植物组培过程中污染产生的原因及防治措施
植物组培污染的原因及防控要求
农家参谋农业研究-54-NONG JIA CAN MOU植物组培污染的原因及防控要求王鑫1闫佳2（1.河南林业职业学院，河南洛阳，471000；2.安阳市农作物良种试验示范站，河南安阳，455000）【摘 要】植物组培技术属于一门新兴技术，在科学研究及生产应用上的地位非常重要。
本文从材料带菌、实验操作和培养环境带来的污染等方面分析了植物组培污染的原因，提出了具体的防控要求。
【关键词】植物组培污染；原因；防控1 植物组培污染的原因植物组培污染，主要指组培的时候，由于培养的温度、湿度及营养条件等刚好符合微生物的生产需求，植物组织材料可能会在这个环节出现培养体系污染问题。
一般来说，植物组培污染都是在材料表面或者附近等部位，污染痕迹各不相同，是影响植物组培种苗是否能够成功的主要因素。
通常情况下，植物组培时，跟霉菌污染相比，细菌污染的比例更高一些，大约占百分之八十。
在细菌污染过程中，情况更为复杂的属于内生细菌污染。
产生污染的污染源比较多，有真菌、病毒，还有植物病原细菌等。
以真菌为例，真菌的来源是空气，当袍子在合适的环境中落下能够迅速的繁殖，从而对组培容器产生污染；以植物病原体细菌为例，一般分布在外植体的表面部门，也有分布在内部的，而病毒基本就是在植物内部，需要有传播载体，其中细菌污染最为严重。
1.1 材料带菌在植物组培污染中，一个不可避免的污染途径就是材料带菌，这跟生长环境及取样时间等都有关系，同时也跟外植体的消灭细菌的方法有一定的关联。
通过深入的分析可以发现，一般来说从一种外植体中分离出来的杂菌种类有数十种，在热带植物中表现的最为明显。
而随着植物材料年龄的增加，其健康度在减小，加剧了组培污染。
就内源菌污染来说，因为其污染的来源是外植体材料内部的微生物，一般的表面消毒是不能被消灭的，是随着材料带入从而产生危害。
1.2 实验操作和培养环境带来的污染这种污染的表现主要在四个方面：第一个方面，无菌室灭菌操作不到位，还有的是超净工作台滤出来的空气中带有细菌；第二个方面，培养基细菌消灭的不彻底；第三个方面，操作中可能导致的交叉污染；第四个方面，人员操作过程中可能产生的污染。
组织培养中产生污染的原因
植物组织培养中产生污染的原因1、外植体①年龄、种类和大小。
成年植株带菌多；生理年龄老的材料带菌多；杂菌和内生菌多的外植体、有病虫害的植株，均易污染；室外生长的材料带菌多；表面有泥土的材料、地下器官均带菌多；表面积大的材料比表面积小的材料带菌多[1-2]。
②取材时期和部位。
雨季菌类繁殖旺盛，此时材料带菌多；阳光最强时紫外线较强，杀菌效果好，此时材料带菌较少；选取了不清洁、生长不旺盛部位的材料带菌多。
③灭菌效果。
外植体灭菌是组织培养的关键，灭菌效果直接决定了组织培养的成败，灭菌方法和灭菌剂处理不当导致灭菌效果差，使外植体带菌。
2组织培养过程中各技术环节操作不规范①培养基。
使用长菌的母液配制培养基；培养基pH值高、添加的有机成分均可导致细菌污染；培养基分装好后没有及时封口或封口后没有立即灭菌；培养容器口没有封严导致灭菌后细菌和真菌孢子再次进入培养容器使培养基污染；封口用的塑料盖、封口膜长时间在日光灯照射下易老化、破裂，导致密封性差，不慎使用后可能导致培养基污染；橡皮筋长时间在日光灯照射下也易松动、断裂，杂菌可能趁机进入培养容器；灭菌方法不当导致培养基污染；灭菌时间过短导致培养基灭菌不彻底；灭菌时间达到后立即打开灭菌锅，导致容器内压力差过大，使外部杂菌有可能被倒吸入容器中；过滤较多溶液后，滤膜过滤效果较差，使过滤后的溶液有菌，加入培养基后造成污染。
②培养容器和接种器具。
