植物组织培养的一些注意事项

植物组织培养的一些注意事项一、常用培养基主要特性1、高盐成分培养基包括MS、LS、BL、BM、ER 等培养基;其中MS 培养基应用最广泛,其钾盐、铵盐及硝酸盐含量均较高, 微量元素种类齐全, 其养分数量及比例均比较合适, 广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养;LS、BM、ER 培养基由MS 培养基演变而来;2 、硝酸钾含量较高的培养基包括B5 、N6 、LH、GS 等培养基;①B5 培养基B5 培养基除含有较高的钾盐外, 还含有较低的铵态氮和较高的盐酸硫胺素, 较适合南洋杉、葡萄及豆科与十字花科植物等的培养;②N6 培养基N6 培养基朱至清等1975 系我国学者创造, 获国家发明二等奖, 适用于单子叶植物花药培养, 柑橘花药培养也适合, 在楸树、针叶树等的组织培养中使用效果也好;③SH 培养基是矿盐浓度较高的一种培养基, 其中铵与磷酸是由磷酸二氢铵NH4 H2 PO4 提供的, 这种培养基适合于某些单子叶及双子叶植物的培养;3 、中等无机盐含量的培养基①H 培养基本培养基大量元素约为MS 培养基的一半, 仅磷酸二氢钾及氯化钙稍低, 微量元素种类减少, 而含量较MS 为高, 维生素种类比MS 多;适于花药培养;②尼奇培养基Niotsch 1969 此培养基与H 培养基成分基本相同, 仅生物素比H 培养基高10 倍;也适合于花药培养;③米勒培养基Miller 1963 此培养基和Blaydes1966 培养基二者成分完全相同;适合大豆愈伤组织培养和花药等培养用;4 、低无机盐培养基大多情况下用于生根培养基;有以下几种:①改良怀特培养基White 1963②WS 培养基Wolter & Skoog 1966③克诺普液 Knop 1965 花卉培养上用得多;④贝尔什劳特液Berthelot 1934⑤HB 培养基 Holley & Baker 1963 此培养基在花卉脱毒培养和木本植物的茎尖培养中效果良好;其成分是大量元素比1/ 2 克诺普 Knop 液稍多, 微量元素用贝尔什劳特液, 每升培养基中加0 . 5ml;二、与培养基有关的一些细节问题1、培养基所用药品应采用等级较高的化学纯CP三级及分极纯AR二级 , 以免杂质对培养物造成不利影响;2、调节PH也可用精密pH试纸应在干燥器中保存, 以免吸湿而失效;培养基过酸的可用1mol/ L 氢氧化钠 NaOH 来调节; 培养基过碱的可用1mol/ L 盐酸 HCl 来调节 1mol/ L NaOH 的配制方法是称40gNaOH, 溶解后加入蒸馏水, 定容到1 000ml 即可;1mol/ L HCl 的配制方法是量取12mol/ L HCl 84ml , 加水定容至1 000ml;经高压蒸汽灭菌后, 由于某些成分的分解如蔗糖的分解或氧化, 酸度会增加 pH 值一般可降低0 . 2 ;有时玻璃器皿质量较差, 其中一部分物质溶解, 也会影响酸度的变化;这些在调整pH 值时都要考虑进去;分装后应立即灭菌, 若因故不能及时灭菌, 最好放入冰箱中在24h 内完成灭菌工作;灭菌时压力表读数为0 . 8kg/ cm2 ～1 . 