溶菌酶的热稳定性较 差，易变性。 热变性随着有机溶剂的增加而直线下降。
C 2 C1 C 2 C1 V V0 或V V0 100 C 2 1 C2
V0——蛋白质溶液的原始体积； C2——所要达到硫酸铵饱和度； C1——原来溶液的硫酸铵饱和度； V——应加入饱和硫酸铵溶液的体积。
固体硫酸铵法
所需达到的饱和度较高，而蛋白质溶液的体积又不能 再过分增大时，采用直接加入固体硫酸铵的方法。欲 达到某到饱和度可按下列公式计算出应加入固体硫酸 铵的数量：
5 溶菌酶活力的测定方法
典型作用底物是细胞壁粘多糖、甲壳素及糖苷。
溶菌酶的测定方法有两大类： （1）利用酶反应测定酶活性： 用对溶菌酶敏感的革兰氏阴性菌（主要是溶壁微球 菌）、甲壳素及其衍生物、人工合成的寡聚糖作为底 物。本类方法简便、灵敏，但影响溶菌酶活性的因素 很多，稳定性差。
比浊法 琼脂平板法 比色法 荧光强度及荧光偏振法
广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪液、 唾液、血浆、尿、乳汁、其它体液中及白细胞和组织 （如肝、肾）细胞内，而且部分植物、微生物中也含 有此酶。 人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活 力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为0.3%0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶 是从蛋清中提取的。
（2）非酶学测定法： 电泳法使用历史较长，测定的溶菌酶含量包括有活 性及失去活性的溶菌酶总量。 免疫法技术的发展而产生的。此类方法灵敏度高， 为定性也较好。但是这类方法需要制备抗体，实验 条件较酶学法复杂，因此大大限制了该类方法的应 用。
盐析法
1878年Hammarster首次使用，是粗分离蛋白质的重 要方法之一。 许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍 加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶” （Salting in）。 而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得 不深而自动析出，这种现象称为“盐析“（Salting out）。
4.3 离子交换法
离子交换法具有简便、高效、成本低且可自动化连续操作的优点，目前 大部分溶菌酶生产厂家都采用离子交换法。这种方法在实际应用中收率 较高，降低了生产成本。 要注意选择合适的离子交换介质。早期有 Amberlite IRC-50 树脂 ，724 树脂。目前采用Doulite C-464、磷酸纤维素（PC）、羧甲基纤维素 （CMC）和羧甲基琼脂糖（CMS）等离子交换剂，对溶菌酶都有较强 的吸附能力。
蛋清的组成成分 蛋清又称蛋白，是一种胶体物质，约占蛋重的 45%～ 60%，颜色为微黄色。 鸡蛋清实际分为四层，由外向内的结构是： 第一层为外稀薄层，贴附在蛋清膜上，占整个蛋清的 23.3%； 第二层为外浓厚层（亦称中层浓厚蛋白层），约 57.2%； 第三层为内稀薄层，约占 16.8%； 第四层为系带膜状层（亦称内浓厚层），为一薄层， 加上与之连为一体的两端系带，约占 2.7%。
医疗、食品防腐及生物工程中，特别是在食品防腐 方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有较好应 用价值。
2.1 食品工业上的应用 选择性的分解微生物的细胞壁，而不能作用于其 它物质，主要应用于海产品、水产品、乳制品和 干酪的保鲜，低度酒、糕点及饮料的防腐，以及 水产熟制品及肉类熟制品的防腐保鲜。 加入到饮料中，如钙奶、乳酸饮料中, 也可起到防 蛀牙、爽口的作用。 为弥补奶粉的不足，可以向其中添加适量溶菌酶， 制成母乳化奶粉，可以加强婴幼儿的抗感染能力， 可以促进婴儿胃内乳酪蛋白形成细微凝乳，有利 于婴儿的消化吸收。特别对早产婴儿，有防止体 重减轻、预防消化器官疾病、增进体重等功效。
鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是 目前了解最清楚的溶菌酶之一。 白色、无臭结晶粉末，味甜，易溶于水，遇碱易破 坏，不溶于丙酮、乙醚中。
