(强烈推荐)环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制可行性研究报告

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环介导等温扩增法快速检测结核杆菌复合群内主要致病菌

和牛型结核分枝杆菌，能排除卡介苗对诊断的干扰。并关键词环介导等温扩增快速检测结核分枝杆菌复合群卡介苗
ＲａｉｔｃｉｎｏａｎＰｔｏｅｓｏｙｏｃｅｉｍｂｒｕｏｉｍｐｌｘｂｏ —ｍｅａｅｓｔｅｍａｐｄＤｅｅｔｏｆｔＭｉａｈｇｎｆＭｃｂａｔｒｕＴｕｅｃｌｓｓＣｏｈｅｅｙＬｏｐｄｉｔｄＩｏｈｒｌＡｍｐｌｃｔｎＡｓａ．Ｈｏｇｉａｉｓｙｉｆｏｎ
成功检测到主要的结核致病菌：型和牛型结核分枝杆菌，包括卡介苗在内的其余相关菌株均未见非特异性交叉反应。检测人与的灵敏度可达１。贝／升，于常规ＰＲ方法。结论０拷微高Ｃ该检测方法具有敏感、异、成本和快速的特点，检测和区分人型特低可
ｏｓｒｅｎＭｔｂｒｕｏｉａ．ｏｎｓａｄｂｅｖｄｉｕｅｃｌｓｓｖｒｈｍｉｉｎＭ．ｕｅｃｌｓｓｖｒｏｉａｄｎｏｉｖｉｎｌｗａｂｅｖｄｆｒｔｅｔｅａｔｒａｉｈｔｂｒｕｏｉａ．ｂｖｓ，ｎｏｐｓｔｅｓｇａｓｏｓｒｅｏｈｏｈｒｂｃｅｉｎｔｅｉｔｓ．Ｔｈｅｅｔｏｉｔｏｈｓａｓｏｙｅｔｅｄｔｃｉｎｌｍｉｆｔｅａｓｙｗａ１ｐ／￣１ＣｏｌｉｎＴｈｉＡＭＰａｓｙｈｓｃ．ｎｃｕｓｏｓＬｓａａｍａｙａｖｎａｅｕｈｓｓｅｉｃｔｎｄａｔｇｓｓｃａｐｃｆｉｉｙ，ｓｎｓｔｖｔｅｉｉｉｙ