1kg/ cm2 , 121℃时保持15min～20min 即可;3、某些生长调节物质, 如吲哚乙酸、玉米素及某些维生素等物质遇热不稳定, 因此不能进行高压灭菌, 而需用过滤方法灭菌, 经过滤灭菌的溶液, 可在琼脂培养基温度下降到大约40℃时加入到已高压灭菌的培养基中;4、配好的培养基可放到培养室中预培养3d ,若没有污染反应, 则证明是可靠的, 可以使用;暂时不用的培养基最好置于10℃下保存, 含有生长调节物质的培养基在4℃～5℃低温下保存则更理想;含吲哚乙酸或赤霉素的培养基应在配制一周内用完, 其他培养基至多也不能超过一个月;一般情况下, 两周内应用完, 以免干燥变质;三、培养材料及消毒1、取材季节的影响：大多数植物应在其生长开始的季节采样, 生长末期或已进入休眠期, 则外植体对诱导反应迟钝或无反应;2、器官的生理状态和发育年龄：沿植物的主轴, 越向上的部分所形成的器官其生长的时间越短, 其生理年龄也越老, 越接近发育上的成熟, 越易形成花器官;反之, 越向下,其生理年龄越小;木本植物的组织培养中, 以幼龄树的春梢嫩枝段或基部的萌条较好,下胚轴与具有3 对～4 对真叶的嫩茎段, 生长效果也较好 ;一般情况下, 幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力;3、材料大小的影响：材料越小成活率越低, 茎尖培养存活的临界大小应为一个茎尖分生组织带1 个～2 个叶原基, 约0 .2mm～0 .3mm 大小;叶片、花瓣等约为5mm2 , 茎段则长约0 .5mm;因此, 除非用于去除病毒否则不宜将外植体切的过小;但并不是说外植体越大越好, 外植体过大易造成污染, 有实验证明外植体越大污染率越高;4、材料的灭菌：一般是组织越大越易污染, 夏季比冬季带菌多,甚至不同年份污染的情况也有区别;取材最好选在中午或下午, 避开阴雨天取材可减少污染率;消毒是为了消灭病菌, 以保证无菌组织培养的进行;但不同植物及一株植物不同部位的组织, 其带菌程度不同, 它们对不同种类、不同浓度的消毒剂的敏感度也不一样;最初所使用的消毒剂种类, 浓度及消毒时间的长短都要进行摸索, 以达到最佳的消毒效果;材料有绒毛最好在消毒液中加入几滴吐温- 80 ,对与难消毒的根及地下部位材料可将其浸入消毒液中进行抽气减压, 以帮助消毒液的渗入, 从而达到彻底灭菌的目的;潘学峰等 1998 报道, 12% 的双氧水+ 0 .1%的升汞混合液对南方地下茎生姜灭菌10min 的效果最好;四、材料的接种1、接种室的消毒：植物组织培养技术实际上是一种无菌操作和无菌培养技术, 做好接种室的消毒是至关重要的;污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子, 因此, 每次接种前应进行地面的清洁卫生工作, 并用70%酒精喷雾使空气的灰尘沉降, 并用紫外线灯照射20min;接种前超净工作台面要用新洁尔灭或酒精擦洗,并定期清洗过滤膜, 以延长使用寿命;2、无菌操作要求：工作人员使用的工作服、帽子、口罩等, 要经常保持干净, 并定期进行消毒, 即将洗净、晾干的衣帽、口罩等用纸包好后与培养基一起进行高压灭菌;工作人员的头发、衣服、手指中都带有许多杂菌, 为此要穿上工作服, 戴上帽子, 也必须剪除指甲, 并用肥皂擦洗, 最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10min , 接种操作前则用70%酒精擦洗;工作人员的呼吸所产生的污染, 主要是在接种时谈话或咳嗽所引起的, 因此, 在操作时应禁止谈话并应戴上口罩;3、材料的分离、切取和接种切割动作要快, 防止挤压使材料受损伤而招致培养失败, 也要避免使用生锈的刀片, 以防止氧化现象产生;接种时要防止交叉污染的发生,刀和镊子等接种工具使用一次应放入70% 或95%酒精中浸泡, 然后灼烧放凉备用;接种时轻轻取下封口纸, 动作要慢以免气流冲入瓶中造成污染;将瓶口靠近酒精灯火焰, 瓶口倾斜, 以免空气中的微生物落入瓶中,将瓶口外部在灯焰上燎数秒钟, 将灰尘杂物等固定在原处, 然后用镊子将外植体送入瓶中, 材料在培养容器内的分布要均匀, 以保证必要的营养面积和光照条件;茎尖、茎段等基部插入固体培养基中, 