环介导等温扩增技术原理ppt课件
第8章环介导等温扩增
扩增分两个阶段
第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链 DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另 一条链就会解离，变成单链。
扩增分两个阶段
上游内部引物FIP的F2 序列首先与模板F2c结合 （如图B所示），在链置 换型DNA聚合酶的作用下 向前延伸启动链置换合成 。
扩增分两个阶段
外部引物F3与模板F3c结 合并延伸，置换出完整的 FIP连接的互补单链（如图 C所示）。FIP上的F1c与 此单链上的Fl为互补结构 。自我碱基配对形成环状 结构（如图C所示）。
F3引物：上游外部引 物(Forward Outer Primer)，由F3区组 成，并与靶基因的 F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物 (Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域 组成，B2区与靶基因3’ 端的 B2c区域互补，B1C域与靶 基因5’端的Blc区域序列相同。
B3引物：下游外部引物 (Backward Outer Primer )，由B3区域组成， 和靶基因的B3c区域互补。
2．扩增原理
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温 度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。 因此，DNA在此温度下合成是可能的。利 用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA 聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自 我循环。
结合。开始链置换合成，解离出的单链核 酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的 B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA 合成延伸及链置换．
扩增分两个阶段
第2阶段是扩增循环阶段。 形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP
引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物 DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状 引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动 链置换合成，周而复始。
lamp环介导等温扩增原理
lamp环介导等温扩增原理
LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）是一种新型的等温扩增技术，它可以在恒定温度下快速扩增DNA序列，因此被广泛应用于分子生物学和医学领域。
LAMP技术的原理如下：
1.引物设计
LAMP技术需要设计4-6个特异性引物，其中包括两个外部引物（F3和B3），两个内部引物（FIP和BIP）和一个环形引物（loop primer）。
这些引物的设计基于目标DNA序列的特异性，以及引物之间的相互作用，以确保扩增的特异性和高效性。
2.等温扩增
LAMP技术的扩增过程是在恒定温度下进行的，一般为60-65℃。
引物结合到目标DNA序列上后，FIP和BIP引物通过自身的反向和正向扩增，形成一个DNA 环，这个环可以作为模板，引导F3和B3引物的扩增。
同时，环形引物也可以加速扩增速度和提高扩增效率。
3.产物检测
LAMP技术的产物是大量的DNA片段，可以通过凝胶电泳或实时荧光检测来进行检测。
实时荧光检测可以在扩增过程中实时监测DNA量的增加，从而确定扩增的特异性和灵敏度。
总之，LAMP技术是一种快速、特异性和高效的等温扩增技术，可以广泛应用于分子生物学和医学领域，例如病原体检测、基因突变分析和DNA测序等。
环介导等温扩增技术
谢谢欣赏！
采自奶场的125份样品进行了检测。结果表明,LAMP检 测出阳性样品81份, GB/T 4789.10- 2003检测出阳性样品84 份,LAMP阳性检出率为96.43%。
图5 金黄色葡萄球菌LAMP特异性的检测结果
M:DL2000 DNA Marker; 1:金黄色葡萄球菌ATCC25923;2:沙门氏菌 CGMCC 111552; 3:沙门氏菌ATCC13067;4:沙门氏菌HJ- 004; 5: ETEC: 44247 (6∶15∶16) ;6: EPEC: 44706 (111∶58∶- ) ; 7:荧光假单胞菌 CGMCC 111802;8:恶臭假单胞菌CGMCC111819; 9:铜绿假单胞菌 ATCC27853;
散法、免疫学方法、基因芯片法、基因探针法、 测试片法、PCR 法等。
环介导恒温扩增技术( loop -mediated isothermal amp lification, LAMP)是Notomi等2000年发明的一种 新颖的扩增技术,其特点是针对靶基因的6个区域设计4 种特异引物,在DNA聚合酶(B st DNA polymerase)的 作用下,恒温条件下进行核酸扩增,具有操作简单、特异 性强特点。另外通过环引物的添加,大大加快了反应的 速度 。国外报道,LAMP被广泛食品等病原菌的检测中, 如巴西芽生菌、锥虫病 、沙门氏菌 、虾中的白斑综合
测金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间 短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄 球菌的新方法。
简介：金黄色葡萄球菌( S taphy lococcus
aureus)是引起食物中毒的主要致病菌之一,也是 引起奶牛患乳房炎的重要病原菌 ,在自然界中广 泛存在,食品受污染的机会很多。近年来随着抗 生素的大量使用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
大学课程遗传学实验实验九 环介导 jc课件
8U/µl
dNTPs
2.5mM of each
F3、B3、FIP、BIP
25µM
琼脂糖凝胶
2﹪
10×Thermopol缓冲液
实验步骤