环介导等温扩增技术检测方法的研究进展

中国人兽共患病学报C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s㊀２０１８,３４(５)D O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１００２－２６９４．２０１８．００．０６８综㊀述环介导等温扩增技术检测方法的研究进展刘亚东,冷㊀雪,时㊀坤,李建明,张姗姗,刘㊀艺,宫庆龙,孙志博,宗㊀颖,曾范利,杜㊀锐国家自然科学基金(N o ．３１３７２４３６)和吉林省科技厅科技支撑计划(N o ．２０１６０２０９００６Y Y )联合资助通讯作者:杜㊀锐,E m a i l :d u r u i ７１＠１２６．c o m 作者单位:吉林农业大学,长春㊀１３００００摘㊀要:环介导等温扩增技术是一种可用于临床诊断的快速检测方法,可用于检测病毒㊁细菌㊁寄生虫等多种病原体.经不断完善,现已在临床检测过程中发挥重要作用.可用显色试剂对反应结果实现可视化,即结果的即时显示,无需后续验证.但是,无论是荧光染料还是显色指示剂,对反应过程都会产生或多或少的影响,目前研究表明羟基萘酚蓝是最好的显色试剂.同时,人们发现电化学技术也可以应用于此,使检测反应更快,操作更加简单.生物传感器可以对多种反应产物进行同步检测,而微流控芯片技术更是方便携带,有望成为实时检测技术的理想载体.关键词:L AM P ;可视化;电化学检测法;生物传感器;微芯片中图分类号:R ３７㊀㊀㊀文献标识码:A ㊀㊀㊀文章编号:１００２－２６９４(２０１８)０５－０４６０－０６A d v a n c e do f t h e d e t e c t i o nm e t h o do f l o o p Ｇm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m pl i f i c a t i o n L I U Y a Ｇd o n g ,L E N G X u e ,S H IK u n ,L I J i a n Ｇm i n g,Z H A N GS h a n Ｇs h a n ,L I U Y i ,G O N G Q i n g Ｇl o n g ,S U NZ h i Ｇb o ,Z O N G Y i n g,Z E N GF a n Ｇl i ,D U R u i (J i l i nA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,C h a n gc h u n １３００００,C h i n a )A b s t r a c t :l o o p Ｇm ed i a te d i s o t h e r m a l a m p l if i c a t i o n i s a r a p i dd e t e c t i o nm e t h o d t h a t c a nb e u s e d f o r c l i n i c a l d i a gn o s i s a n d c a n b eu s e d t od e t e c t v i r u s e s ,b a c t e r i a ,p a r a s i t e s a n d o t h e r p a t h o g e n s ．I t h a s b e e n i m p r o v e d a n d p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e c l i n i Ｇc a l t e s t i n gp r o c e s s ．T h e c o l o r r e a c t i o n c a nb eu s e d t o a c h i e v ev i s u a l i z a t i o no f t h e r e s u l t s ,a n d t h e r e s u l t s c a n i mm e d i a t e l y di s Ｇp l a y ．H o w e v e r ,b o t h t h e f l u o r e s c e n t d y e a n d t h e c o l o r i n d i c a t o r c a n i m p a c t t h e r e a c t i o n p r o c e s s ．T h e c u r r e n t s t u d y s h o w s t h a t h y d r o x y l n a p h t h o l b l u e i s t h e b e s t c o l o r r e a g e n t ．A t t h e s a m e t i m e ,i tw a s f o u n d t h a t e l e c t r o c h e m i c a l t e c h n o l o g y c a n a l s o b e a pＧp l i e d t o t h em e t h o d ,w h i c hc a nm a k e t h ed e t e c t i o nr e a c t i o nb e f a s t e r a n dt h eo p e r a t i o n m o r e s i m p l e ．B i o s e n s o r s c a ns yn c h r o Ｇn i z e dd e t e c t a v a r i e t y o f r e a c t i o n p r o d u c t s ．A n dm i c r o f l u i d i c c h i p i s e a s y t o c a r r y a n d i s e x pe c t e d t ob e c o m e t h e i d e a l c a r r i e rf o r r e a l Ｇt i m e d e t e c t i o n t e c h n o l og y．K e yw o r d s :l o o p Ｇm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n ;v i s u a l i z a t i o n ;e l e c t r o c h e m i c a l d e t e c t i o n ;b i o s e n s o r s ;m i c r o c h i p s S u p p o r t e db y t h eN a t i o n a lN a t u r a l S c i e n c eF o u n d a t i o no f C h i n a (N o ．３１３７２４３６),a n d t h e S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y S u p p o r t P r o Ｇgr a mo f J i l i nP r o v i n c i a l (N o ．２０１６０２０９００６Y Y )C o r r e s p o n d i n g au t h o r :D uR u i ,E m a i l :d u r u i ７１＠１２６．c o m ㊀㊀目前已存在几种核酸扩增方法[１Ｇ４],而P C R (聚合酶链式反应)是目前使用最广泛的技术,该基因扩增方法已被应用于临床,特别是在分子检测方面,在传染病诊断中尤其如此,例如肝炎和结核等,以及一些遗传疾病.基因检测步骤包括从标本中提取核酸,进行基因扩增和检测,这些步骤需要一定的操作技术和昂贵的仪器设施,在资金投入紧张的国家和地区,使用受到限制,且P C R 的循环过程变温会消耗一定时间.环介导等温扩增(L o o pＧm e d i a t e d i s o Ｇt h e r m a l a m pl i f i c a t i o n ,L AM P )是N o t o m i 等[５]人研究的一种分子扩增技术,可以快速大量的扩增目的片段,等温扩增解决了变温的时间损耗,现被应用于临床检测中,并被不断完善,在临床检测中具有非常重要的意义.１㊀L A M P 原理L AM P 技术的核心之一在于引物的设计,设计出特异性强的引物是L AM P 的第一步也是开始的关键.L AM P 引物是针对D N A 的靶序列设计一对０６４外引物F３与B３,以及一对内引物F I P和B I P,内引物F I P是由F２和F I c组成,B I P是由B２和B１c组成[６].反应的进行依托于D N A置换酶的活性和引物的特异性.在初始过程中,４个引物都参与反应,但是在循环反应中只有内引物参与D N A序列的置换合成.内引物分为上内引物(F I P)和下内引物(B I P),每一个内引物含有２个不同的序列,与靶序列的正向序列和反向序列相对应,一个用于第一步的启动,另一个以自身为模版进行第二阶段的循环扩增,即目的片段的尾端内侧序列被命名为F２c和B２.F２c和B２尾端内侧的２个序列被称为F１c和B１,外侧的２个序列称为F３c和F３.鉴于这种结构,F I P和B I P被命名为内引物.F I P包含F１c,１个T T T T片段以及互补于F２c的序列F２.B I P包含的是与B１互补的序列B１c,T T T T片段和B２.２个外引物包括的是B３和F３c互补的序列F３.１个含有靶序列和４个引物的D N A样品加热变性后在冰上快速冷却.之后,加入B s tD N A大片段置换酶,６５ħ１h,开始L AM P反应[５].２㊀反应特点L AM P反应的几个方面与其他扩增方法不同. L AM P方法的主要特征是只需要一种酶,使其在６５ħ范围内的等温条件下扩增核酸.因此,它允许使用简单且具有低成本效益的反应设备,在临床检测中可以更好的实施.L AM P方法具有高特异性和高扩增效率.由于L AM P方法使用４种识别模板D N A上６个不同区域的引物,其特异性极高.例如,L AM P方法可以特异性扩增来自区分单个核苷酸差异的人类基因组标本中的特定基因[７].L AM P方法的分离效率非常高,等温也不需要变温过程的时间浪费.L AM P方法在３０~６０m i n 内对２５μL反应混合物合成１０~２０μg特异性D N A[８].尤其加入特异性环引物可以有助于将扩增时间缩短到原始L AM P方法的１/２或１/３[９].该方法还可用于扩增靶R N A序列.N o t o m i 等人开发了一步,单管,实时逆转录循环介导的等温扩增(R TＧL AM P)测定法,用于检测甲型肝炎病毒(H A V)基因组中非翻译区的序列[１０].在这种情况下,与D N A的扩增相同的一步扩增可以通过同时添加逆转录酶进行,因为逆转录酶也显示出链转移活性.３㊀L A M P研究进展自从２０００年[５]第一次报道了L AM P,L AM P 就成为了分子扩增领域广泛研究的重点,在不断的研究中L AM P技术越来越完善.２００２年N a g aＧm i n e等人[９]设计应用环引物,大大缩短了L AM P 反应时间;同年N a g m i n e等人[１１]使用T s p R I酶实现了D N A的单链分离扩增;２００５年E n o m o t o等人[１２]通过将L AM P与逆转录相结合,建立了R TＧL AM P技术;２００６年Y o n e y a m a等人[１０]开发了单管一步逆转录法,对肝炎病毒进行了逆转录;同年H i r a y a m a等[１３]应用L AM P方法对水牛胚胎进行了性别鉴定并克隆了性染色体的特异性序列,对于物种的繁殖作出了非常重要的贡献.此外,２００６年P o o n等人[１４]未提取D N A直接进行L AM P,成功检测到恶性疟原虫阳性反应,对之后的检测技术产生深远的影响.K a n e k o等人[１５]在２００７年通过检测L AM P对生物的耐受性,进行了未提取D N A的病毒L AM P实验,再一次表明L AM P可以不经过D N A提取而进行扩增,只是结果没有经过提取的效果好.３．１㊀可视化发展㊀２００１年M o r i等人发现了根据浊度对反应进行肉眼的直观判断[８],但是因根据肉眼分辨浊度具有强烈的主观性,L e等人[１６]发现,在阳光照射下,用肉眼确定管之间的灵敏度和变异性是困难的,且阳性样品的浊度只在短时间内稳定.意味着必须在反应之后尽快进行监测[１７],更需要浊度计进行准确客观的判断,然而使用浊度计进行检测,不够经济实用,因而,实现反应结果的可视化,成为了学者们关注的焦点.D N A具有能和染料结合的特异性分子结构d s D N A,通常,染料与d s D N A的复合物的形成会使染料发生可见的颜色变化,因此此类染料可用于L AM P产物的可视化.２００３年,I w a m o t o等人[１８]首次使用S Y B R G r e e n I用于L AM P结果鉴定,研究发现[１９]D N A结合染料的检测灵敏度都远高于浊度检测的灵敏度.目前,许多荧光染料已被用于定性检测.在存在足够的d s D N A的情况下,荧光染料S Y B RＧG r e e n I的颜色从橙色变为绿色,且在自然光下,颜色变化依然易于分辨[１９Ｇ２０].另一方面,通过添加D N A结合染料提高灵敏度与较高的运行成本有关.另外,由于需要打开反应管以增加染料,因此增加了污染风险.为了克服后者的缺点,２０１２年,H o n g等人[２１]研究出了两步法,以避免打开管: S Y B RＧG r e e nI染料悬浮在管内的锡箔上,在L AM P反应后,将管离心,使染料落入L AM P反应１６４５期刘亚东等:环介导等温扩增技术检测方法的研究进展混合物中.使用该方法,当最小模板浓度为１拷贝/μL时,可以检测到L AM P的产物.同样,Q u a n tＧi T P i c o G r e e n[２２],G e n e F i n d e r[１７,２３Ｇ２４],和溴化乙锭[２２]也被用于L AM P结果的检测.２００６年,Y a s u y o s h i等人[２５]把聚乙烯亚胺用于L AM P的结果检测,用来增强染料标记.在使用聚乙烯亚胺增强的方法中,使用荧光标记的D N A探针结合L AM P产物,随后加入聚乙烯亚胺中和染料标记的L AM P产物,产生具有清晰的颜色的沉淀物,可以通过肉眼直接对结果判定.然而,D N A结合染料的方法存在一定的缺陷,主要为会对L AM P的扩增过程产生抑制[２５],这意味着染料试剂必须在终点加入,避免影响L AM P反应.此外,这些染料中的一些,例如溴化乙锭[７]可能是诱变剂,致癌物质或致畸物,虽然这取决于接触程度.此外,这种方法需要在扩增后打开反应管,可能会造成污染.对此,L i a n g等人[２６]在２０１３年用微晶蜡将S Y B RＧG r e e n I染料提前密封在反应管中,在L AM P反应结束后通过加热使蜡融化释放染料进行显色,这种方法即应用了荧光染料的灵敏度又解决了因开盖而可能产生的污染问题.在２０１４年J i a n g等人[２７]成功的应用这种方法对恶性疟原虫进行了检测.另一种使用间接显色指示剂的肉眼观测方法,指示剂可以加入到L AM P反应体系中,进行密封一步测定.因此,与两步的D N A结合染料方法相比,降低了产生污染的风险[２８],比如,钙绿黄素.在２００８年钙绿黄素被T o m i t a等人[７]首次应用在L AM P反应结果检测.在扩增反应前,钙黄绿素分子与锰离子结合,L AM P反应溶液为橙色,L AM P 反应过程中生成大量的焦磷酸根,使得钙绿黄素分子不再结合锰离子,而与生成的焦磷酸根离子结合,生成绿色荧光,而且,钙绿黄素分子与镁离子结合,可以增强绿色荧光信号[７].然而,在２０１０年W a s t iＧl i i n g等人[２２]发现,与没有添加指示剂的反应相比,加入钙绿黄素的似乎降低了L AM P的敏感性.实际上,钙绿黄素的存在在一定程度上抑制了L AM P 反应[２２,２９],另一个原因是钙绿黄素和双链D N A之间的相互作用导致了反应灵敏度的降低[３０Ｇ３１].因此,具有相似作用方式的另一种染料H N B 进入了人们的视线,这种染料是在镁离子存在下形成紫色,在扩增反应过程中,伴随大量的焦磷酸镁的生成导致反应中的镁离子浓度下降,从而使得含有H N B的反应溶液从紫色变为蓝色[２９].W a s t l i i n g 等人[２２]研究表示,该试剂不会对L AM P反应产生抑制,比钙绿黄素更加适合作为指示剂,因而被广泛使用[１７,２１,２９,３２Ｇ３４].