叶片通常将叶背接触培养基, 这是由于叶背气孔多, 利于吸收水分和养分的缘故;五、材料的初代培养1、实验方案的设计1、单因子实验设计：单因子实验是组织培养中最常用的实验方法, 尤其在选择适当的激素种类和浓度配比上使用最多;2 、正交实验设计植物离体培养的成功是由多种因素决定的;正交设计是多因素分析的有力工具, 它可以很方便的从众多因素中选出主要影响因素及最佳水平, 因为它可以用较少的实验次数得到较多的信息;例如, 一个7 因素水平的实验, 若将各因素水平全部组合都做一遍, 需要27 = 128 次, 而正交设计只需做8 次实验就可以了, 虽然实验次数减少了, 但因为各因素水平搭配均匀, 8 次实验基本代表了全部实验的情况;正交实验的设计, 主要工具是正交表;大多数生物统计学书都列出了可供选择的正交表,如L4 23 , L827见表2 - 11 , 表2 - 12 ;字母L 右下角号码8 表示它有8 个实验要做,括号内的指数7 表示这张表所安排的实验最多可考察7 个因素也可安排2 个～6 个, 超过7 个要选择其他正交表 , 底数2 表示被考察的因素只要求两个水平;在进行实验前可根据要测试因素的多少及每种因素所考察的水平, 选择适合的正交表, 然后按表进行实验;现举一个例子来说明, 设影响某种植物试管苗生长的因素有光照时间、光照强度、pH 值、温度、蔗糖浓度、BA浓度、NAA 浓度7 个因素, 每个因素选择两个水平, 即, 光照时间 10h , 14h 、光照强度1000lx , 2000lx 、pH 值 5 . 5 , 5 . 8 、温度 20℃ , 25℃、BA 浓度 0 . 5 , 2 . 0 、NAA 浓度 0 . 5 ,1 . 0、蔗糖浓度2% , 4%;现根据因素和水平的多少选择一个适合本实验的正交表, 选L827最理想, 填表时, 因素水平对号入座, 见表 2 - 13 ;第一号实验是光照时间10h/ d、光照强度1000lx、pH 值5 . 5、BA 浓度2 .0、NAA 浓度0 . 5、蔗糖浓度4% , 其他实验依次类推;根据8 个实验结果, 如出苗数量、苗高、生根数、移栽成活率等, 综合考虑, 根据需要选取各最适培养条件;也可通过一定的计算方法参考统计学书 , 算出极差 R , 极差R 表示每个因素在实验中所起作用的大小, R 越大表示该因素的不同水平对实验结果的影响越大, 但若没有可计算的指标时, 还是选择单因子实验较好;2、初代培养物的建立1、保证无菌2、条件合适：首先, 一定要选择好合适的作物种类、品种及培养的部位; 其次,一定要选择合适的培养基, 激素及其他添加物; 还要注意掌握适宜的环境条件;所以在进行一种植物的组织培养之前, 应查找该种植物有关方面的资料, 根据这种植物过去所采用的培养部位、培养基、培养条件和培养技术等, 再决定自己的工作步骤;3、操作技术过关3、污染的防治1、植物材料的选择及防止污染通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多; 老的材料比幼嫩的材料带菌多; 田间生长的材料比温室生长的材料带菌多; 带泥土的材料比不带泥土的材料带菌多;为此对于培养材料的取材就应很认真地加以选择, 以减少污染的发生;用茎尖作外植体时, 应在室内或无菌条件下对枝条进行预培养;将枝条用水冲洗干净后插入无糖的营养液或自来水中, 使其发枝, 然后以这种新抽的嫩枝条作为外植体, 便可大大减少材料的污染;或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养, 待抽出徒长的黄化枝条时取材, 也可明显地减少污染;对木本植物等难以消毒的材料可采用多次灭菌法;如将切好的外植体放入1 . 