培养容器不清洁；培养容器被污染后灭菌不彻底，再次使用时导致污染；高压灭菌锅或烘箱内培养容器、接种器具装得过满，影响灭菌效果；培养容器、接种器具灭菌时间过短导致灭菌不彻底；灭菌结束后立即打开高压灭菌锅或烘箱，强烈的冷热对流会导致冷空气被吸入包扎层内而重新造成污染带菌。
③接种人员。
过长指甲；双手未清洗干净；衣服和头发有很多灰尘，接种时不换拖鞋、接种服、帽子和口罩；不慎将已污染的培养材料拿入超净工作台，转接后再次污染；培养容器中接种的培养物过多；超净工作台上物品摆放过多、过高使气流被挡住，导致灭菌效果差；接种时说话或咳嗽会呼出大量细菌；操作时手超出工作台面；手接触培养容器边缘，放在器皿、接种器械上方致使微生物落入培养容器中；打开培养容器的塞子、盖或封口膜时空气进入带来灰尘；接种过程中器械被手或带菌材料污染后未经消毒，再次使用后又污染了材料；没有在超净工作台下风方向操作而使菌类随风飘落到容器中[3]；中途离开超净工作台后马上又继续接种，将培养基、器械等物品拿入超净工作台继续接种而带入灰尘，顺风飘入器皿。
浅谈植物组织培养中的污染问题与防治措施
浅谈植物组织培养中的污染问题与防治措施李建忠（广西职业技术学院农业技术工程系02应生班）摘要：植物组织培养过程中的每一个环节，都应该谨慎操作，否则随时都有可能造成污染从而影响到实验的成功与否和大规模生产的顺利进行。
污染通常是由于培养容器，操作器械和培养基的不干净或消毒灭菌不彻底；接种环境和培养环境不清洁；操作人员操作不慎以及培养材料消毒不过关或携带内生菌等因素引起的。
本文将针对以上几方面介绍相关的防治措施，来减少污染问题的发生。
关键词：组织培养，污染，防治措施，消毒灭菌。
植物组织培养过程中，污染问题是一个普遍存在的现象。
能否很好地解决污染问题，关系到实验的成功与否和大规模生产的顺利进行。
所谓污染是指在培养过程中由于外界真菌，细菌或培养材料的内生菌所侵染，而使培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。
污染来源主要分为外界污染和内部污染两种。
具体原因可分为：①培养容器、操作器械和培养基的不干净和消毒灭菌不彻底；②接种环境和培养环境不清洁；③操作不谨慎；④外植体消毒不过关；⑤培养材料携带内生菌。
针对以上污染源，现将各相关防治措施分别介绍如下：1． 培养容器、操作器械和培养基不干净与消毒灭菌不彻底1．1培养容器的清洗植物组织培养过程中，用于培养的容器有试管、三角瓶、培养瓶和培养箱等。
目前主要以培养瓶的使用为主。
对于培养瓶的洗法，根据桂林莱茵应用生物科技有限公司和加好生物工程有限公司的经验，先将瓶内的培养基去掉，然后置于淡洗衣粉水中浸泡一定时间，再在浓洗衣粉水中涮洗。
涮洗时要认真，瓶内瓶外都要涮洗到不能遗漏任何一处。
最后在流动的自来水下将残留的洗衣粉泡沫冲洗掉。
洗后的瓶子应明亮，内壁水膜均一，不挂水珠。
将洗干净的瓶子倒放在盘中或筐内，滤干水后，置于干净、明亮、干燥的地方备用。
需要注意的是，应将未污染的与污染的分开来洗。
先洗未污染的，再洗污染的。
并且分开放，以免造成交叉污染，而加重下一步的灭菌工作。
而对于瓶盖，也应严格的用洗衣粉水来认真涮洗，凉干后与瓶子一起存放备用。
植物组织培养中常见问题及解决办法
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二、传播途径
