环介导等温扩增技术原理
第8章环介导等温扩增
扩增分两个阶段
第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链 DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另 一条链就会解离，变成单链。
扩增分两个阶段
上游内部引物FIP的F2 序列首先与模板F2c结合 （如图B所示），在链置 换型DNA聚合酶的作用下 向前延伸启动链置换合成 。
扩增分两个阶段
外部引物F3与模板F3c结 合并延伸，置换出完整的 FIP连接的互补单链（如图 C所示）。FIP上的F1c与 此单链上的Fl为互补结构 。自我碱基配对形成环状 结构（如图C所示）。
F3引物：上游外部引 物(Forward Outer Primer)，由F3区组 成，并与靶基因的 F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物 (Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域 组成，B2区与靶基因3’ 端的 B2c区域互补，B1C域与靶 基因5’端的Blc区域序列相同。
B3引物：下游外部引物 (Backward Outer Primer )，由B3区域组成， 和靶基因的B3c区域互补。
2．扩增原理
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温 度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。 因此，DNA在此温度下合成是可能的。利 用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA 聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自 我循环。
结合。开始链置换合成，解离出的单链核 酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的 B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA 合成延伸及链置换．
扩增分两个阶段
第2阶段是扩增循环阶段。 形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP
引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物 DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状 引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动 链置换合成，周而复始。
等温扩增是PCR的补充还是代替？？来看看他们的优劣势！
等温扩增是PCR的补充还是代替？？来看看他们的优劣势！近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于人类疾病的实验室检测中，等温扩增技术便是其中一种，与其他的核酸扩增技术相比，等温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用的设备，所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与PCR媲美的检测方法。
相信以等温核酸扩增技术为基础的诊断仪器和试剂盒的开发和应用会是未来一，二十年的方向。
本文总结了目前常见的等温核酸扩增技术：LAMP、NERA、NASBA、RCA、HDA、RPA和ERA。
同时对PCR和几种恒温核酸扩增技术进行了比较。
为了更好地有选择地开发利用这方面技术，现就这些等温扩增技术的原理、特点及应用进行简要总结。
聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（PCR）是利用耐高温的DNA聚合酶（Taq 酶），将模板DNA，引物，脱氧核苷三磷酸（dNTP）和缓冲液等在不同温度间循环，从而达到双链DNA分离，引物粘合到模板上的互补区间，最后在DNA聚合酶作用下脱氧核苷三磷酸逐个添加到新合成的DNA 链上的过程。
PCR是利用DNA 在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
环介导等温扩增 (LAMP )环介导等温扩增其扩增原理是基于DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链，在此前提下利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，在链置换型DNA聚合酶的作用下，以外侧引物区段的3`末端末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。
rpa等温扩增原理解析
rpa等温扩增原理解析RPA（等温扩增）原理解析1. 引言RPA（等温扩增）是一种基于循环介导核酸回路的核酸扩增技术，与PCR（聚合酶链式反应）相比具有许多优势。
本文将深入探讨RPA的原理、应用以及对该技术的观点和理解。
2. RPA原理RPA的目标是在等温条件下扩增特定的核酸序列。
其主要原理基于两个关键组分：寡核苷酸引物和核酸酶。
引物包括一个引导引物（primer）和两个酶拆分引物（probe），它们都与目标序列互补。
在反应开始时，引物与DNA模板的目标序列结合形成引物-模板复合物。
外源的核酸酶通过切割酶拆分引物的作用将其离解，并释放出一个能够启动下一轮循环的寡核苷酸。
这种循环迭代的过程可以产生大量的目标序列。
3. RPA优势和应用- 等温条件：RPA在等温条件下进行，无需复杂的温度循环设备，可以在简单的实验条件下进行。