3%次氯酸盐溶液中商品漂白粉25%的溶液消毒30min , 然后用无菌水冲洗3 次, 再放在无菌条件下,次日用2 . 6%次氯酸钠灭菌30min , 然后用无菌水冲洗3 次;也可采用多种药液多次浸泡法,以加强灭菌效果;材料内部易感染病菌, 在这种情况下, 必须在培养基中加入抗生素类, 防止初代培养物污染;2）、人为污染的防止接种前应用肥皂将手仔细洗净后, 再用70%酒精擦洗双手, 并需及时剪除指甲;在工作中特别要注意避免交叉感染, 双手必须清洁, 工具则用一次即需消毒一次;工作人员呼吸所产生的污染, 主要是接种时说话或咳嗽所引起的, 因此, 操作时严禁谈话, 并应戴上口罩, 也应穿工作服, 戴工作帽;污染中特别注意一种呈乳白色的细菌污染, 这种细胞为芽孢杆菌;法国林木育种协会鉴定为迟缓芽孢杆菌Bacillus lenlus , 它外被荚膜, 耐高温, 一般消毒剂难以杀死;它可随培养材料、用具等传播; 它可出现在培养基表面, 或呈滴形云雾状存在于培养基内;若出现应严格灭菌, 清洗用具, 更换消毒酒精;4、防止外植体褐变1、褐变的影响因素褐变是由于组织中的多酚氧化酶被激活, 使细胞的代谢发生变化, 酚类物质被氧化后产生醌类物质, 这类物质呈棕褐色, 它们会逐渐扩散到培养基中, 抑制其他酶的活性, 毒害培养的材料;褐变的影响因素是复杂的, 随植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同而危害的程度也有区别;材料本身的生理状态不同, 接种后褐变的程度也不同;如在欧洲栗的培养中, 用幼年型的材料培养含醌类物质少, 而用成年型材料培养时含醌类物质多;而在卡德利亚兰的培养中, 较短的新生茎致褐物质含量高, 而较长的新生茎致褐物质含量低, 另外致褐物质的含量也因季节的不同而不同, 冬季褐变少, 夏秋季褐变最严重, 存活率最低;在枝条上取芽的时期及所取部位不同也有区别, 如欧洲栗取1 月后半月的芽培养则醌的形成少, 而在5 月～6 月取芽培养则醌类物质发生严重;在第一至第四个芽的生长期单宁类物质合成多, 因此, 接种后褐变也严重;油棕用幼嫩外植体如胚培养较少褐变, 而用高度分化的叶片接种后则容易褐变;总之, 分生部位接种后形成的醌类物质少, 而分化的部位则形成的醌类物质较多;培养基成分过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化;例如油棕用MS无机盐培养基容易引起外植体的褐变, 而用降低了无机盐浓度的改良MS 培养基时则可减轻褐变, 而且可获得愈伤组织和胚状体;激素使用不当时, 材料也容易褐变;细胞分裂素6 - 苄基氨基嘌呤或激动素有刺激多酚氧化酶活性提高的作用, 这在甘蔗的组织培养中表现十分明显;在外植体最适宜的脱分化条件下, 分生能力强的细胞大量增殖, 酚类的氧化会受到抑制;在芽旺盛增殖时, 褐变也被抑制;此外, 培养条件不适宜, 如温度过高或光照过强, 均可使多酚氧化酶的活性提高, 从而加速被培养组织的褐变;培养时间过长接种后材料培养时间过长, 未及时转移, 也会引起材料的褐变, 甚至导致全部死亡, 这在培养过程中是经常可见的;2）、褐变的防止选择适当的外植体和培养条件：选择适当的外植体和培养条件是克服褐变的最主要的手段;外植体应有较强的分生能力, 在最适宜的细胞脱分化和再分化的培养条件下, 使外植体处于旺盛的生长状态, 便可大大减轻褐变;抗氧化剂的作用：在培养基中加入抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮 PVP、半胱氨酸等抗氧化剂, 或用抗氧化剂进行材料的预处理或预培养, 可减轻醌类物质的毒害;连续转移：对于易褐变的材料, 