（1）户外风传播 菌类细小如尘 随风飘散，由上下落，见湿就长，有风就有 沙，有沙就有尘，有尘就有菌，菌尘混共存 （2）涡流传播 超净工作台上，摆放物品太多，当无菌风吹过时，就会在 物品周围形成涡流群，菌类就会在涡流群中停留。 （3 ）接种传播 脏手每只带有细菌4万~40万，干净的手，指甲盖大小也有 3200多个细菌。指甲缝可以窝藏30多种细菌。如果手上带菌 较多，在操作过程中，就难免有菌落入培养基或植物材料上， 而导致污染。
问题及解决办法
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第一节 组培污染及防治
一、污染来源
１、真菌：种类丰富，分布 广泛，繁殖快速，无处没有， 无处不在。 2、细菌 细菌是无孔不入的微生物， 为避免细菌的侵袭，科学家 曾尝试用抗微生物材料生产 各种用品，但效果不十分理 想，因为这些材料虽然能杀 死细菌，却充满了化学物质。
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四、污染原因判断及污染苗抢救
（1）若污染菌类是零星分散在培养基中，则可确定是人为引 起的污染。若是外植体，菌类从材料培养基以上部分长起，且发 生在5天以后，则说明是材料带的内生菌。若从培养基以下开始长 菌，发生时间较早，且有从里向外的趋势，则说明是切口引起的 污染。 （2）真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔 掉。但若是细菌污染，因此只要及时发现，将材料上部未感菌的 部分剪下转接，材料仍可以用。 （3）用抗生素等杀菌药剂的处理，会影响植物材料正常生长。
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门市店长 训练 Flash 网络动画 培 训 绩效 产业现况 分析 大学生 社一、褐化现象 外植体褐变是指在接种后，其表面开始变褐，有 时甚至会使整个培养基变褐的现象。它的出现是由于 植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发 变化所致。在褐 变过程中，会产 生醌类物质，它 们多呈棕褐色， 当扩散到培养基 后，就会抑制其 他酶的活性，从 而影响所接种外 门市店长 训练 Flash 网络动画 培 7 训 绩效 产业现况 分析 大学生 社 植体的培养。
组织培养中产生污染的原因
植物组织培养中产生污染的原因1、外植体①年龄、种类和大小。
成年植株带菌多；生理年龄老的材料带菌多；杂菌和内生菌多的外植体、有病虫害的植株，均易污染；室外生长的材料带菌多；表面有泥土的材料、地下器官均带菌多；表面积大的材料比表面积小的材料带菌多[1-2]。
②取材时期和部位。
雨季菌类繁殖旺盛，此时材料带菌多；阳光最强时紫外线较强，杀菌效果好，此时材料带菌较少；选取了不清洁、生长不旺盛部位的材料带菌多。
③灭菌效果。
外植体灭菌是组织培养的关键，灭菌效果直接决定了组织培养的成败，灭菌方法和灭菌剂处理不当导致灭菌效果差，使外植体带菌。
2组织培养过程中各技术环节操作不规范①培养基。
使用长菌的母液配制培养基；培养基pH值高、添加的有机成分均可导致细菌污染；培养基分装好后没有及时封口或封口后没有立即灭菌；培养容器口没有封严导致灭菌后细菌和真菌孢子再次进入培养容器使培养基污染；封口用的塑料盖、封口膜长时间在日光灯照射下易老化、破裂，导致密封性差，不慎使用后可能导致培养基污染；橡皮筋长时间在日光灯照射下也易松动、断裂，杂菌可能趁机进入培养容器；灭菌方法不当导致培养基污染；灭菌时间过短导致培养基灭菌不彻底；灭菌时间达到后立即打开灭菌锅，导致容器内压力差过大，使外部杂菌有可能被倒吸入容器中；过滤较多溶液后，滤膜过滤效果较差，使过滤后的溶液有菌，加入培养基后造成污染。
