免疫电泳技术
临床免疫学免疫电泳技术
第七章免疫电泳技术本章考点1.概述2.免疫电泳技术3.应用免疫电泳技术是根据抗原及抗体反应的高度特异性，电泳技术的高分辨力和具有微量、快速的特点，将凝胶内电泳与免疫扩散相结合的一项免疫学技术。
第一节基本原理一、原理免疫电泳技术实质上是在直流电场作用下的凝胶扩散试验。
它的原理是将凝胶扩散置于直流电场中，在一定的条件下，抗原及抗体离解成为带正电或负电的电子，在电场中向异相电荷的电极移动，所带净电荷量越多、颗粒越小，泳动速度越快，反之则慢。
由于电流加速了抗原、抗体的运行速度，缩短了两者结合的时间，加快了沉淀现象的产生。
当有多种带电荷的物质电泳时，由于静电荷不同，而区分成不同区带，使抗原决定簇不同的成分得以区分。
影响因素有：①电场强度；②溶液pH；③离子强度；④电渗等。
二、电解质和蛋白质的电离特性、电泳迁移率、电渗蛋白质的基本单位是氨基酸，在水溶液中具有两性电离特性，当缓冲液pH与蛋白质等电点（PI）相当时呈电中性，无电泳迁移性；缓冲液pH大于蛋白质等电点（PI）时带正电荷，向阴极端移动；缓冲液pH小于蛋白质等电点（PI）时带负电荷，向阳极端移动。
在同一电场条件下，各种带电粒子在单位时间内的移动距离称电泳迁移率。
在电场中液体对固体可出现相对移动，产生电渗现象。
电渗不影响蛋白质的分离，但影响其原点位置。
影响因素有：①电场强度；②溶液pH；③离子强度；④电渗。
三、常用载体有琼脂和琼脂糖凝胶。
其特点是提高了敏感性及反应速度，并可将带电性不同的组分区分开。
第二节常用技术免疫电泳常用技术有：1.对流免疫电泳：对流免疫电泳原理是将双向扩散试验与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。
在琼脂板上打两排孔，左侧各加入待测抗原，右侧孔内加入相应抗体，抗原在阴极侧，抗体在阳极侧。
通电后，在pH8.4缓冲液中带负电荷的蛋白质抗原泳向阳极抗体侧，而抗体借电渗作用流向阴极侧，在两者之间或抗体侧形成沉淀线。
本法敏感度比双向扩散试验高8～16倍。
对流免疫电泳的原理
对流免疫电泳的原理
流免疫电泳（immunoelectrophoresis）是一种将免疫反应与电泳结合起来的方法，用于检测和定量分析特定抗原或抗体的存在和浓度。
其原理包括以下步骤：
1. 样品制备：将待测样品中的抗原或抗体进行提取和纯化。
2. 准备电泳板：将琼脂糖凝胶块放置在电泳板上，形成一条凹槽。
在凹槽两侧分别插入两个电极。
3. 样品加载：在凹槽中将待测样品和免疫球蛋白（常常是抗体）混合，形成样品准备。
4. 电泳：将电泳板放置在含有适当缓冲液的电泳槽中，通电使得样品准备在凝胶上进行电泳运动。
根据样品带电性质的不同，抗原和抗体会在电场作用下向正或负极运动。
5. 免疫沟槽：当样品准备在电场作用下运动时，抗原和抗体会形成一定的沟槽，其中抗原移动的远一侧为阳极端，抗体移动的远一侧为阴极端。
6. 静置：在电泳完成后，允许抗原和抗体在凝胶中进行免疫反应。
抗原与抗体之间的特异性结合会形成可见的免疫沉淀线。
7. 结果解读：根据免疫沉淀线的形状、长度和强度，可以判断待测样品中特定抗原或抗体的存在和相对浓度。
总的来说，流免疫电泳的原理是在电泳过程中，利用抗原与抗体之间的特异性结合作用使其在电场作用下形成免疫沉淀线，并通过观察和解读沉淀线的特征来进行分析和定量。
免疫电泳技术课件