３．２㊀电化学检测法㊀由于电化学方法更快,成本更低,更简单,并且比光学的方法更容易以小型化的形式应用[３５],这些特点使得电化学可以作为分析D N A扩增结果的可靠且稳定的检测方法[３６].因此,现在一部分的焦点为利用电化学传感器/芯片和生物传感器等方法对L AM P反应进行检测.３．２．１㊀E n d p o i n t㊀电化学的活性物质与d s D N A的结合会导致检测电流的变化.比如,在溶液中的H o e c h s t３３２５８氧化还原分子可使得D N A在槽中聚集,导致电流反应明显下降.A h m e d[３７]和S a f aＧv i e h[３８]等人将分子用作电活性指示剂来检测L AM P反应产物,并用探针非固定化方法测得８６f g/μL D N A(２４C F U/m L)[３８],为减少交叉感染的分析,他们开发了一个平台,允许在单个设备中进行放大检测.使用该装置和H o e c h s t３３２５８指示器,一次可测得３００拷贝量[３９].３．２．２㊀R e a l t i m e㊀L AM P反应的实时监测可以通过原位电化学反应来实现,依赖于两种机制:亚甲蓝(M B)分子与工作电极之间的氧化还原电子转移以及M B与d s D N A的嵌入[４０Ｇ４１],随着反应的进行, M B与L AM P扩增子的嵌入降低了游离M B浓度,从而降低了这种氧化还原电流[４２Ｇ４４].使用M B作为指标,H s i e h[４２]和X i e[４４]等人得到的检测限度分别为１６拷贝(４f g/μL)和０．３p M.然而,M B的D N A结合亲和力为１０４~１０５M－１[４５],其与M B L与扩增子L AM P在溶液中的低效率相互作用[４６],表明可以通过其他指标来实现较低的检测限度.钌六胺缺乏插层配体并与阴离子d s D N A骨架静电结合[４７].A h m e d等[４６]人将其作为定量监测L AM P 扩增子的指标,在３０m i n内检测限为２０拷贝/μL.使用单个生物芯片在单个聚丙烯管中进行体外扩增和实时监测,这种方法可以避免在整个过程中潜在的交叉污染风险.在理想情况下,电活性指示剂应具有化学稳定性,应优先与d s D N A扩增子结合,不应在监测过程中抑制扩增[４６].然而,几乎所有的氧化还原探针都对D N A的扩增存在抑制作用[３８].例如,H o e c h s t３３２５８对聚合酶活性有明显的抑制作用,并且限制溶液中D N A的扩增和感测.为了克服这个问题,Z h a n g等人[２４]开发了一种伏安模式,用于通过测试游离的２Ｇ脱氧鸟苷５Ｇ三磷酸(d G T P)的氧化反应来监测D N A扩增的生物化学过程,这也是L AM P反应中的反应物之一.有了这个方法,２６４中国人兽共患病学报２０１８,３４(５)抑制问题不再是焦点,因为没有辅助指标可以使用.不幸的是,需要将电极置于反应中可能会发生交叉污染.３．３㊀生物化学传感器㊀电化学生物传感器与某种生物识别模式联合,应用于检测方法中.已经报道了几种用于监测L AM P反应的电化学生物传感器/基于生物芯片的方法.S u n等人[４８]通过将序列特异性s s D N A探针固定在离子液体改良的基底电极上来制造电化学D N A生物传感器.然后,他们使用生物传感器和亚甲基蓝电化学指示剂来监测杂交的L AM P扩增子.N a k a m u r a等[４９]人开发了一种电化学D N A生物芯片,用H o e c h s t３３２５８作为杂交指示剂同时监测六种L AM P产物.N a k a m u r a等人[５０]又通过组合L AM P和基于杂交的电化学D N A生物芯片成功获得了特定基因的拷贝数,其由G e n e l y z e系统,D N A扩增１h和D N A检测０．５h 组成.通常,生物传感器/生物芯片的方法用于直接检测特异性序列的目标基因片段,以及在L AM P反应后进行定性检测使用.虽然直接检测特异性高于间接测量的特异性,但是制备D N A生物传感器/芯片是昂贵且耗时的,特别是在L AM P反应时对其进行实时检测,并不容易实现.目前,通过简单且经济有效的伏安模式监测L AM P反应已经有了一些进展,但是还没有详细的解释能说明L AM P反应物会污染电极设备.A h m e d等人[４６]观察到即使在重复测量之后,电极面和相对面上也没有形成薄膜或污渍.４㊀L A M P的未来目前还没有足够稳定㊁简单以及经济的N A T 系统供发展中国家使用.综上所述,L AM P及其周边技术还在开发中,用于在发展中国家建立最简单的用于诊断的N A T系统.这种诊断方法可能对许多疾病流行的国家有很大帮助.检测L AM P反应的理想方法应具有高度的敏感性和快速反应性,应具有低成本和非高密度性,应易于使用和环保,实现理想L AM P检测的可行性取决于微型化检测组件的发展,微流控芯片[５１]作为下一代基因检测设备一直被关注.该装置是在平台上组装的微小通道构成,在基因测试时,可以在单个芯片上进行完整的分析,包括提取,扩增和检测[５２].这些器件称为μＧ总分析系统(μＧT A S)芯片,或称为芯片上的实验室 .使用这些装置的优点包括防止基因扩增产物的污染,根据设备的设计可以进行多体系自动化反应,可以提高对微量样品的分析速度,以及进行简化及微型化现场测试.这种方法可以解决与现场基因测试相关的大量问题.H a t a o k a等人[５３]已经通过研究证明,L AM P扩增之后继续进行下一步的反应和分析,这些都可以在单个芯片上实现,也证明L AM P 反应在下一代的设备装置中依然适用.基于L AM P方法的简单通用的设备的开发和应用,对临床疾病的快速㊁准确的检测将具有重要意义.参考文献:[１]S a i k i R K,S c h a r f S,F a l o o n a F,e t a l．E n z y m a t i c a m p l i f i c a t i o n o f b e t aＧg l o b i n g e n o m i cs e q u e n c e sa n dr e s t r i c t i o ns i t ea n a l y s i sf o r d i a g n o s i so f s i c k l ec e l l a n e m i a[J]．S c i e n c e,１９８５,２３０(４７３２):１３５０．[２]C o m p t o nJ．N u c l e i ca c i ds e q u e n c eＧb a s e da m p l i f i c a t i o n[J]．N aＧt u r e,１９９１,３５０(６３１３):９１．[３]W a l k e rG T,L i t t l e M C,N a d e a uJ G,e t a l．I s o t h e r m a l i nv i t r o a m p l i f i c a t i o no fD N Ab y a r e s t r i c t i o ne n z y m e/D N A p o l y m e r a s e s y s t e m[J]．P r o cN a t lA c a dS c iUSA,１９９２,８９(１):３９２Ｇ３９６．[４]W a l k e rG T,F r a i s e rM S,S c h r a mJ L,e t a l．S t r a n d d i s p l a c e m e n t a m p l i f i c a t i o nＧa ni s o t h e r m a l,i n v i t r o D N A a m p l i f i c a t i o nt e c hＧn i q u e．[J]．N u c l e i cA c i d sR e s,１９９２,２０(７):１６９１．[５]N o t o m iT,O k a y a m a H,M a s u b u c h iH,e ta l．L o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o no fD N A[J]．N u c l e i cA c i d sR e s,２０００,２８(１２):E６３．[６]M o r i Y,N o t o m i T．L o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n (L AM P):a r a p i d,a c c u r a t e,a n d c o s tＧe f f e c t i v e d i a g n o s t i cm e t hＧo d f o r i n f e c t i o u s d i s e a s e s[J]．J I n f e c tC h e m o t h e r,２００９,１５(２):６２Ｇ６９．[７]T o m i t aN,M o r iY,K a n d aH,e t a l．L o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n(L AM P)o f g e n es e q u e n c e sa n ds i m p l ev i s u a l d eＧt e c t i o no f p r o d u c t s．[J]．N a tP r o t o c o l s,２００８,３(５):８７７．[８]M o r iY,N a g a m i n eK,T o m i t aN,e t a l．D e t e c t i o n o f l o o pＧm e d iＧa t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o nr e a c t i o nb y t u r b i d i t y d e r i v e d f r o m m a g n e s i u m p y r o p h o s p h a t ef o r m a t i o n[J]．B i o c h e m B i o p h R e s C o,２００１,２８９(１):１５０Ｇ１５４．[９]N a g a m i n eK,H a s eT,N o t o m iT．A c c e l e r a t e d r e a c t i o nb y l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o nu s i n g l o o pp r i m e r s[J]．M o l C e l l u l a rP r o b e,２００２,１６(３):２２３．[１０]Y o n e y a m aT,K i y o h a r aT,S h i m a s a k i N,e t a l．R a p i d a n d r e a lＧt i m ed e t e c t i o n o fh e p a t i t i s A v i r u s b y r e v e r s et r a n s c r i p t i o n l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n a s s a y[J]．JV i r o lM e t hＧo d s,２００７,１４５(２):１６２Ｇ１６８．[１１]N a g a m i n eK,K u z u h a r aY,N o t o m i T．I s o l a t i o n o f s i n g l eＧs t r a nＧd e d D N A f r o m l o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n p r o dＧu c t s．[J]．B i o c h e m B i o p hR e s,２００２,２９０(４):１１９５Ｇ１１９８．[１２]E n o m o t oY,Y o s h i k a w aT,I h i r a M,e t a l．R a p i dd i a g n o s i so fh e r p e ss i m p l e xv i r u s i n f e c t i o nb y al o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o nm e t h o d[J]．JC l i n M i c r ob i o l,２００５,４３(２):９５１Ｇ９５５．[１３]H i r a y a m aH,K a g e y a m aS,T a k a h a s h iY,e t a l．R a p i ds e x i n g o fw a t e r b u f f a l o(B u b a l u s b u b a l i s)e m b r y o su s i n g l o o pＧm e d i aＧt e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n[J]．T h e r i o g e n o l o g y,２００６,６６３６４５期刘亚东等:环介导等温扩增技术检测方法的研究进展(５):１２４９Ｇ１２５６．[１４]P o o nL L,W o n g B W,M aE H,e t a l．S e n s i t i v e a n d i n e x p e n s i v e m o l e c u l a r t e s tf o rf a l c i p a r u m m a l a r i a:d e t e c t i n g P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m D N Ad i r e c t l y f r o mh e a tＧt r e a t e db l o o d b y l o o pＧm e d iＧa t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n[J]．C l i n C h e m,２００６,５２(２):３０３．[１５]K a n e k oH,K a w a n aT,F u k u s h i m aE,e t a l．T o l e r a n c e o f l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n t o a c u l t u r em e d i u ma n d b i oＧl o g i c a l s u b s t a n c e s[J]．JB i o c h eB i o p h M e t h o d s,２００７,７０(３):４９９．[１６]L eT H,N g u y e nN T,T r u o n g N H,e t a l．D e v e l o p m e n t o fm iＧt o c h o n d r i a l l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n f o r d e t e c t i o n o f t h es m a l l l i v e rf l u k e O p i s t h o r c h i sv i v e r r i n i(O p i s t h o r c h iＧi d a e;T r e m a t o d a;P l a t y h e l m i n t h e s)[J]．J C l i n M i c r o b i o l,２０１２,５０(４):１１７８Ｇ１１８４．[１７]A l m a s iA,M o r a d iA,D e h a b a d i S MH,e t a l．D e v e l o p m e n t a n d a p p l i c a t i o no f l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o na s s a y f o r r a p i dd e t e c t i o no f f u s a r i u m o x y s p o r u mf．