- 灵敏度：由于循环介导核酸回路的特点，RPA对目标序列的敏感性较高，可以在极低的起始DNA模板浓度下有效扩增。
- 速度：与PCR相比，RPA具有更快的扩增速度，通常在15-60分钟内完成。
- 特异性：RPA可以通过引物设计实现高度特异性的扩增，避免了非特定性的产物形成。
- 简单性：RPA反应体系简单，操作方便，不需要复杂的实验步骤和设备。
RPA技术已广泛应用于许多领域，包括：- 分子诊断：RPA可以用于检测和诊断致病微生物的核酸标记，从而实现快速和准确的病原体检测。
- 食品安全：RPA可用于检测食品中的致病微生物或污染物，保障食品安全。
- 环境监测：RPA技术可用于检测环境中的微生物污染、环境污染物等，为环境监测提供快速准确的方法。
- 法医学：RPA可用于快速鉴定和识别DNA样本，为法医学病例提供科学依据。
4. 对RPA的观点和理解RPA作为等温核酸扩增技术的代表，具有许多优势，使其在分子生物学和临床诊断领域得到广泛应用。
RPA不仅具有灵敏度高、特异性强等优点，还具有操作简单、快速扩增等特点，使其成为一种理想的核酸扩增技术。
LAMP环介导等温扩增法技术临床应用
技术改进方向
提高反应灵敏度 提高扩增产物的特异性 提高自动化程度
降低反应时间 降低成本和操作难度 拓展应用领域
应用领域拓展
病原体检测：快速、 准确检测病原体，
提高诊断效率
环境监测：应用于 环境监测，提高环 境监测效率和准确
性
基因编辑：应用于 基因编辑技术，提 高基因编辑效率和
安全性
食品安全检测：应 用于食品安全检测， 提高食品安全检测
04
政策支持：政府加大对医疗 领域的投入，推动技术发展
感谢您的观看
利用LAMP酶，在 特定序列上进行链
置换扩增
扩增产物具有高度 特异性，可区分不
同病原体
扩增过程快速，可 在1小时内完成
适用于多种样本类 型，如血液、唾液、
组织等
技术优势
操作简便：无需昂 贵的仪器设备，可 在普通实验室进行
快速高效：反应时 间短，可在1小时 内完成扩增
灵敏度高：可检测 低浓度样本，适用 于临床诊断
LAMP环介导等温扩 增法技术临床应用
目录
LAMP LAMP LAMP
壹
术 原 理
环 介 导 等 温 扩 增 法 技
贰
术 临 床 应环 用介
导 等 温 扩 增 法 技
叁
术 发 展 前环 景介
导 等 温 扩 增 法 技
1
LAMP环介导等温 扩增法技术原理
工作原理
利用环介导等温扩 增技术，在恒温条 件下进行核酸扩增
特异性强：针对特定基因序列 设计引物，避免非特异性扩增
结果直观：扩增产物可直接通 过凝胶电泳或荧光定量PCR检 测
2
LAMP环介导等温 扩增法技术临床应 用
病原体检测
lamp原理
lamp原理和应用情况
LAMP 原理:
环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerasc)的作用下，60--65℃恒温扩增，15-60rain左右即可核酸扩增，效率可达109～10m个数量级，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。
在DNA合成时，从脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs) 中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。
因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。
由于LAMP反应不需要PCR 仪和昂贵的试剂，有着广泛的应用前景。
LAMP法的应用领域:
灵活运用能够简单、快速地进行基因扩增的特征,在各个领域得到广泛应用
食品领域:食物中毒致病菌的检测,食品的卫生管理,食物中毒的防止;
临床领域:病原菌、病毒的检测及鉴定,通过SNP多态性分型决定用药量;
农业领域:植物病害的早期发现及蔓延防止,转基因作物的检测;
环境领域:环境、水中病原微生物的检测;
工业领域:工业产品用大量DNA的生产成为可能;
畜牧业领域:雌雄性别判断,病原微生物的检测,遗传病的发现.。
转基因植物及其产品成分检测 环介导等温扩增方法制定指南
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转基因植物及其产品成分检测 环介导等温扩增方法制定指南
转基因植物及其产品成分检测环介导等温扩增方法制定指南1. 引言1.1 概述本篇文章旨在介绍转基因植物及其产品成分检测中的一种重要方法——环介导等温扩增，并制定相关操作指南。
转基因植物技术是现代生物技术领域的一个重要研究方向，通过引入外源基因改变植物的遗传特性，以实现对植物性状和品质的调控。
然而，随着转基因植物产品在市场上的广泛应用，对其合规性和安全性的检测也愈发重要。
目前，PCR技术是最常用于转基因植物及其产品成分检测的方法之一，但存在耗时长、复杂度高等问题。
相比之下，环介导等温扩增作为一种新兴的核酸扩增方法，在特异性、快速性、简便性以及成本效益上具有明显优势。
本文将详细介绍环介导等温扩增原理并制定相应操作指南，以期为广大科研工作者提供实验操作参考。
1.2 转基因植物简介转基因植物是通过人为手段将外源基因导入自然界中不存在的植物基因组中而产生的植物。
这些外源基因通过转化技术嵌入到植物细胞中，被遗传到下一代，并在整个生长过程中被表达出来。
转基因植物技术在农业、医药等领域具有广泛的应用前景，例如提高抗病虫害能力、改善产量和品质等。
然而，鉴别转基因植物及其产品成分的重要性日益凸显。
政府和国际组织对转基因食品进行严格管理与监控，以确保消费者的食品安全和权益。
因此，在有关立法和标签法规的约束下，开发可靠快速的检测方法是十分必要的。