（2）激光滤板：能选择性地透过紫外线可 见波长的光域，以激发荧光色素。激发滤 光片有两种，UG为紫外光滤片，只允许波 长275－400nm的紫外光通过，最大透光度 在365nm。BG为蓝紫外光滤片，只允许波长 325－500nm的蓝紫外光通过，最大透光度一组阻挡滤光片 又称吸收滤光片或抑制滤光片，其作用是阻断激发 光而使发射的荧光透过，使标本在暗的背景上呈现 荧光易于观察，也使眼睛免受强激发光刺激。吸收 滤光片的透光范围为410－650nm，代号有OG（橙 黄色）和GG（淡绿黄色）两种。
以此可作细微的蛋白质组分分析。根据各蛋白 所处的电泳位臵，将沉淀弧的位臵、形态与已知标 准抗原、抗体生成的沉淀弧进行比较，可分析待测 样品中所含成分的种类及性质、例如，多发性骨髓 瘤患者血清在免疫电泳后，可观察到异常的M蛋白 沉淀弧，而其他类型的免疫球蛋白形成的沉淀弧可 明显细、短于对照沉淀弧（图7－4）。
４.藻红蛋白（R-RE）是红藻和绿藻中一类被称为 藻蛋白（phycoblliprotein）家族中的一员，与 光合作用有关。其分子量为240000。其最强吸收 光波长为565nm，最大发射光波长为578nm。它在 488nm处的光吸收率为565nm处（最大的）的75％。 因此R-RE可以有效地与FITC一起用于双色免疫荧 光染色，因为它们可以共用488nm激发光。
第七章 免疫电泳技术
对流免疫电泳 （counter immunoelectrophoresis,CIEP）,原 理是将双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免 疫扩散技术，其在pH8.4以上的缓冲液中，大部分 蛋白质抗原成分带负电，在电场中向正极移动；而 作为抗体的IgG因其分子量大，暴露的极性基因较少， 解离也少，在电场中亦向正极缓慢移动，但电渗引 向负极移动的液流速度超过了lgG向正极的移动，带 动抗体移向负极,在抗原抗体最适比处形成乳白色沉 淀线，这就是电渗所致的IgG呈反向负极倒退。
免疫电泳技术精品PPT课件
用途：定量抗原 优点：快 缺点：影响因素多，不常用
三）免疫电泳
（immunoelectrophoresis，IEP）
即：电泳后进行双相琼脂扩散 实验
用途：定性实验，主要用于纯 化抗原和抗体成分的分析及正 常和异常免疫球蛋白的识别和 鉴定。
四）免疫固定电泳
（immunofixation electrophoresis）
即：区带电泳+沉淀反应
用途：常用于M蛋白的鉴定与分型
学习总结
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
You Know, The More Powerful You Will Be
免疫电泳技术
Immunoelectrophoresis technique
一、基本原理 二、类型 一）对流免疫电泳
（counter immunoelectrophoresis，CIEP）
即双扩+电泳技术 用途：同双扩 优点：快、敏感性高 缺点：分辨力低
二）火箭免resis，RIE）
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End 演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
免疫学实验 对流免疫电泳
1
Ab
2 Ag
3
Ab：甲胎蛋白诊断血清 Ag：1、肝癌病人血清（阳性对照）
2、正常人血清（阴性对照） 3、待测血清
电泳
• 将加好样品的板置于电泳槽上，抗原孔置 负极端，抗体孔置正极端。琼脂板两端分 别用四层纱布与0.05mol/L、PH8.6的缓 冲液相连，接通电源。电流以玻片的宽度 计算，为4mA/cm；电压以玻片的长度计 算，为6V/cm；通电30-60min后，切断 电源，观察结果