s p．l y c o p e r s i c i[J]．J P l a n tP a t h o l M i c r o b i o l,２０１３,４:１７７．D O I:１０．４１７２/２１５７Ｇ７４７１．１０００１７７[１８]I w a m o t oT,S o n o b eT,H a y a s h iK．L o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n f o r d i r e c t d e t e c t i o n o f M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s c o m p l e x,M．a v i u m,a n d M．i n t r a c e l l u l a r e i nS p u t u m S a mＧp l e s[J]．JC l i n M i c r o b i o l,２００３,４１(６):２６１６．[１９]L eT H,N g u y e nN T,T r u o n g N H,e t a l．D e v e l o p m e n t o fm i t oＧc h o n d r i a l l o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o nf o rd e t e c t i o n o f t h es m a l l l i v e rf l u k e O p i s t h o r c h i sv i v e r r i n i(O p i s t h o r c h iＧi d a e;T r e m a t o d a;P l a t y h e l m i n t h e s)[J]．J C l i n M i c r o b i o l,２０１２,５０(４):１１７８Ｇ１１８４．[２０]Z h a n g Y H,Y a n g T,S h a n g HW,e t a l．I n f l u e n c eo f s u b s t i t uＧt i n g l aw i t h p r o n e l e c t r o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o fR EＧM gＧN iＧb a s e dA２B７Ｇt y p e a l l o y s p r e p a r e d b y m e l t s p i n n i n g[J]．A d vM aＧt e rR e s,２０１２,５６０Ｇ５６１:１０１１Ｇ１０１５．[２１]H o n g M,Z h aL,F uW,e t a l．A m o d i f i e d v i s u a l l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n m e t h o df o rd i a g n o s i sa n dd i f f e r e n t i aＧt i o no fm a i n p a t h o g e n s f r o m M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s c o mＧp l e x[J]．W o r l d JM i c r o b i o l B i o t e c h n o l,２０１２,２８(２):５２３Ｇ５３１．[２２]W a s t l i n g S L,P i c o z z i K,K a k e m b oA S,e t a l．L AM P f o r h u m a n a f r i c a nt r y p a n o s o m i a s i s:ac o m p a r a t i v e s t u d y o f d e t e c t i o n f o rＧm a t s[J]．P l o sN e g l e c tT r o p D,２０１０,４(１１):e８６５．[２３]Z h a n g Q L,S h i C Y,H u a n g J,e t a l．R a p i dd i a g n o s i so f t u r b o t r e d d i s hb o d y i r i d o v i r u s i nt u r b o tu s i n g l o o pＧm e d i a t e di s o t h e rＧm a l a m p l i f i c a t i o n m e t h o d[J]．JV i r o l o g M e t h o d s,２００９,１５８(２):１８Ｇ２３．[２４]Z h a n g X,Q uK,L iQ,e t a l．R e c o r d i n g t h e r e a c t i o n p r o c e s s o f l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n(L AM P)b y m o n i t o r i n g t h e v o l t a mm e t r i c r e s p o n s e o f２ᶄＧd e o x y g u a n o s i n e５ᶄＧt r i p h o sＧp h a t e[J]．E l e c t r o a n a l y s i s,２０１１,２３(１０):２４３８Ｇ２４４５．[２５]Y a s u y o s h i M,T s u y o s h iH,T s u g u n o r iN．S e q u e n c es p e c i f i c v i s u a l d e t e c t i o n o f L AM P r e a c t i o n s b y a d d i t i o n o f c a t i o n i c p o l yＧm e r s[J]．B m cB i o t e c h n o l o g y,２００６,６(１):３．[２６]L i a n g C,C h e n g S,C h u Y,e ta l．Ac l o s e dＧt u b ed e t e c t i o no f l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n(L AM P)p r o d u c t su s i n g a w a xＧs e a l e d f l u o r e s c e n ti n t e r c a l a t o r．[J]．J N a n o s c i N a n o t e c h n o l,２０１３,１３(６):３９９９．[２７]J i a n g Z M,X u e p i n g MA,Y i nZ J,e t a l．Ac l o s e dＧt u b e i s o t h e rＧm a l a m p l i f i c a t i o nm e t h o d f o r h i g h l y s e n s i t i v e a n d v i s u a l i z e d d eＧt e c t i o no f P l a s m o d i u mF a l c i p a r u m[J]．P r o g r e s s i nM o d e r nB iＧo m e d i c i n e,２０１４．[２８]P a r i d a M,S a n n a r a n g a i a hS,D a s hP K,e ta l．L o o p m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n(L AM P):a n e w g e n e r a t i o n o f i n n o v aＧt i v e g e n e a m p l i f i c a t i o nt e c h n i q u e;p e r s p e c t i v e s i nc l i n i c a l d i a gＧn o s i s o f i n f e c t i o u s d i s e a s e s[J]．R e v M e dV i r o l,２００８,１８(６):４０７Ｇ４２１．[２９]G o t oM,H o n d aE,O g u r aA,e t a l．C o l o r i m e t r i cd e t e c t i o no f l o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o nr e a c t i o n b y u s i n g h yＧd r o x y n a p h t h o l b l u e．[J]．B i o t e c h n i q u e s,２００９,４６(３):１６７Ｇ１７２．[３０]Y uF,D i n g Y,G a oY,e t a l．F l u o r e s c e n c e e n h a n c e m e n t e f f e c t f o r t h e d e t e r m i n a t i o no fD N A w i t hc a l c e i nＧc e t y l t r i m e t h y l a mＧm o n i u mb r o m i d es y s t e m[J]．A n a l y t i c aC h i m i c a A c t a,２００８,６２５(２):１９５．[３１]Z h a n g X,L iM,C u iY,e t a l．E l e c t r o c h e m i c a l b e h a v i o r o f c a lＧc e i na n d t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n c a l c e i n a n dD N A[J]．E l e c t r o aＧn a l y s i s,２０１２,２４(９):１８７８Ｇ１８８６．[３２]M aX J,S h uY L,N i eK,e t a l．V i s u a l d e t e c t i o n o f p a n d e m i c i nＧf l u e n z aA H１N１V i r u s２００９b y r e v e r s eＧt r a n s c r i p t i o n l o o pＧm eＧd i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o nw i t hh y d r o x y n a p h t h o l b l u ed y e[J]．JV i r o lM e t h o d s,２０１０,１６７(２):２１４Ｇ２１７．[３３]L u oL,N i eK,Y a n g M J,e t a l．V i s u a l d e t e c t i o no fh i g hＧr i s k h u m a n p a p i l l o m a v i r u s g e n o t y p e s１６,１８,４５,５２,a n d５８b y l o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n w i t h h y d r o x y n a p h t h o l b l u e d y e[J]．JC l i n M i c r o b i o l,２０１１,４９(１０):３５４５．[３４]S a f a v i e h M,A h m e d MU,S o k u l l uE,e t a l．As i m p l e c a s s e t t ea s p o i n tＧo fＧc a r e d i a g n o s t i c d e v i c ef o r n a k e dＧe y ec o l o r i m e t r i cb ac t e r i ade t e c t i o n．[J]．A n a l y s t,２０１３,１３９(２):４８２Ｇ４８７．[３５]F e r g u s o nB S,B u c h s b a u m S F,S w e n s e nJ S,e ta l．I n t e g r a t e d m i c r of l u i d i c e l e c t r o c h e m i c a l D N As e n s o r[J]．A n a l y t i c a l C h e m,２００９,８１(１５):６５０３Ｇ６５０８．[３６]D e fév e rT,D r u e tM,E v r a r dD,e t a l．R e a lＧt i m e e l e c t r o c h e m iＧc a l P C R w i t haD N Ai n t e r c a l a t i n g r e d o x p r o b e[J]．A n a l y t i c a lC h e m,２０１１,８３(５):１８１５．[３７]A h m e dMU,H a s a nQ,H o s s a i nMM,e t a l．M e a t s p e c i e s i d e nＧt i f i c a t i o nb a s e do nt h e l o o p m e d i a t e di s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n a n d e l e c t r o c h e m i c a lD N As e n s o r．[J]．F o o dC o n t r o l,２０１０,２１(５):５９９Ｇ６０５．[３８]S a f a v i e hM,A h m e dMU,T o l b aM,e t a l．M i c r o f l u i d i c e l e c t r oＧc h e m i c a l a s s a y f o r r a p i dd e t e c t i o na n d q u a n t i f i c a t i o no fE s c h eＧr i c h i a c o l i[J]．B i o s e nB i o e l e c t r o n,２０１２,３１(１):５２３Ｇ５２８．[３９]A h m e d MU,S a i t o M,H o s s a i n MM,e ta l．E l e c t r o c h e m i c a l g e n o s e n s o r f o r t h e r a p i d d e t e c t i o no fGMOu s i n g l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n[J]．A n a l y s t,２００９,１３４(５):９６６Ｇ９７２．[４０]K e r m a nK,O z k a nD,K a r aP,e t a l．V o l t a mm e t r i c d e t e r m i n aＧt i o no fD N A h y b r i d i z a t i o nu s i n g m e t h y l e n eb l u ea n ds e l fＧa sＧs e m b l e da l k a n e t h i o l m o n o l a y e ro n g o l de l e c t r o d e s[J]．A n a lC h i m A c t a,２００２,４６２(１):３９Ｇ４７．[４１]Y a n g W,O z s o zM,H i b b e r t D,e t a l．