1、提取含有目的片段的质粒作为阳性模板（为了便于提取 目的DNA，我பைடு நூலகம்将靶序列克隆到质粒中）。
2、将各成分按以下次序在0.5ml灭菌离心管内混合：
阳性模板（质粒DNA） 1µl
环介导的等温扩增(Loop–mediated isothermal amplification，LAMP):针对 靶基因的六个区域设计四条特异性引物,利 用链置换DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)在等温条件下高效、快速、 特异地扩增靶序列。
实验目的
1. 掌握LAMP扩增单纯疱疹病毒II型 DNA的 基本原理。
第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模 板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成， 解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’ 末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA 合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状 结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新 一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。扩增的最 后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA 的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向 重复序列。
6、 取15µl DNA扩增产物，在含0.5μg/ml溴 化乙锭的2%琼脂糖凝胶上电泳30 min，电 压5V/cm，紫外灯下观察结果。
思考题
1、与PCR相比，LAMP有哪些优势? 2、LAMP与PCR的电泳条带有什么差别？
乙肝病毒检测
起始阶段
任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延 伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP 的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的 作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c 结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的 F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状 结构。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于 FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端 的Fl区段为起点,以自身为模板，进行DNA合成延伸形成 茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。
环介导等温扩增技术
环介导等温扩增技术
无环介导等温扩增技术，又称无环PCR技术（Loop-less PCR），是一种建立在核酸扩增基础上的空洞检测机制，专门用于精确地发现定位特异性核酸条带。
该技术是由德国Max Planck研究所研究员Gero Steinbacher和其同事于2012年提出的。
无环介导等温扩增（LPCR）技术首先引入Gero Steinbacher提出的标记聚合物链反应（MPCR），并且大大地简化了传统偶联反应扩增的整个过程。
该技术主要通过设计两个特殊的引物，一个引物由正向片段和逆向片段组成，另一个引物只由正向片段组成，双方引物由T4 DNA尾端核酸连接而成，这种新颖的结构就是MPCR技术的核心。
该技术的优点在于：
1、空洞检测的结果更加准确可靠；
2、反应涉及的步骤少，整个扩增过程机械性好，易于操作；
3、可以有效提高检测标记特异性核酸信号强度，准确定位检测到特定碱基；
4、可实现环境友好，加快分析过程。
随着医学和生物技术领域对无环介导等温扩增技术的不断进步，该技术在克隆特异性序列，基因检测，基因组分析，病毒鉴定，抗体反应定量，微生物检测等多个领域得到了广泛的应用。
相比于传统的PCR技术，无环介导等温扩增技术拥有更高的检测效率，更简便的操作过程，并且可以有效实现环境友好。
由于该技术具有上述特点，极大地提高了信息的准确性，广泛应用于各种生命科学相关领域。
环介导等温扩增技术简介
哑铃状模板构造形成的过程
（1）
FIP
（2）
（3）
F3 Primer
（4） （5）
＋
解离链
（6） 环状结构
BIP
（7）
（8）
＋
解离链
环状结构
B3 Primer
环状结构
循环扩增阶段和延伸循环阶段
环介导等温扩增反应的体系
环介导等温扩增法所需的试剂
DNA扩增
RNA扩增
模板DNA 引物
FIP F3 BIP B3 链置换型DNA聚合酶
dNTPs 反应缓冲液
模板DNA
引物 FIP F3 BIP B3
链置换型DNA聚合酶 逆转录酶 dNTPs 反应缓冲液
PS：当模板是RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样进行扩增。
环介导等温扩增有哪些优点？
优点
不需要使双链DNA先变性成单链，省时。 扩增反应在等温下可持续进行。 扩增的效率极高。 针对6个区段使用4种引物，拥有高度的特异性。 不需要PCR仪器，仅仅使用一种链置换型DNA聚合酶，成本 低廉。 扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不 一的片段，检测方法简单。
环介导等温扩增的特征是针对目标DNA链上的6个区段设 计4个不同的引物然后再利用链置换型DNA合成酶在一定温度 下进行反应。反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合 成酶、基质等共同置于一定温度下（60-65℃），经一个步骤 即可完成。其扩增效率极高，可在15~60min内实现109~1010 倍的扩增。而且由于有着高度的特异性，只需很据扩增产物的 有无即可对靶基因序列的存在与否做出判断。
环介导等温扩增技术