进行连续转移, 可以减轻醌类物质对培养物的毒害作用;六、试管苗的增殖与继代培养一、加快试管苗的繁殖速度1、试管苗繁殖类型试管繁殖类型共有五种：微型扦插型、丛生芽增殖型、器官发生型、胚状体发生型、原球茎发生型,一定要注意其遗传稳定性, 前三种途径一般能保持遗传稳定性;2、试管繁殖速率及计算统计试管苗增殖速度, 有以苗为单位, 也有以芽或未生根的小茎作单位的, 以原球茎球状体或胚状体因难以统计, 则以瓶为单位;大多数以芽和苗作单位;试管苗理论上一年能繁殖多少, 可用下面的简单公式计算:Y = mX nY = 年繁殖数m = 无菌母株苗数X = 每个培养周期增殖的倍数n = 全年可增殖的周期次数例如月季每5 周转接一次, 甲品种每次增殖3 倍, 乙品种每次增殖5 倍, 丙品种每次增殖7 倍, 假定一开始都是一个芽, 那么这三个品种一年能繁殖多少呢根据公式可知: n =365d/35d= 10 .4 , 即每年可转接10 次, 那么这三个品种年繁殖率分别计算如下: 甲品种Y = 1×31 0 = 59 000 = 5 .9×104乙品种Y = 1×51 0 = 9 760 000 = 9 .76×106丙品种Y = 1×71 0 = 282 000 000 = 2 .82×108从上可知甲品种每5 周转接一次, 一年可繁殖出5 万多苗, 乙品种每周期增殖5 倍, 一年可得900 多万苗, 而丙品种每周期增殖7 倍, 一年可繁殖出2 亿苗来;不过实际值远比理论值为低;因为实践中要受到多种因素制约, 困难很多;但理论计算可以作为一个计算产量的指标, 提供参考, 有它的积极意义;3、提高繁殖速度的方法不仅试管苗的繁殖类型不同, 而且在试管内又受到基因型、外植体来源、年龄、部位、培养基种类、附加成分和培养环境等多种因素的影响, 应通过具体试验来摸索每种植物最快最好的繁殖方法;1、改进培养基：、不同的植物材料需要使用不同类型的培养基;、糖具有维持培养基渗透压的作用,在培养过程中植物组织不断地从培养基中吸收糖,糖浓度降低,当糖浓度不能维持正常渗透压时,材料要转移到新鲜培养基;培养基中的维生素绝大部分为B族维生素,它们一各种辅酶的形式参与植物代谢活动,影响形态发生、分化及试管苗的生长,为防植物缺乏,一般均加入;、植物生长调节物质在试管苗增殖中期决定性作用A、促进叶芽形成和生长的激素：细胞分裂素抑制了植物的顶端优势,使得叶芽不断分化和生长,逐渐形成芽丛,并促进芽丛生长;大多植物最适用量为~,一般用量~;应用最多的是6-BA,其次KT和2ip,ZT用的较少,因它的价格太贵;对于微型扦插型繁殖可不加细胞分裂素或加以下也可;除了细胞分裂素以外,还可加入低浓度的生长素,以促进叶芽的生长,但要防止愈伤组织化;常用的有NAA,IBA,IAA,浓度在~;在实际操作中高浓度细胞分裂素和低浓度生长素的配比,既能提高腋芽的增殖速度,也能保证腋芽健壮生长;如果细胞分裂素浓度过高生长素浓度过低,会形成过于细密的嫩芽,虽然提高了增殖速度,但苗多而弱,降低了芽的质量;但如果细胞分裂素过低,生长素过高,影响芽的增殖速度,甚至有时没有侧芽产生;B、诱导不定芽形成和生长的激素：除现有的芽之外, 任何器官上的, 通过器官发生重新形成的芽称为不定芽;促进外植体形成不定芽, 要使用一定量的细胞分裂素和生长素, 一般浓度不能过高;否则不但使器官分化能力降低, 而且也使遗传性难以稳定;诱导外植体形成不定芽时, 一般使用细胞分裂素的浓度高于生长素浓度的配比, 但也经常采用细胞分裂素和生长素浓度的比值接近于1 的配比;C、促进胚状体的形成和繁殖的激素：胚状体途径的优点是增殖率高, 而且同时具有胚根和胚芽, 可免去生根;现在胚状体发生还不普遍或产生的胚状体难以成株或成株率太低, 