其分子是由 129 个氨基酸残基排列构成的单一肽链， 有四对二硫键，分子量为14300。
碱性球蛋白，碱性氨基酸残基及芳香族氨基酸如色 氨酸残基的比例很高。其等电点为 pH10.7；其最适 pH 值为 pH7 左右，最适温度为50℃。
实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1。 盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或 1饱和度的百分之几，即称为为该蛋白盐析的饱和度。
饱和硫酸铵溶液法 在蛋白质溶液的总体不大，要求达到饱和度在 50%以 下时，可选用此方法。在已知盐析出某各蛋白质成分 所要过到饱和度时，可按下列公式计算出应加入饱和 硫酸铵溶液的数量：
G (C 2 C1 ) G (C 2 C 1 ) X 或X 100 AC2 1 AC2
X 是将1L饱和度为 C1 溶液提高到饱和度为 C2 时，需要加入固体硫酸铵的 重量（g）。G和A为常数，数值与温度有关。
现在已将达到各种饱和度所需固体硫酸铵的数量列成 表，使用时不需计算可直接从表中查出。
Hammarster用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋 白、球蛋白两部分。 硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等盐析蛋白质， 其中运用最广的是硫酸铵。
硫酸铵优点: 化学性质稳定； 溶解度大，25℃时能达到4.1mol/L的浓度； 溶解度的温度系数变化较小，在0~30℃范围内溶解度 变化不大，如25℃时饱和溶解度为4.12mol/L，即 767g/L，0℃时饱和溶解度为3.9mol/L，即676g/L; 价廉易得，分段效果比其他盐好，性质温和，即使浓 度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。
水分
蛋白质
碳水化合物 维生素和色素 灰分 脂质 酶
4.1 直接结晶法
优点： 操作简单，原料便宜，设备投资小。最早应用于蛋清溶菌酶的工业生 产，使产品的成本大大降低，为其医药应用作出了贡献。 缺点： （1）生产周期长。 （2）由于蛋白质在其等电点不稳定，因此生产过程中溶菌酶易失活。 （3）由于存在溶解平衡，而使不少溶菌酶残留于母液。因此不能用 以分离微量的溶菌酶。 （4）收率低，活性低。 （5）处理后的蛋清难以再利用。此点导致溶菌酶成本大幅上升。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法: 常用蛋白质纯度分析及分子量测定技术。
SDS:十二烷基硫酸钠（Sodium declecyl Sulfate）
破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的共 价键，使蛋白质变性而改变原来的空间构象，特别 是在强还原剂如巯基乙醇存在的条件下，由于蛋白 质分子内的二硫键被还原剂打开并不易再氧化，这 就保证了蛋白质分子与SDS结合从而形成带负电荷 的SDS-蛋白质复合物。
4.4 超滤法
超滤法的早期应用主要是对溶菌酶的浓缩精制。它利用膜两侧的压力差， 使水分、盐类及糖类等小分子透过膜，而溶菌酶等蛋白质大分子物质留在 膜内不能透过，从而达到浓缩效果。它的优点是无相变、操作简单、操作 费用低、产品不易失活。 溶菌酶的分子量仅 14300，而蛋清中其它蛋白质的分子量则在 30000 以上， 因此可选择适当的分离膜，以超滤法滤出溶菌酶。而残留的大量蛋清则可 直接应用于食品加工。
目前美国、加拿大、荷兰、法国、德国、丹麦、意 大利、日本等国家均生产溶菌酶，其产量与日俱增。 近年来，溶菌酶被用作天然防腐剂，极大的促进了 其市场需求，每年以10%的速率增长，现在市场规模 约为700吨。
我国的食品工业、精细化工业、医药工业对溶菌酶 具有较大的需求。我国于上世纪70年代采用离子交 换法生产溶菌酶。 目前国内有大连生化、天津东原、烟台金梓等厂家 生产，初步满足了国内科研及医药工业的需求。 进口溶菌酶，存在着价格较高，进口环节复杂等诸 多方面的限制。 国产溶菌酶工业刚刚起步，生产规模小，工业水平 落后，产品的质量与国际标准差距较大。存在提取 率低，处理量小和产品比活低等缺点。
鸡蛋清溶菌酶的提取及电 泳鉴定