E v i d e n c e f o r t h e d i r e c t i nＧ４６４中国人兽共患病学报２０１８,３４(５)t e r a c t i o n b e t w e e n m e t h y l e n e b l u e a n d g u a n i n e b a s e s u s i n gD N AＧm o d i f i e dc a r b o n p a s t e e l e c t r o d e s[J]．E l e c t r o a n a l y s i s,２０１５,１４(１８):１２９９Ｇ１３０２．[４２]H s i e hK,P a t t e r s o nA S,F e r g u s o nB S,e t a l．R a p i d,s e n s i t i v e, a n d q u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no f p a t h o g e n i cD N A a tt h e p o i n to f c a r ev i a m i c r o f l u i d i ce l e c t r o c h e m i c a l q u a n t i t a t i v eL o o pＧM e d i aＧt e d i s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n(M E QＧL AM P)[J]．A n g e w a n d t eC h e m i e,２０１２,５１(２０):４８９６Ｇ９００．[４３]N a g a t a n i N,Y a m a n a k aK,S a i t oM,e t a l．S e m iＧr e a l t i m e e l e cＧt r o c h e m i c a l m o n i t o r i n g f o ri n f l u e n z a v i r u s R N A b y r e v e r s e t r a n s c r i p t i o nl o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n u s i n g a U S B p o w e r e d p o r t a b l e p o t e n t i o s t a t[J]．A n a l y s t,２０１１,１３６(２４):５１４３Ｇ５１５０．[４４]X i e S,C h a i Y,Y u a nY,e t a l．D e v e l o p m e n t o f a n e l e c t r o c h e m iＧc a lm e t h o df o rO c h r a t o x i n A d e t e c t i o nb a s e do na p t a m e ra n d l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n[J]．B i o s e nB i o e l e c t r o n,２０１４,５５(９):３２４Ｇ３２９．[４５]B a r a n o v s k i i S F,B o l o t i nP A,E v s t i g n e e v M P,e t a l．C o m p l e xＧa t i o no f h e t e r o c y c l i c l i g a n d sw i t hD N Ai na q u e o u s s o l u t i o n[J]．JA p p l i e dS p e c t r o s c,２００８,７５(２):２５１Ｇ２６０．[４６]A h m e d MU,N a h a rS,S a f a v i e h M,e ta l．R e a lＧt i m ee l e c t r oＧc h e m i c a l d e t e c t i o n o f p a t h o g e nD N Au s i n g e l e c t r o s t a t i c i n t e r a cＧt i o no f a r e d o x p r o b e[J]．A n a l y s t,２０１３,１３８(３):９０７Ｇ９１５．[４７]S t e e l A B,H e r n eT M,T a r l o vM J．E l e c t r o c h e m i c a l q u a n t i t a t i o n o fD N Ai mm o b i l i z e do n g o l d[J]．A n a l y t i c a lC h e m,１９９８,７０(２２):４６７０．[４８]S u n W,Q i nP,G a oH,e t a l．E l e c t r o c h e m i c a lD N Ab i o s e n s o r b a s e do nc h i t o s a n/n a n oＧV２O５/MW C N T sc o m p o s i t ef i l mm o d i f i e d c a r b o n i o n i c l i q u i d e l e c t r o d e a n d i t s a p p l i c a t i o n t o t h e L AM P p r o d u c to fY e r s i n i ae n t e r o c o l i t i c a,g e n es e q u e n c e[J]．B i o s e nB i o e l e c t r o n,２０１０,２５(６):１２６４Ｇ１２７０．[４９]N a k a m u r aN,I t oK,T a k a h a s h iM,e t a l．D e t e c t i o no f s i x s i nＧg l eＧn u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m sa s s o c i a t e d w i t hr h e u m a t o i da rＧt h r i t i s b y a l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o nm e t h o da n d a ne l e c t r o c h e m i c a lD N Ac h i p[J]．A n a lC h e m,２００７,７９(２４):９４８４Ｇ９４９３．[５０]N a k a m u r aN,F u k u d aT,N o n e nS．S i m p l e a n d a c c u r a t e d e t e rＧm i n a t i o no fC Y P２D６g e n e c o p y n u m b e r b y a l o o pＧm e d i a t e d i s oＧt h e r m a l a m p l i f i c a t i o nm e t h o d a n d a n e l e c t r o c h e m i c a l D N Ac h i p [J]．C l i nC h i m A c t a,２０１０,４１１(７):５６８Ｇ５７３．[５１]W h i t e s i d e sGM．T h e o r i g i n s a n d t h e f u t u r e o fm i c r o f l u i d i c s[J]．N a t u r e,２００６,４４２(７１０１):３６８．[５２]K o p p MU,M e l l oA J,M a n zA．C h e m i c a l a m p l i f i c a t i o n:c o n t i nＧu o u sＧf l o wP C Ro na c h i p[J]．S c i e n c e,１９９８,２８０(５３６６):１０４６．[５３]H a t a o k aY,Z h a n g L,M o r iY,e t a l．A n a l y s i s o f s p e c i f i c g e n e b y i n t e g r a t i o no f i s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o na n de l e c t r o p h o r e s i s o n p o l y(m e t h y l m e t h a c r y l a t e)m i c r o c h i p s[J]．A n a lC h e m,２００４,７６(１３):３６８９Ｇ３６９３．收稿日期:２０１７Ｇ１０Ｇ１３㊀编辑:张智芳(上接第４５９页)[５５]Y uH B,R a oP S,L e eH C,e t a l．At y p e I I I s e c r e t i o n s y s t e mi s r e q u i r e d f o r A e r o m o n a s h y d r o p h i l a A HＧ１p a t h o g e n e s i s[J]．I nＧf e c t I mm u n,２００４,７２(３):１２４８Ｇ１２５６．D O I:１０．１１２８/I A I．７２．３．１２４８Ｇ１２５６．２００４[５６]V i l c h e s S,J i m e n e zN,T o m a s J M,e t a l．A e r o m o n a s h y d r o p h iＧl a A HＧ３t y p eI I Is e c r e t i o ns y s t e m e x p r e s s i o na n dr e g u l a t o r y n e t w o r k[J]．A p p l E n v i r o nM i c r o b i o l,２００９,７５(１９):６３８２Ｇ６３９２．D O I:１０．１１２８/AE M．００２２２Ｇ０９[５７]S u a r e zG,S i e r r a J C,K i r t l e y M L,e t a l．R o l e o fH c p,a t y p e６s e c r e t i o ns y s t e me f f e c t o r,o f A e r o m o n a s h y d r o p h i l a i nm o d uＧl a t i n g a c t i v a t i o no fh o s t i mm u n ec e l l s[J]．M i c r o b i o l o g y,２０１０,１５６(１２):３６７８Ｇ３６８８．D O I:１０．１０９９/m i c．０．０４１２７７Ｇ０[５８]S h aJ,R o s e n z w e i g J A,K o z l o v aE V,e t a l．E v a l u a t i o no f t h e r o l e s p l a y e d b y H c p a n dV g r G t y p e６s e c r e t i o n s y s t e me f f e c t o r s i n A e r o m o n a s h y d r o p h i l a S S U p a t h o g e n e s i s[J]．M i c r o b i o l o g y,２０１３,１５９(６):１１２０Ｇ１１３５．D O I:１０．１０９９/m i c．０．０６３４９５Ｇ０[５９]B r a u nV．B a c t e r i a l i r o n t r a n s p o r t r e l a t e d t o v i r u l e n c e[J]．C o n tＧr i b M i c r o b i o l,２００５,１２(１２):２１０．D O I:１０．１１５９/００００８１６９７[６０]N a j i m iM,L e m o sM L,O s o r i oC R．I d e n t i f i c a t i o no f i r o n r e g uＧl a t e d g e n e s i n t h e f i s h p a t h o g e n A e r o m o n a s s a l m o n i c i d a s u b s p．s a l m o n i c i d a:g e n e t i cd i v e r s i t y a n de v i d e n c eo f c o n s e r v e d i r o n u p t a k es y s t e m s[J]．V e t M i c r o b i o l,２００９,１３３(４):３７７Ｇ３８２．D O I:１０．１０１６/j．v e t m i c．２００８．０７．００８[６１]S t i n t z iA,R a y m o n dK N．A m o n a b a c t i nＧm e d i a t e d i r o na c q u i s iＧt i o n f r o mt r a n s f e r r i na n d l a c t o f e r r i nb y A e r o m o n a sh y d r o p h iＧl a:d i r e c tm e a s u r e m e n t o f i n d i v i d u a lm i c r o s c o p i c r a t e c o n s t a n t s [J]．JB i o lI n o r g C h e m,２０００,５(１):５７Ｇ６６．D O I:１０．１００７/ P L０００１０６５５[６２]H a n H J,T a k iT,K o n d o H,e ta l．P a t h o g e n i c p o t e n t i a lo f a c o l l a g e n a s e g e n e f r o m A e r o m o n a s v e r o n i i[J]．C a n JM i c r o b i o l,２００８,５４(１):１Ｇ１０．D O I:１０．１１３９/w０７Ｇ１０９[６３]L y n c hM J,S w i f t S,K i r k eD F,e t a l．T h e r e g u l a t i o no f b i o f i l m d e v e l o p m e n t b yq u o r u ms e n s i n g i n A e r o m o n a s h y d r o p h i l a[J]．E n v i r o n M i c r o b i o l,２００２,４(１):１８Ｇ２８．D O I:１０．１０４６/j．１４６２Ｇ２９２０．２００２．００２６４．x[６４]J a n d a J M,G u t h e r t zL S,K o k k aR P,e t a l．A e r o m o n a s s p e c i e s i ns e p t i c e m i a:l a b o r a t o r y c h a r a c t e r i s t i c sa n dc l i n i c a lo b s e r v aＧt i o n s[J]．C l i nI n f e c tD i s,１９９４,１９(１):７７Ｇ８３．D O I:１０．１０９３/ c l i n i d s/１９．１．７７[６５]K r z y m i n s k aS,K a z n o w s k iA,P u k M．I n t e r a c t i o no f A e r oＧm o n a s s p p．h u m a n i s o l a t e sw i t hm u r i n em a c r o p h a g e s[J]．N e w M i c r o b i o l,２００８,３１(４):４８１Ｇ４８８．D O I:１０．１０５３/j．a j k d．２００７．０２．１１８收稿日期:２０１７Ｇ０８Ｇ１８㊀编辑:王晓欢５６４５期刘亚东等:环介导等温扩增技术检测方法的研究进展。