１．ＬＡＭＰ法检测结果：应用实时荧光定量方法 检测，测定出的痰标本中细菌浓度分别以１×１０３拷 贝／ｍｌ和１×１０５拷贝／ｍｌ为界值，计算每个界值范 围内阳性结果的例数，具体数据见表１。
中社区获得性肺炎１７４例，慢性阻塞性肺疾病急性
加重６０例，支气管扩张伴感染４３例，慢性支气管炎
急性发作８例，医院获得性肺炎４例。人选患者均
测出病原菌１８５株，其中细菌１４４株，非典型病原菌 ４１株；革兰阴性杆菌１２２株，革兰阳性球菌２２株。 革兰阴性杆菌中致病菌依次为铜绿假单胞菌４０株 （２１．６％），流感嗜血杆菌３４株（１８．４％），肺炎克雷 伯菌２０株（１０．８％），嗜麦芽窄食单胞菌１２株 （６．５％），鲍曼不动杆菌１１株（５．９％），大肠埃希菌 ５株（２．７％）。非典型病原菌中肺炎支原体３９株
ｗｅｒｅ
ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ
ａ
ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｔｈｅ ２８９ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ４４（１５．２％）ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ．Ｔｅｓｔｓ ｂｙ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ＞１×１０３ ｅｏｐｉｅｓ／ｍｌ ａｓ ｃｕｔｏｆｆ ｖａｌｕｅ．ｓｈｏｗｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
痰标本中的细菌浓度（拷贝／ｍ１）＝模板浓度
（拷贝／斗１）×１００／０．６。以细菌浓度＞１×１０３拷贝／ ｍ１判定为阳性结果ｐ ｏ。 ４．统计学处理：结果数据均采用ＳＰＳＳ １７．０统 计软件分析。配对的计数资料之间两两比较采用
ＭｃＮｅｍａｒ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）技术，以其
特异度强、敏感度高、快速准确和操作简单、技术水 平要求相对较低及所需试验器材简单等优点被广泛 应用于生物学的各个领域，可被推广用于感染性疾
LAMP
LAMP（环介导等温扩增）技术2011-07-28 11:46 来源：北京蓝谱点击次数：1341 关键词：LAMP PCR技术环介导等温扩增分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网PCR方法在人类及动植物疾病基因诊断、食品分析和环境监测等领域发挥着举足轻重的作用，其灵敏度高、特异性好，是目前最精准的基因诊断方法。
然而PCR方法操作起来较复杂，对仪器和人员要求比较高，不适合基层或现场快速诊断，因此在国内的推广速度并不是很快。
2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即LAMP (L oop-mediated isothermal amplification),中文名为“环介导等温扩增反应”，受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，短短几年，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，在这次甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学公司接受WHO的邀请进行H1N1 LAMP试剂盒的研制。
通过荣研公司近十年的推广，LAMP技术已广泛应用于日本国内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中，并得到了欧美国家的认同。
LAMP方法的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，LAMP反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。
可以预见，在未来的基因诊断领域，LAMP方法将占据大壁江山。
目前，在万方数据库搜索LAMP文章500多篇。
详见：/paper.asp x?q=loop-mediated+isothermal+amplification&o=sortby+CitedCount+CoreRank+date+relevanc e%2fweight%3d5&f=top&n=10&p=11. 优缺点介绍：LAMP方法优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）；反应时间短（30～60min就能完成反应）；临床使用不需要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浑浊仪）；操作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、酶和模板混合于PCR管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30～60min，肉眼观察结果）。
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特异性高 分析速度快 成本低 突变率低 不需要升温降温过程，一台的加热器即可操作 检测核酸成分比检测微生物本身危险性小 方便诊断
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环介导核酸等温扩增技术（LAMP） 滚环扩增技术 RCA 单引物等温扩增 SPIA 依赖解旋酶的等温扩增技术 HAD 链替代扩增 SDA 交叉引物扩增技术 CPA 核酸依赖性扩增检测技术 NASBA Qβ复制酶反应
形 成
基 础 结 构
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LAMP
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Effect of reaction time on the LAMP nes1,D NA marker(DL2000) with2000,1000,750 ,500,250 and 100bP:lanes2一 5,LAMP amPlification Produets for 15 min,30min,45min,6 0min,respectively:l ane6,without DNA template in the reaction.
LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、 准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾 病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益 广泛的应用。
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60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度， DNA在65℃左右处于动态平衡状态。利用引物 合成的DNA链取代模板互补链。
①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特 性的Bst DNA聚合酶
②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 ③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及
进行温度循环。
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针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c 和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种 引物。
LAMP反应的开始阶段四条引物都被使用，但在循环阶段则 只有内引物被使用。
乔岩梅. 炭疽芽孢杆菌特征基因恒温扩增检测方法的研究[D]. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
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反应结束后对扩增产物的检测常使用焦磷酸酶沉淀检测 （浊度检测）、荧光检测、凝胶电泳检测等。
焦磷酸酶沉淀的检测（浊度检测）：在LAMP反应过程中， dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产 生副产物焦磷酸酶白色沉淀，研究者发现LAMP反应中焦 磷酸镁沉淀的形成与所产生的DNA量之间的关系，发现两 者生成量之间呈线性关系，并且焦磷酸镁沉淀在400 nm处 有吸收峰，从而进行LAMP的定量检测。
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温度 ℃ 引物
模板
NASBA 42
需要2条 RNA
SPIA 42
1条
RNA
HDA
37/65 需要2条 DNA
SDA LAMP RCA Qβ
37/65 63 37-65 37
不需要 4RNA酶 H，T7RNA聚合酶 反转录酶，T7RNA 聚合酶 解旋酶，扩增片段 小
DNA聚合酶
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LAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模 板的缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的 连续快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。
操作简单：只需一个水浴锅
快速高效：不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环 而造成 的时间损失
特异性强：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区 域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异 性极高。
B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区 域组成，和靶基因的B3c区域互补。
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LAMP反应引物与对应模板区域
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内引物FIP的F2与其模板的互补序列F2c结合，在Bst DNA聚合酶作用下，从F2的3’末端开始启动DNA合成， 合成一条以FIP为新的DNA单链并与模板链结合形成新 的双链DNA。
高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数 量级的差异。
缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在 300 bp以内。>500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的 扩增。灵敏度高易造成假阳性结果。
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环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification ,简称LAMP)是利用4个特殊设计 的引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,在 恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新 技术。
环介导等温扩增技术原理
烟雨莫问
1
等温扩增技术简介 等温扩增技术的应用前景 几种等温扩增技术比较 环介导的等温扩增技术原理 环介导的等温扩增演示 环介导的等温扩增检测
2
等温扩增技术(Isothermal Amplification Technology)是核酸体外扩增技术，其反应过程 始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性 的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速 核酸扩增的目的。
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以F3为起始合成的新链与模板链形成双链。而原合成的以FIP 为起始的DNA单链被置换而脱离产生一单链DNA，其在5’末端 F1c和F1区发生自我碱基配对，形成茎环状结构。
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引物BIP的B2与模板链B2c区互补配对，合成以BIP为起始的新链， 并与模板链互补形成DNA双链。同时，F端的环状结构将被打开， 外引物B3与模板上B3c杂交后，以其3’末端为起点也开始合成新链， 并使以BIP为起始的DNA单链从模板链上脱离下来，形成以FIP和 BIP为两端的单链。因为B1C与B1互补，F1C与F1互补，两端自然 发生碱基配对，这条游离于液体中的DNA单链分别在F和B末端形成 两个茎环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构，此结构即为LAMP 的基础结构。
FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C 区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基 因5’端的Flc区域序列相同。
F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成， 并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和 B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与 靶基因5’端的Blc区域序列相同。