1.3 环介导等温扩增方法简介环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）作为一种新兴的核酸扩增方法，由于其高度特异性、高效率、简单操作以及成本效益受到了广泛关注。
该方法利用DNA引物和Bst DNA聚合酶在等温条件下完成扩增反应，无需复杂设备与复杂试剂制备流程，大大降低了实验操作的难度。
环介导等温扩增方法通过特异性引物对目标序列进行扩增，将其从复杂样本中快速准确地检测出来。
该方法具有传统PCR技术无法比拟的优势，如高特异性、高灵敏度、快速反应速度和便捷实施等。
环介导等温扩增技术
环介导等温扩增技术（LAMP）法扩增
实时浊度检测或目视检测绿色荧光
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优缺点
• 优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）； 反应时间短（30～60分钟就能完成反应）；临床使用不需 要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浊度仪）；操 作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、 酶和模板混合于反应管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左 右保温30～60分钟，肉眼观察结果）。
其检测结果可直接肉眼观察白色沉淀 或者绿色荧光，是一种适合现场、基层快 速检测的方法。
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原理
扩增启动阶段 循环扩增阶段
延伸循环阶段
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扩增启动阶段
FIP F3
（5）:有1个环状构造（Fc1末端5’端游离） 的单链
BIP B3
（8）:有2个环状构造（F1末端即3’端游 离和Bc1末端即5’端游离）的单链
环介导等温扩增技术
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主要内容
• 定义 • 原理 • 操作步骤 • 优缺点及
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定义
环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是指在等 温（60-65℃）条件下，利用链置换DNA聚 合酶短时间（通常<1h）内进行核酸扩增， 是一种“简便、快速、精确、低价”的基 因扩增方法。
精品
• FIP
F1末端延伸至形成一个环状构造（B1末端即3’端游 离）；FIP 退火到茎环结构（8）上，引导链置换DNA 合 成反应，产生结构（9）的产物；随后产物（9）的B1末 端即3’ 端自动引导链置换DNA 的合成，生成产物(10） 和茎环结构（8’）（与开始的产物（8）序列互补的）；
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RCA 单引物等温扩增 SPIA 依赖解旋酶的等温扩增技术 HAD 链替代扩增 SDA 交叉引物扩增技术 CPA 核酸依赖性扩增检测技术 NASBA Qβ复制酶反应
NASBA SPIA HDA SDA
温度 ℃ 引物 42 需要2条
42 37/65 37/65 1条 需要2条 不需要
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，
DNA在65℃左右处于动态平衡状态。利用引物 合成的DNA链取代模板互补链。
①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特
性的Bst DNA聚合酶 ②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 ③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及 进行温度循环。
环介导等温扩增(Loop-mediated
isothermal amplification ,简称LAMP)是利用4个特殊设计 的引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,在 恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新 技术。 LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、 准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾 病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益 广泛的应用。
环介导等温扩增技术原理
烟雨莫问
等温扩增技术简介 等温扩增技术的应用前景 几种等温扩增技术比较 环介导的等温扩增技术原理 环介导的等温扩增演示 环介导的等温扩增检测
等温扩增技术(Isothermal Amplification
Technology)是核酸体外扩增技术，其反应过程 始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性 的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速 核酸扩增的目的。
模板 RNA
RNA DNA DNA
其他 反转录酶，RNA酶 H，T7RNA聚合酶 反转录酶，T7RNA 聚合酶
解旋酶，扩增片段 小
LAMP
RCA Qβ
63
37-65 37
4条
需要 不需要
DNADNΒιβλιοθήκη RNADNA聚合酶
LAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模 板的缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的 连续快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。 操作简单：只需一个水浴锅 快速高效：不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环 而造成 的时间损失 特异性强：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区 域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异 性极高。 高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数 量级的差异。 缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在 300 bp以内。>500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的 扩增。灵敏度高易造成假阳性结果。
形 成
LAMP
基 础 结 构
Effect of reaction time on the LAMP nes1,D NA marker(DL2000) with2000,1000,750 ,500,250 and 100bP:lanes2一 5,LAMP amPlification Produets for 15 min,30min,45min,6 0min,respectively:l ane6,without DNA template in the reaction. 乔岩梅. 炭疽芽孢杆菌特征基因恒温扩增检测方法的研究[D]. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
反应结束后对扩增产物的检测常使用焦磷酸酶沉淀检测 （浊度检测）、荧光检测、凝胶电泳检测等。 焦磷酸酶沉淀的检测（浊度检测）：在LAMP反应过程中， dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产 生副产物焦磷酸酶白色沉淀，研究者发现LAMP反应中焦 磷酸镁沉淀的形成与所产生的DNA量之间的关系，发现两 者生成量之间呈线性关系，并且焦磷酸镁沉淀在400 nm处 有吸收峰，从而进行LAMP的定量检测。 荧光检测：LAMP有极高的扩增效率，可在一小时内将靶 序列扩增至109～l010倍，所以当反应液中加入核酸染料 SYBR Green I后，在紫外灯或日光下通过肉眼即可进行判 定，如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持 SYBR Green I的橙色不变。
针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c 和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种 引物。 LAMP反应的开始阶段四条引物都被使用，但在循环阶段则 只有内引物被使用。 FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C 区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基 因5’端的Flc区域序列相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成， 并与靶基因的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和 B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与 靶基因5’端的Blc区域序列相同。 B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区 域组成，和靶基因的B3c区域互补。
引物BIP的B2与模板链B2c区互补配对，合成以BIP为起始的新链， 并与模板链互补形成DNA双链。同时，F端的环状结构将被打开， 外引物B3与模板上B3c杂交后，以其3’末端为起点也开始合成新链， 并使以BIP为起始的DNA单链从模板链上脱离下来，形成以FIP和 BIP为两端的单链。因为B1C与B1互补，F1C与F1互补，两端自然 发生碱基配对，这条游离于液体中的DNA单链分别在F和B末端形成 两个茎环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构，此结构即为LAMP 的基础结构。
与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要
求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足 快速简便的需求。
特异性高 分析速度快 成本低 突变率低 不需要升温降温过程，一台的加热器即可操作 检测核酸成分比检测微生物本身危险性小 方便诊断
环介导核酸等温扩增技术（LAMP） 滚环扩增技术
LAMP反应引物与对应模板区域
内引物FIP的F2与其模板的互补序列F2c结合，在Bst DNA聚合酶作用下，从F2的3’末端开始启动DNA合成， 合成一条以FIP为新的DNA单链并与模板链结合形成新 的双链DNA。
以F3为起始合成的新链与模板链形成双链。而原合成的以FIP 为起始的DNA单链被置换而脱离产生一单链DNA，其在5’末端 F1c和F1区发生自我碱基配对，形成茎环状结构。