利用环介导等温扩增技术检测新型隐球菌

ａｓｓａｙｆｏｒｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｎｇＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）．ＭｅｔｈｏｄｓＴｗｏｐａｉｒｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓ
ｗａｓｄｉｌｕｔｅｄｉｎｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｗｉｔｈｎｏｎ — ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌｌｕｆｉｄ．ｔｏｂｕｉｌｄＣ
ｏｔｈｅｒｃｏｍｍｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｓｏｆｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓａｎｄｓｏｍｅｓｐｅｃｉｅｓｏｆｃａｎｄｉｄａｗｅｒｅａｌｌａｍｐｌｉｉｆｅｄｔｈｒｏｕｇｈＬＡＭＰ，ｔｏ
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环介导等温扩增技术在病原检测中的应用

环介导等温扩增技术在病原检测中的应用高德臣【摘要】The article introduce the basic principle and characteristic of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) and the application of LAMP in detecting infectious disease. The LAMP assay has been adopted widely for the detection of animal pathogens,because of its simplicity,high sensitivity and specificity and detecting easily products etc. At present, the LAMP can be used in detecting porcine circovirus Ⅱ , goose parvovirus, PRV, HPAIV, NDV, Haemophilus parasuis, Listeria monocy-togenes , Mycoplasma hyopneumoina and Toxoplasma gondii etc.%文章介绍了环介导等温扩增技术的的基本原理、特点及其在传染性疾病中检测和诊断的应用.环介导等温扩增技术具有特异性强、等温灵敏、操作简单、产物易检测等优点.环介导等温扩增技术已经被用来快速诊断动物的传染病.目前可检测圆环病毒2型、鹅细小病毒、伪狂犬病病毒、高致病性禽流感病毒、新城疫病毒、副猪嗜血杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、猪肺炎支原体及弓形虫基因等.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2012(039)002【总页数】3页(P219-221)【关键词】环介导等温扩增技术;病原检测;应用【作者】高德臣【作者单位】辽宁职业学院,辽宁铁岭 112000【正文语种】中文【中图分类】S854.4环介导等温扩增技术（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi等于2000年开发了一种新的恒温体外核酸扩增技术。

等温扩增实验报告

一、实验背景随着分子生物学技术的不断发展，核酸检测已成为病原体检测的重要手段。

传统的聚合酶链反应（PCR）技术因其灵敏度高、特异性强等特点，在病原体检测中得到了广泛应用。

然而，PCR技术对设备、环境要求较高，且检测过程复杂，限制了其在现场快速检测中的应用。

近年来，等温扩增技术作为一种新型核酸检测技术，因其操作简便、快速、高效等特点，在病原体检测领域展现出广阔的应用前景。

二、实验目的1. 探讨等温扩增技术在病原体检测中的应用效果；2. 评估等温扩增技术与传统PCR技术在病原体检测中的灵敏度和特异性；3. 优化等温扩增实验条件，提高检测效率。

三、实验材料1. 实验试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、等温扩增试剂盒、核酸提取纯化试剂盒等；2. 实验仪器：PCR仪、荧光定量PCR仪、核酸电泳仪、凝胶成像系统等；3. 实验样本：疑似病原体感染样本。

四、实验方法1. DNA提取：采用DNA提取试剂盒提取样本中的病原体DNA；2. PCR扩增：采用PCR试剂盒对提取的DNA进行扩增；3. 等温扩增：采用等温扩增试剂盒对提取的DNA进行等温扩增；4. 灵敏度评估：通过比较PCR和等温扩增的扩增曲线，评估两种方法的灵敏度；5. 特异性评估：通过比较PCR和等温扩增的扩增产物，评估两种方法的特异性；6. 实验条件优化：通过调整等温扩增反应体系中的各组分浓度、反应时间等，优化实验条件。

五、实验结果1. 灵敏度评估：通过比较PCR和等温扩增的扩增曲线，发现等温扩增的灵敏度显著高于PCR，扩增曲线在低浓度DNA样本中更明显；2. 特异性评估：通过比较PCR和等温扩增的扩增产物，发现等温扩增的特异性与PCR相当，未出现假阳性；3. 实验条件优化：通过调整等温扩增反应体系中的各组分浓度、反应时间等，使等温扩增的灵敏度进一步提高，特异性保持稳定。