实验二 对流免疫电泳
一、实验目的 1.掌握对流免疫电泳的原理。 2.掌握对流免疫电泳检测待测抗原的方法。
二、实验原理
• 对流免疫电泳实质上是定向加速的双向免 疫扩散技术。
• 在pH8.6的缓冲液中，蛋白质抗原带负电 荷向正极泳动；而抗体大部分属于Ig，由 于分子量大，暴露的极性基团较少，在离 子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影 响向负极泳动，在抗原抗体相遇的最适比 例处形成乳白色沉淀线。
四、实验步骤
• 琼脂糖凝胶板的制备 • 打孔、加样 • 电泳 • 结果观察 • 影响结果的因素
制板、加样、打孔
• 用吸管吸取4ml加热溶化的琼脂铺在载玻片 上,待凝。
• 打孔:用打孔器在琼脂板上打孔(孔距4mm), 如图。
• 加样:将待测抗原样品约10ul加在阴极侧孔 内,抗血清加在阳极侧,加样时应加满小孔但 不能溢出
五、结果和讨论
• 将玻片对着光，先观察AFP阳性血清孔与 抗体孔之间的白色沉淀线，然后再观察待 检血清孔与抗体孔之间是否也有沉淀线出 现，如有沉淀线，则表示AFP试验阳性， 否则AFP试验为阴性。如沉淀线不清晰， 可把琼脂板放在湿盒中37℃数小时或置电 泳槽过夜再观察。
甲胎蛋白检测意义：
免疫电泳技术
第二章免疫电泳技术（Immunoelectrophoresis technique）一、基本概况（一）原理蛋白质是一种两性电解质,它同时具有游离氨基和羧基。
每种蛋白质都有它自己的等电点。
等电点的高低取决于蛋白质的性质，在等电点时，蛋白质所带的正负电荷相等。
在pH大于等电点溶液中，羧基解离多，此时蛋白质带负电荷，带负电荷的蛋白质在电场中向正极移动。
反之，在pH小于等电点的溶液中，氨基解离多，此时蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动。
这种带电质点在电场中向着带异相电荷的电场移动，称为电泳。
带电质点所以能在电场中移动以及具有一定的移动速度，取决于其本身所带的电荷、电场强度、溶液的pH值、粘度以及电渗等因素。
（二）影响电泳的因素不同带电质点在同一电场中的迁移率（或泳动度）不同，影响迁移率的因素有：①带电质点的性质：即颗粒所带净电荷的量，颗粒大小及形状等。
带电荷越多，分子越小，泳动速度越快；②电场强度：电场强度是单位厘米的电位差。
电场强度越大，带电质点泳动速度越快。
反之亦然；③溶液中pH值：溶液的pH值决定了带电质点的解离程度，也决定了物质所带电荷的多少。
对蛋白质、氨基酸等两性电解质而言，pH值离等电点越远，颗粒所带的电荷越多，电泳速度也越快。
反之则越慢。
蛋白质在酸性溶液中易变性，在偏碱溶液中比较稳定，所以蛋白质电泳大多用pH8.2～8.8的巴比妥或硼酸缓冲液，在这种pH中，血清蛋白一般都带负电荷；④溶液的离子强度：溶液的离子强度越高，颗粒泳动速度越慢，反之越快。
血清电泳一般最适宜离子强度在0.025～0.075之间。
离子强度越低，缓冲液的电流下降，扩散现象严重，使分辨力明显降低。
离子强度太高，将有大量的电流通过琼脂板，由此而产生的热量使板中水分大量蒸发，严重时可使琼脂板断裂而导致电泳中断。
溶液中离子强度与溶液的浓度成正比。
μ=1/2∑CZ2(μ为离子强度，C为克分子浓度，Z为离子的价数)；⑤电渗作用：电渗是在电场中液体对于固体支持物的相对移动。
免疫固定电泳分型
免疫固定电泳分型免疫固定电泳分型是一种用于分析蛋白质的分离技术，它基于免疫学原理，通过电泳的方式对蛋白质进行分型。