②培养容器和接种器具。
培养容器不清洁；培养容器被污染后灭菌不彻底，再次使用时导致污染；高压灭菌锅或烘箱内培养容器、接种器具装得过满，影响灭菌效果；培养容器、接种器具灭菌时间过短导致灭菌不彻底；灭菌结束后立即打开高压灭菌锅或烘箱，强烈的冷热对流会导致冷空气被吸入包扎层内而重新造成污染带菌。
③接种人员。
过长指甲；双手未清洗干净；衣服和头发有很多灰尘，接种时不换拖鞋、接种服、帽子和口罩；不慎将已污染的培养材料拿入超净工作台，转接后再次污染；培养容器中接种的培养物过多；超净工作台上物品摆放过多、过高使气流被挡住，导致灭菌效果差；接种时说话或咳嗽会呼出大量细菌；操作时手超出工作台面；手接触培养容器边缘，放在器皿、接种器械上方致使微生物落入培养容器中；打开培养容器的塞子、盖或封口膜时空气进入带来灰尘；接种过程中器械被手或带菌材料污染后未经消毒，再次使用后又污染了材料；没有在超净工作台下风方向操作而使菌类随风飘落到容器中[3]；中途离开超净工作台后马上又继续接种，将培养基、器械等物品拿入超净工作台继续接种而带入灰尘，顺风飘入器皿。
植物组织培养过程中的污染原因及控制措施
贵州农业科学2004,32(1):61~62Guizhou Agr icultur al Sciences新品种#新技术#新方法[文章编号]1001-3601(2004)01-0024-0061-02植物组织培养过程中的污染原因及控制措施赵佐敏,艾勇(贵州省安顺市农业科学研究所,安顺562109)Con tamin ation R eason an d its Control Measu re in Plan t Tissue CultureZHAO Zuo-min,AI Yong(Anshun Agricultural Institute,Anshun,Guizhou562109,China)[关键词]组织培养;控制污染[中图分类号]Q813.12[文献标识码]B根据笔者多年组培工作经验,将组培过程中可能出现的污染原因及控制措施总结如下。
1污染原因1.1培养材料带菌表现为接种后在外植体周围出现细菌、霉菌污染,可能原因是外植体消毒不彻底或外植体组织内部带有细菌、霉菌等杂菌。
1.2生产器具带菌生产器械、器皿带菌,包括镊子、剪刀、刀片、三角瓶、培养皿、封口膜等,超净台滤布不洁也会造成污染。
1.3培养基污染表现为接种前后培养基出现大量污染。
若菌落只存在于培养基表面且多为真菌时可能是由于瓶塞不严或扎[收稿日期]2003-09-23;2003-11-01修回[作者简介]赵佐敏(1967-),女,农艺师,从事园艺及生物技术研究。
贡献就越小。
结果表明,以双穗率最为重要,其对鲜食产量的影响最大,其次为行粒数,其余对产量贡献大小为:空秆率>出籽率>穗行数>株高>穗位高>千粒重。
株高、穗位高、千粒重3性状对产量的关联度虽然较小,但它们的作用发挥是通过其它性状表现的,对产量的影响也是不可忽视的。
2.2不同性状对产量的关联度不同,同一性状在不同品种中与产量的关联系数也不同从表2还可以看出:不同的性状对产量的关联度不同,同一性状在不同的品种中与产量的关联系数也不同。
植物组织培养的内生细菌污染问题
植物组织培养的内生细菌污染问题植物组织培养是研究植物发育、代谢和遗传的重要手段之一。
然而，由于组培外植物材料易受微生物污染，因此内生细菌对植物组织培养的影响逐渐受到了研究人员的关注。
内生细菌指的是存在于植物体内且无害或有益的细菌。
它们往往与植物形成共生关系，参与植物的养分吸收、有机物分解、植物生长和发育等生理过程中。
然而，在植物组织培养中，内生细菌也会存在污染问题。