六、讨论1. 等温扩增技术在病原体检测中的应用优势：等温扩增技术具有操作简便、快速、高效等特点，适合在基层医疗机构、现场等环境中进行病原体检测。

环介导等温扩增技术在副溶血弧菌快速检测中的应用研究的开题报告

环介导等温扩增技术在副溶血弧菌快速检测中的应用研究的开题报告一、研究背景副溶血弧菌是一种非常常见的细菌，存在于海洋中的各种生物体表面和水体中。

副溶血弧菌引起的病例已成为全球性的重要公共卫生问题。

因此，开发一种快速、准确、方便的检测方法，对于副溶血弧菌的控制和预防非常重要。

传统的副溶血弧菌检测方法包括细菌培养、血凝素试验、PCR等，但这些方法都存在一些缺点，如耗时、精度不高、需要高度训练的技能等。

因此，需要开发新的检测方法以代替传统方法。

随着生物技术和分子生物学的不断发展，等温扩增技术成为一种新兴的检测技术，该技术基础简单、易于操作、准确度高、结果稳定。

由此，本研究将使用环介导等温扩增技术开发一种副溶血弧菌快速检测方法。

二、研究目的本研究旨在开发一种基于环介导等温扩增技术的副溶血弧菌快速检测方法，具体目的包括：1. 获取副溶血弧菌的核酸序列数据，设计特异性良好的引物，并进行环介导等温扩增体系的优化；2. 基于优化的环介导等温扩增技术设计检测方法，包括样本的处理、扩增过程条件和结果分析方法，以确保检测结果的准确性和稳定性；3. 对该方法进行评价和比较，包括与传统检测方法的比较和不同样本类型的评估。

三、研究内容1. 针对副溶血弧菌目标基因靶点设计两个特异性引物，并进行体系的优化和稳定性验证。

2. 开发并优化一种基于环介导等温扩增技术的雷达图谱分析方法，以实现便捷、快速、稳定的副溶血弧菌检测。

3. 针对不同样本类型验证该方法的可行性、稳定性和特异性，并与传统检测方法作比较，评价本检测方法的优越性。

四、研究意义本研究将探索一种新型、快速和准确的副溶血弧菌检测方法，以更好地监控和预防疾病的发生和扩散，为副溶血弧菌感染的预防控制提供参考，具有重要的实际应用价值和社会意义。

此外，本研究的环介导等温扩增技术也可为其他微生物的研究和检测提供借鉴。

《2024年改良的环介导等温扩增技术用于阴沟肠杆菌核酸以及碳青霉烯酶的快速检测》范文

《改良的环介导等温扩增技术用于阴沟肠杆菌核酸以及碳青霉烯酶的快速检测》篇一改良的环介导等温扩增技术用于阴沟肠杆菌核酸及碳青霉烯酶的快速检测一、引言随着生物科技的不断发展，对于微生物疾病及其耐药性的检测与控制成为当今科研领域的重点研究方向。

其中，阴沟肠杆菌作为重要的病原体之一，其传播及抗药性的变化引发了科研人员的高度关注。

因此，建立快速、准确的检测技术是保障医疗安全和推动医药科技发展的重要课题。

本文将重点介绍改良的环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）在阴沟肠杆菌核酸及碳青霉烯酶的快速检测中的应用。

二、环介导等温扩增技术概述环介导等温扩增技术是一种基于DNA恒温扩增技术的核酸扩增方法，其原理是通过特殊的引物设计，利用Bst DNA聚合酶在恒定温度下进行DNA扩增。

这种技术具有操作简便、时间短、灵敏度高、特异性强的优点，因此在病原体检测、基因诊断等领域得到广泛应用。

三、改良的环介导等温扩增技术针对传统LAMP技术的不足，本文提出了一种改良的环介导等温扩增技术。

该技术通过优化引物设计、调整反应条件等方式，提高了检测的准确性和灵敏度，同时降低了非特异性扩增的风险。

此外，改良后的LAMP技术还结合了荧光定量PCR的技术特点，实现了实时监测扩增过程，从而更准确地判断检测结果。

四、在阴沟肠杆菌核酸及碳青霉烯酶检测中的应用（一）阴沟肠杆菌核酸检测利用改良的LAMP技术，可以快速、准确地检测阴沟肠杆菌的核酸。

通过设计特异性引物，结合LAMP技术的恒温扩增特性，可以在短时间内实现阴沟肠杆菌核酸的大量扩增。

同时，通过荧光定量PCR技术的实时监测，可以准确判断扩增结果，为临床诊断和治疗提供有力支持。

（二）碳青霉烯酶检测碳青霉烯酶是阴沟肠杆菌产生的一种重要抗药性酶，其检测对于评估病原菌的耐药性和指导临床治疗具有重要意义。

通过改良的LAMP技术，可以实现对碳青霉烯酶的快速、准确检测。

环介导等温扩增检测下呼吸道感染致病菌的研究的开题报告

环介导等温扩增检测下呼吸道感染致病菌的研究的开题报
告
题目：环介导等温扩增检测下呼吸道感染致病菌的研究
研究背景与意义：
呼吸道感染是临床上常见的疾病之一，由于其症状表现复杂多样，同时致病菌种类较多，因此诊断与治疗都非常具有挑战性。

目前常用的检测方法包括细菌培养、PCR等技术，但存在着一些问题，比如细菌培养需要较长时间、PCR技术存在扩增效率低下等问题。

因此开发一个敏感、快速、特异性强的检测方法对于呼吸道感染的诊断和治疗意义重大。

研究内容：
本研究主要针对环介导等温扩增技术进行探究，评估其在呼吸道感染致病菌的检测中的应用价值。

具体研究内容包括以下几个方面：
（1）选择合适的引物和DETECTR CRISPR技术，针对常见致病菌进行扩增和检测；
（2）优化所选引物的扩增条件（如温度、时间等参数）；
（3）评价其检测灵敏度、特异性和准确性；
（4）对临床样本进行验证实验，并与PCR技术进行对比分析。

研究方法：
采用环介导等温扩增技术，选择合适的引物和DETECTR CRISPR技术，通过对温度和时间等参数的优化，进行致病菌扩增和检测。

利用标准品和临床样本进行灵敏度、特异性和准确性的评价，并与PCR技术进行对比分析，验证其在临床应用中的价值。

预期成果：
本研究将建立起一种快速、特异性强且敏感的环介导等温扩增检测技术，可以有效地应用于呼吸道感染致病菌的检测，并与PCR技术进行对比分析，为呼吸道感染的诊断和治疗提供新的方法和思路。

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环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制可行性研究报告李思光南昌大学一、选题的必要性1、项目所处技术领域产业政策本项目属生物高技术领域，是国家重点支持的研究领域，项目主要针对严重影响人类健康的主要病原菌的检测与诊断需要进行检测技术的研究与试剂盒的开发，本项目的实施可产生具有自主知识产权的科研成果。

本项目技术含量高，市场竞争力强，项目完成后能够产生较好的经济效益和社会效益，项目符合国家产业、技术政策。

2、项目所处技术领域技术发展现状目前的病原菌检测方法费时、费力、准确性低，开发快速、准确、低成本的检测技术和配套试剂是病原菌检测工作中亟待攻克的难题。

本项目针对病原菌检测中存在的问题，采用高灵敏度、高特异性的环介导等温扩增技术开发出简便、快速、经济的检测试剂。

3、项目技术先进性，对相关领域技术进步的推动作用环介导等温扩增是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA 的新技术。

该技术在1h内能扩增出109靶序列拷贝。

LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。

该技术的推广对生物学、食品科学及医学领域中的检测和诊断技术的进步有推动作用。

4、项目目前进展情况课题组开展了大量前期研究工作，已完成了本项目所需的科研平台建设任务，开展了嗜水单胞菌和金黄色葡萄球菌的环介导等温扩增研究，取得了阶段性研究成果，这些工作为本项目的顺利完成奠定了基础。