在免疫固定电泳分型中，主要利用了抗体和特定抗原之间的特异性结合来实现蛋白质的分离和检测。
免疫固定电泳分型的步骤主要包括样品制备、凝胶电泳、固定和染色等。
首先，需要将待分析的样品经过处理和制备，使其适合进行电泳分离。
然后，将样品注入到凝胶中，并施加电场使蛋白质在凝胶中进行分离。
在分离过程中，蛋白质会根据其分子量和电荷等特性在凝胶中分离成不同的带状条带。
在固定步骤中，需要将蛋白质固定在凝胶上，以便下一步的染色和检测。
通常使用的固定剂有乙醛和二甲基亚硫酸钠等。
其中，乙醛固定可以使蛋白质与凝胶交联，而二甲基亚硫酸钠固定则是通过与蛋白质中的氨基酸残基发生反应来实现。
完成固定后，需要对凝胶进行染色以可视化蛋白质分离的结果。
染色方法可以根据需要选择，常见的染色方法有银染色、共染色和荧光染色等。
其中，银染色是一种常用的染色方法，它能够使蛋白质在凝胶上呈现出黑色或棕色的带状条带。
免疫固定电泳分型可以应用于多个领域，特别是在生物医学研究和临床诊断中具有重要意义。
例如，通过对人体血清中的蛋白质进行免疫固定电泳分型，可以帮助鉴定疾病相关的蛋白质异常。
此外，在研究蛋白质结构和功能等方面也可以应用免疫固定电泳分型技术。
免疫固定电泳分型是一种常用的蛋白质分离和检测技术。
它通过利用抗体和特定抗原之间的结合来实现对蛋白质的分型。
该技术在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用前景，为疾病的诊断和治疗提供了重要的帮助。
希望通过本文的介绍，读者能够对免疫固定电泳分型有更深入的理解。
免疫固定电泳报告解读
免疫固定电泳报告解读免疫固定电泳是一种用于检测蛋白质的方法，通过固定在凝胶上的蛋白质与抗体的结合来实现特定蛋白质的分离和定量。
本报告将对免疫固定电泳的原理、方法和应用进行解读，并分析其在科研和临床中的意义。
**一、免疫固定电泳的原理**免疫固定电泳的原理基于蛋白质与抗体之间的特异性结合。
待测样品中的蛋白质会在凝胶上进行电泳分离，然后凝胶会被特定的抗体处理从而固定住其中的蛋白质。
接着，使用标记有荧光物质或酶的二抗或其他探针来检测特定抗体/蛋白质的存在与否。
这样，就可以通过检测荧光强度或酶活性来分析蛋白质的含量和定量。
**二、免疫固定电泳的方法**1. 样品制备：待测样品需要经过适当的处理，如离心、裂解等，以获取纯净的蛋白质溶液。
2. 电泳分离：将处理后的样品加载到凝胶上进行电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷特性来选择合适的凝胶类型和电泳条件。
3. 免疫固定：将电泳分离后的蛋白质固定在凝胶上，可以使用特定的抗体或亲和素等物质来固定。
4. 探针检测：使用二抗或其他荧光物质或酶来检测特定抗体/蛋白质的存在与否，并进行定量分析。
**三、免疫固定电泳的应用**1. 蛋白质定性与定量：免疫固定电泳可以用于对待测样品中的蛋白质进行分析，通过定位和定量特定的蛋白质得到关于其在生理或病理状态下的变化信息。
2. 免疫印迹：该技术可以用于检测特定抗体和抗原之间的结合情况，从而进行免疫印迹及相关实验。
3. 药理学研究：免疫固定电泳可以用于评估药物对蛋白质表达和/或结构的影响，有助于药物研发和药理学研究。
4. 临床诊断：在临床诊断中，免疫固定电泳可以用于检测特定蛋白质的异常表达，如肿瘤标志物、免疫球蛋白等，有助于疾病的诊断和监测。
**结语**免疫固定电泳作为一种重要的蛋白质分析方法，具有较高的特异性和灵敏度，广泛应用于科研和临床领域。
通过该技术可以实现对蛋白质的定性和定量分析，对于了解蛋白质的生物学功能以及疾病的诊断和治疗具有重要意义。