1. 影响植物生长和发育内生细菌在植物组织培养中污染会导致植物生长发育不良，严重时可导致死亡。
例如，一些内生细菌会导致植物细胞分裂和分化受到抑制，导致植物无法正常生长。
内生细菌还可能影响植物的养分吸收和使用，引起叶片发黄、萎缩等症状。
2. 影响植物代谢内生细菌的存在会改变植物的代谢途径，导致植物代谢产物的类型和数量发生变化。
这些变化可能会对植物的生长发育和药用成分产生影响。
例如，内生细菌可能改变植物次生代谢产物的合成途径，导致药材中活性成分的含量发生变化。
3. 影响实验结果的准确性和可重复性内生细菌污染可能会引起实验结果的误差，降低实验的准确性和可重复性。
如果实验中使用的植物材料受到内生细菌污染，实验结果可能会受到内生细菌的干扰，从而导致结果的不确定性和无法复制性。
1. 消毒试管、培养基和器具对需要使用的试管、培养基和器具进行充分的消毒处理，防止细菌污染。
消毒的方法可以选择热处理、化学消毒和紫外线消毒等。
2. 选择无内生细菌的植物材料在进行组织培养实验时应选择没有内生细菌的植物材料，以尽量避免内生细菌污染。
如果需要使用含内生细菌的植物材料，应该进行合适的处理，如洗涤、消毒和筛选等。
3. 建立污染检测体系建立污染检测体系，及时发现和去除污染物。
可以使用常规的菌落计数法检测细菌污染量，或者使用PCR技术检测特定的内生细菌存在情况。
总之，内生细菌污染是植物组织培养中的一个重要问题，需要研究人员重视并采取合适的措施进行预防和处理。
只有保证组织培养环境的卫生和无菌，才能保证实验结果的准确性和可重复性。
植物组织培养中常见的问题及防治措施
植物组织培养中常见的问题及防治措施1微生物污染问题1.1造成污染的原因（1）外植体材料本身带菌；（2）接种过程中接种工具灭菌不彻底或者交叉污染；（3）培养基灭菌不彻底。
1.2防治措施（1）外植体灭菌要彻底。
首先可以选择组织内部无菌材料；其次根据不同的材料选择不同的消毒剂和消毒时间；第三外植体消毒要细心，比如茎段消毒，经过消毒处理后，要把两端切去约0.5cm，这样就可以大大减少污染的概率。
（2）严格遵守无菌操作规程。
操作人员在进入接种室前一定要洗手，然后换上接种服，带上口罩，操作之前先用75%的酒精擦拭双手，接种工具要经常灼烧一保证不会带菌或者交叉污染。
（3）加抗生素。
在培养基中适当的加入抗生素可以有效防止污染。
（4）无菌培养环境。
培养室内要定期进行灭菌，可在室内装紫外灯，或者用高锰酸钾和甲醛熏蒸，或者利用其它的熏蒸剂进行灭菌。
（5）控制外植体的接种数量。
每个培养瓶中尽量接种少量的外植体。
（6）及时继代培养。
定期检查组培苗的生长情况，发现有污染苗头的组培苗及时转接到新鲜培养基上。
2褐变问题2.1影响褐变的因素（1）外植体材料的基因型；（2）外植体的生理状态；（3）培养基成分。
2.2防治措施（1）选择适当的外植体。
选择处于旺盛生长状态的外植体，对于容易褐变的植物注意对其不同品系的基因型进行筛选，选择褐变率较低的材料作为外植体。
（2）在培养基中加入还原性物质或者吸附剂。
在培养基中加入偏二亚硫酸钠、抗坏血酸、柠檬酸等抗氧化剂；或者加入0.1-1%的活性炭吸附培养物在生长过程中分泌的酚类、醌类物质，但是要注意活性炭也可以吸收培养基中的激素使之浓度降低。
（3）对培养材料进行预处理。
用抗氧化剂溶液进行预处理或者在接种前用无菌水洗净切口渗出的酚类物质。
（4）适当的培养条件。
在培养初期保持较低温度（15-20℃），可以降低PPO活性，防止酚类物质氧化，减轻褐变。
（5）其他措施，培养初期进行连续转接。
3玻璃化问题3.1影响玻璃化的因素（1）外植体材料；（2）培养的环境条件；（3）培养基成分，琼脂的浓度、碳源的种类及含量等；（5）封口材料。