二、技术方案论述（一）项目技术关键点和创新点，项目完成时达到的技术水平1、技术关键（1）本项目的技术关键之一是引物设计。

与常规PCR引物不同，环介导等温扩增引物设计难度大，一组引物要求有6个位点与靶序列完全匹配才能够进行扩增。

目前我们已从国际基因组数据库中下载了部分病原菌的基因组DNA，并根据基因组特点采用等温扩增软件设计了部分引物，现正通过实验确定这些引物的性能。

（2）本项目的另一技术关键是最佳等温扩增体系优化。

通过对引物浓度、内引物和外引物的最佳浓度比、模板浓度、dNTP 浓度、BstDNA聚合酶用量、Mg2+浓度等条件进行优化，能够获得最佳实验条件。

2、创新点（1）既往对病原菌的检测一般采用细菌分离培养鉴定法，但该方法的准确率低，所需时间长，往往延误临床正确的诊断和治疗。

近年来，人们将PCR技术用于病原菌的检测。

PCR技术虽然较传统方法灵敏、快速，但需要较昂贵的仪器设备。

更为重要的是，PCR方法容易产生非特异性扩增产物，造成假阳性和假阴性结果，影响对样品的正确判断。

本项目将建立适合于食品和临床标本大规模检测的环介导等温扩增快速检测病原菌技术。

与目前的检测方法相比，等温扩增法具有快速、准确、灵敏的特点。

而且，等温扩增法是在恒温下进行，只需一个简单的恒温装置，不需要PCR实验中的昂贵仪器，因而易于在基层食品质量检测部门和医院推广使用。

（2）目前，国外已有将环介导等温扩增技术应用于病毒DNA和RNA检测的报道，但将其应用于病原菌检测的文献报道极少，国内基本上还未开展环介导的等温扩增研究工作。

本项目首次提出将环介导的等温扩增技术应用于食品和临床标本中病原菌的检测，并对目前的等温扩增方法提出改进策略，发展可同时检测多种病原菌的多重等温扩增技术，以克服当前一个等温扩增反应只能检测一种DNA或RNA的缺点。

因此，本项目的实施，将开发出具有自主知识产权的病原菌检测试剂盒。

3、项目完成时达到的技术水平项目完成时，开发的多重环介导等温扩增快速检测病原菌技术及其配套试剂盒达到国际先进水平。

（二）项目技术方案1、技术方案（1）环介导等温扩增（LAMP）和多重等温扩增快速检测常见病原菌方法的建立①常见病原菌特异性LAMP引物的设计。

根据GenBank数据库公布的常见病原菌DNA序列，采用LAMP专用引物设计软件设计特异性LAMP引物（包括每类致病菌的两个外引物、两个内引物和两个环引物，其中每个内引物均具有两段能够识别靶分子上特定位点的序列，以保证靶序列的特异性扩增。

）②常见病原菌基因组DNA的提取。

采用本实验室建立的基因组DNA快速提取技术提取致病菌DNA。

③LAMP扩增反应体系的优化：对引物浓度、内引物和外引物的最佳浓度比、模板浓度、dNTP浓度、BstDNA聚合酶用量、Mg2+浓度等条件进行优化。

④温育条件的优化：在55-65℃之间优化等温扩增温度。

⑤扩增产物的检测：建立快速显色法和电泳分析法两种检测扩增产物的方法。

⑥以上述研究结果为基础，建立常见病原菌的环介导等温扩增和多重环介导等温扩增快速检测技术。

（2）常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法的灵敏度分析将常见病原菌目标基因克隆至pMD-18T载体，转化后提取质粒，倍比稀释成含目的基因拷贝数为105、104、103、102、101，以其为模板做环介导等温扩增反应，检测本方法的灵敏度。

（3）常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法的特异性分析分别以病原菌和非病原菌基因组DNA为模板做环介导等温扩增反应，检测本方法的特异性。

（4）常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法与国际标准方法及常规PCR扩增方法比较分析以LAMP的两个外引物做常规PCR扩增，并与LAMP的扩增结果进行比较分析，进一步判断LAMP技术的灵敏度、特异性和稳定性。

（5）常见病原菌的环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测方法在食品检测和临床诊断中的应用研究将本方法应用于食品检测和临床诊断中，分析本方法对不同样品检测的准确率。

（6）病原菌的环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测试剂盒的研制根据本项目所建立的LAMP最佳反应体系和LAMP反应产物显示方法，研制开发快速检测病原菌的试剂盒（包括单一病原菌检测试剂盒和多种病原菌同时检测试剂盒）。

2、工艺流程（三）项目技术质量指标（1）本项目建立的方法对病原菌检测的准确率达到95%。

（2）本项目建立的方法对病原菌目的基因检测的灵敏度达到101拷贝。

（3）本项目建立的方法不产生非特异性扩增产物。

（4）对病原菌目的基因的等温扩增过程在30-60分钟内完成，显色法检测扩增产物在5分钟内完成，电泳法检测扩增产物在60分钟内完成。

（四）项目执行过程中各阶段目标2007年度第一季度：设计引物，引物合成，购买实验菌株和有关试剂，完善实验条件。

第二季度：样品采集，病原菌DNA提取。

第三季度：等温扩增反应体系优化，温育条件优化。

第四季度：扩增反应产物检测方法的建立（快速显色法、电泳分析法）。

2008年度第一季度：环介导等温扩增快速检测病原菌方法操作程序确定，多重等温扩增同时检测多种病原菌实验技术建立。

第二季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方法的准确度分析。

第三季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方法的灵敏度分析。

第四季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方法与常规PCR扩增方法比较分析。

2009年度第一季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方法在食品和临床标本上的应用及效果分析。

第二季度：环介导等温扩增快速检测病原菌试剂盒和多重等温扩增试剂盒研制。

第三季度：试剂盒的应用及技术推广。

第四季度：课题总结，鉴定。

（五）项目经费预算情况本项目申请科研经费5万元。

其中设备、仪器购置费1万元；材料、样品加工费0.5万元；土建安装费0.5万元；资料、调研费0.5万元；实验、检测费2万元；鉴定费0.5万元。

三、项目实施支撑条件1、项目技术来源本项目的技术由项目申请人建立。

2、项目实验、检测条件项目申请人所在学院—生命科学学院拥有食品科学国家重点建设学科、生物化学与分子生物学省级重点学科和食品科学教育部重点实验室。

这些重点学科和重点实验室设施完善、先进，具有进行本项目研究的实验条件和实验场地，为本项目的完成提供了保障。

项目申请人所在的江西省生物化学与分子生物学重点实验室实验条件先进，具有PE-9700型PCR仪，全自动DNA测序仪（ABI Prism 3100型）、高速冷冻离心机、超速冷冻离心机、超低温冰箱、Milli-Q超纯水系统、各种规格的电泳仪、紫外分光光度计、设施先进的细菌培养室等仪器设备。

现已完成了本项目所需的科研平台建设工作。

项目申请人长期从事分子生物学研究工作，熟练掌握了分子生物学研究技术。

课题组已开展了本项目的前期研究工作，目前正在进行嗜水单胞菌和金黄色葡萄球菌的环介导等温扩增研究，基本掌握了等温扩增专用引物设计软件的使用和等温扩增的操作要点，这为本项目的顺利完成奠定了技术基础。

3、项目申请单位人才资源情况项目申请单位南昌大学是我省唯一一所省部共建的“211”工程重点建设大学，人才资源丰富，科研力量雄厚。

生命科学学院有专任教师150人，其中正副教授60人，讲师28人，中高级技术人员比例2:1。

4、项目组人员专业结构、职称结构项目组科研人员7人，主要由生物化学与分子生物学专业、微生物学专业人员组成，专业结构合理。

科研人员中，教授2人、副教授2人、研究生3人。

其中具有博士学位的教师2人。

5、项目新增投资筹集情况本项目申请科研经费5万元。

四、项目预期经济效益1、预期市场需求病原菌的检测是食品检测和临床诊断中的常规项目，食品检测部门和医疗机构对检测试剂的需求量巨大。

等温扩增技术在病原菌的检测工作中有很大潜力。

然而，目前国外仅有将其用于病毒DNA和RNA检测的研究报道，在病原菌检测领域尚无以此技术开发的商业试剂，国内也未见这方面的研究开发报道。

因此，开发病原菌的环介导的等温扩增试剂具有广阔的前景。

2、预期盈利水平目前以传统方法检测一个样品中的一种致病菌的收费约50元。

本项目建立的检测技术检测一个样品的试剂成本约8元，如果以20元销售，可获利润12元。

一个小型试剂生产企业一年至少可生产检测50万个样品的试剂，每年获利600万元。

因此，该技术的推广可产生明显的经济效益。

3、预期产业化前景本项目是针对严重影响人类健康的病原菌的检测问题提出的，研究成果的实用性强，易于转化。

在产品的研制工作中采用了现代分子生物学新技术，产品的科技含量高，生产成本低，利润空间大。

本产品的生产不需特殊大型设备，产品定型后可向中小型生化试剂生产企业转让，因此，本项目的产业化前景广阔。

我省具有一定生产能力的试剂生产企业经技术培训后可生产本产品。

4、项目实施风险分析课题组已开展了本项目的前期研究工作，目前正在进行嗜水单胞菌和金黄色葡萄球菌的环介导等温扩增研究，基本掌握了等温扩增专用引物设计软件的使用和等温扩增的操作要点，这为本项目的顺利完成奠定了技术基础。

项目申请人所在实验室为江西省生物化学与分子生物学重点实验室，实验条件先进，现已完成了进行本项目研究的科研平台建设工作。