药学院 2010-12-19
实验目的：
1 了解鸡蛋清溶菌酶的性质Baidu Nhomakorabea常用制备方法及原理
2 掌握盐析法分离蛋白质原理及操作
3 掌握SDS-PAGE鉴定蛋白纯度的原理及操作
1 溶菌酶的性质
溶菌酶 (Lysozyme, EC 3.2.1.17) 由英国细菌学家弗莱明 (Fleming)在1922年在人的眼泪、唾液中发现的。
4.2 亲和色谱法
优点： 分离提纯的倍数较高，得到的溶菌酶纯度高，还能分离纯化经化学修饰 而失活的溶菌酶以及具活性的溶菌酶，亦能用于检测酶与底物相结合的 氨基酸残基。对于浓缩与精制微量的溶菌酶，区分天然溶菌酶和修饰酶， 或探索与底物结合的酶分子氨基酸残基状况等问题，这是很有效的方法。
缺点： 由于亲和吸附剂的制作较为复杂，成本高，而且操作难度大，限制了它 在工业上的大规模利用。
溶菌酶对变性剂相对不敏感。在 6M 盐酸胍溶液中， 酶完全变性，但在8M尿素中则不变性。 吡啶、十二烷基磺酸钠等对酶有抑制作用，氧化剂 能使酶钝化。
2 溶菌酶的应用
水解N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间β-1，4糖苷， 破坏革兰氏阳性细菌细胞壁而具有溶菌作用，是一 种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁 溶解酶（Muramidase）。
我国是世界上最大的产蛋国家，原料来源丰富，目 前鲜蛋基本作为初级食品食用，深加工不足。而发 达国家的鲜蛋加工业可以加工鲜蛋总产量的 40%。 1kg鸡蛋大约8元，提取出溶菌酶，可以得到3.5g， 溶菌酶纯品售价60 元/1g左右。因此，进行溶菌酶的 提取工艺研究，有着重大的科学意义和现实意义。
4 溶菌酶的提取工艺
4.5 反胶团萃取法
反胶团的主要应用是萃取蛋白质。目前研究使用最多的是阴离子表面活性 剂 AerosolOT(丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠，简称 AOT)。该表面活性剂价 廉易得，分子极性头小，有双链，形成反胶团时不必加入助表面活性剂， 形成的反胶团极性核大，有利于蛋白质分子的进入。 AOT/异辛烷/水体系是最常用的反胶团萃取体系，对于分离溶菌酶这类相 对较小的分子来说，具有较好的分离效果。但是对于分子量大于 30000的 蛋白质则不易分离。 1998 年，反胶团萃取法从蛋清中直接分离溶菌酶。在离心管中将蛋清稀释 液与等体积的有机相（AOT/异辛烷）混合，恒温水浴，高速摇动，混合50 分钟后，在 3000rpm 下离心 5 分钟。分离得上层即反胶团萃取液，加入等 体积的 pH11.8 磷酸盐缓冲液，震荡 45 分钟，进行反萃取。离心后，收集 下层水溶液，分析溶菌酶浓度，测定溶菌酶的酶活力。此法的溶菌酶回收 率达 90%，活性达73000u/mg，比大多数商业产品活性高。
2.5 科学研究中的应用 利用溶菌酶专一性地水解细胞壁的特点, 了解微生 物细胞壁的构造，分解细胞壁后制备原生质体，从 而用于微生物育种以及微生物分类等学术研究的领 域。
3 溶菌酶的生产现状及前景
上世纪50年代，国外开始了溶菌酶的工业化生产。 采用从鸡蛋清中直接结晶得溶菌酶，产品用来制作 口服药剂。 上世纪60年代，又开发了离子交换法，进一步降低 了生产成本，提高了产品质量，达到了注射级药品 质量要求。 上世纪70年代，开发了亲和色谱技术，主要用于高 纯度生化试剂的生产。 近来超滤法与其它方法相结合，进一步提高了溶菌 酶的生产工艺水平。
2.2 酶工程上的应用 近年来，溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少 的工具酶，用以提取菌体内的活性物质如核酸、酶及 活性多肽等。
2.3 发酵工业上的应用 溶菌酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的收率， 还可以大大缩短酵母膏的制备时间。 溶菌酶还可用于菌体内含物质的提取。
2.4 医学上的应用 溶菌酶制备的口腔药片或漱口液 治疗副鼻窦炎、口腔溃疡、扁平苔藓和渗出性中耳 炎等疾病。 作口服剂可抑制流行性感冒和腺病毒的生长、抗感 染及抗炎症，还具有多种药理作用。 还具有一定的保健作用；有促进血液凝固和止血作 用；有组织再生和瘢痕形成促进作用等。