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植物组培过程中污染产生的原因及防治措施
1 污染的原因
污染是指在培养过程中，培养基或培养材料上滋生真菌、细菌等微生物，使培养材料不能正常生长和发育的现象。
组织培养中污染是经常发生的，常见的污染病原是细菌和真菌两大类。
细菌污染常在接种1-2d后表现，培养基表面出现黏液状菌斑。
真菌污染一般在接种后3d以后才表现，主要症状时培养基上出现绒毛状菌丝，然后形成不同颜色的孢子层。
造成污染的原因也很多，主要有
(1) 培养基及各种使用器具灭菌不彻底
(2) 外植体消毒不彻底
(3) 接种时不严格无菌操作
(4) 接种和培养环境不清洁
(5) 培养容器原因，包括盖子和封口膜等。
材料带菌或培养基灭菌不彻底会造成成批接种材料被细菌污染，操作人员不严格遵守无菌操作规程也是造成细菌污染的重要原因。
培养环境不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养容器的口径过大以及
封口膜破损等主要引起真菌污染。
2 污染的预防措施
2.1灭菌要彻底
在组培生产中，各种培养基以及接种过程中使用的各种器具都要严格灭菌。
首先是培养基的灭菌，耐高温的培养基需要在121-123℃条件下灭菌20-30min。
若出现灭菌时间不足或温度不够，培养一段时间后就会在培养基表面产生细菌性的污染。
一些不耐高温的物质，可采取细菌过滤器除去其中的微生物。
其次，接种用的器具除了经过高温霉菌外，在接种的过程中，每使用1次后，都要蘸酒精在酒精灯火焰上灼烧灭菌，特别是在不慎接触到污染物时，极易由于器具引起污染。
第三，对于被污染的培养瓶和器皿要单独浸泡，单独清洗，有条件的灭菌后再清洗。
2.2选择适当的外植体
要认真地选择外植体，减少外植体上的带菌量。
一般多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多；老的材料比幼嫩的材料带菌多；田间生长的材料比温室生长的材料带菌多；带泥土的材料比不带泥土的材料带菌多。
用茎尖作外植体时，应在室内或无菌条件下对枝条进行预培养。
将枝条用水冲洗干净后插入无糖的
营养液或自来水中，使其发枝。
然后以这种新抽的嫩枝作为外植体，可大大减少材料的污染。
或在无菌条件下对才采自田间的枝条进行暗培养，从抽出的徒长黄化枝条上取材，也可明显地减少污染。
2.3外植体消毒
外植体上可能附着外生菌和内生菌。
外生菌可以通过表面消毒方法杀灭；而内生菌生长的植物材料内部，表面消毒难以杀灭，培养一段时间后，病原菌自伤口处滋生。
防治内生菌首先将欲取材的植株或枝条放在温室或无菌培养室内预培养，再在培养液中添加一些抗生素或消毒剂。
2.4环境消毒
不清洁的环境也会使培养的污染率明显增加，尤其是在夏季，高温高湿条件下污染率更高。
接种和培养环境要保持清洁，定期进行熏蒸或喷雾消毒。
高锰酸钾和甲醛熏蒸效果好，但对人体有一定的伤害，一般每年熏蒸2-3次。
平时读接种室和培养室可采用紫外线照射消毒或喷2%来苏尔消毒。
臭氧消毒机对环境消毒效果较好，而且使用灵活方便，对人体的伤害也相对较小。
2.5严格无菌操作
在接种时要严格无菌操作，避免人为因素造成污染。
为了使超净工作台有效工作，防止操作区域本身带菌，要定期读一过滤器进行清洗和更换。
对内部的过滤器，不必经常更换，但每隔一定时间要检测操作区的带菌量，如果发现过滤器失败，则要整块更换。
此外还需要测定操作区的风速，通过调压旋钮使操作区的风速达到无菌操作需要的20-30m/min。