以及遗传性尚不稳定, 故仅在有限植物中应用;一般是在含有丰富还原氮的培养基上, 加有生长素, 特别是2 , 4 - D 以诱导胚状体的发生, 然后转移到降低浓度或没有生长素的培养基上使其成熟、萌发和生长;培养基中, 还可加入其他附加成分, 如氨基酸、水解乳蛋白 LH 300mg/ L～500mg/ L、水解酪蛋白CH 200mg/ L～500mg/ L, 以及腺嘌呤ADE 1mg/ L～80mg/ L 等, 以促进试管苗的生长;2）、改善培养条件:试管苗增殖与培养条件如温度、光照、湿度、培养器皿和培养基的pH值密切相关, 需要进行控制, 以促进繁殖;七、保持试管苗的继代培养1、试管苗的继代方法1）、液体培养2）、固体培养2、影响试管苗继代培养的因素及解决措施1）、驯化现象：有些植物在开始的继代培养中需要添加生长调节物质, 其后加入少量或不必加入生长调节物质就可以生长, 此现象就叫做“驯化”;2）、在长期的继代培养中, 材料自身内部要发生一系列的生理变化, 除了前面讲的“驯化”现象外, 还会出现形态发生能力的丧失;一般认为分化能力衰退主要有三个因素:第一、愈伤组织中含有从外植体启动分裂时就包括进来的成器官中心分生组织,当重复继代则会逐渐减少或丧失,这意味着不能形成维管束,只能保持无组织的细胞团;第二、形态发生能力的减弱和丧失也可能与内源生长物质的减少或丧失有关;第三、也可能是细胞染色体出现畸变,数目增加或丢失;3、影响继代培养的其他因素1）、植物材料的影响不同种类植物,同种植物不同品种,同一植物不同器官或不同部位继代繁殖能力也不相同;一般是草本>木本；被子植物>裸子植物；年幼植物>老年植物；刚分离植物>已继代植物；胚>营养体植物；芽>胚状体>愈伤组织;2）、培养基及培养条件培养基及培养条件适当与否对能否继代培养影响颇大,故常改变培养基和培养条件来保持继代培养;3）、继代培养时间长短关于继代培养次数对繁殖率的影响的报道不一;有的材料长期继代可保持原来的再生能力；有的经过一定时间继代后才有分化再生能力；而有的随继代时间加长而分化再生能力降低;4）、季节的影响植物材料能否继代与季节有关;一般能达到每月继代3~10倍,即可用于大量繁殖,盲目追求过高增殖倍数一是所产小苗小而弱,给生根、移栽带来很大困难,二是会引起遗传性不稳定,造成灾难性后果;八、试管苗的生根与移栽（一）试管苗的生根1、试管内生根1）、根发生过程植物离体培养根的发生都来自不定根;根的形成从形成上可以分为两个阶段,即形成根源基和根源基的伸长及生长;前一阶段根源基的形成包括第一次、第二次细胞横分裂和第三次细胞纵分裂,细胞横分裂能够被生长素促进;根源基的启动和形成约历时48h,后一阶段为细胞快速伸长阶段,大约需24~48h;根源基的形成和生长素有关,根源基的伸长可以在没有外源生长素下实现;2）、影响试管内生根的因素（1）、植物材料不同植物、不同基因型、同一植株不同部位和不同年龄对分化根都有决定性因素;若试管里不生根不要完全从培养中去找原因,也应在取材时考虑;不同植物的一般生根规律是：木本比草本难,成年树比幼年树难,乔木比灌木难;（2）、基本培养基大多数使用低浓度的MS培养基,其中不少使用1/2MS或1/3MS培养基;+多可能不利于发根,生根需要P和K元素,但不宜太多；而Ca2+多数大量元素中有人认为NH4报道有利于根的形成于生长;微量元素对生根有利的是B和Fe;生根通常用1%~3%的蔗糖; （3）植物生长调节剂据报道单用一种生长素的占51..5%,生长素加激动素占%;a、愈伤组织分化根时使用NAA最多,浓度以~为多;使用IAA+激动素浓度范围以~和~居多;b、而胚轴、茎段、插枝、花梗等分化根时,使用IBA居首位,浓度以为多;可见生根培养多数使用。