核酸环介导等温扩增技术原理和引物设计和实例
环介导等温扩增技术
谢谢欣赏！
采自奶场的125份样品进行了检测。结果表明,LAMP检 测出阳性样品81份, GB/T 4789.10- 2003检测出阳性样品84 份,LAMP阳性检出率为96.43%。
图5 金黄色葡萄球菌LAMP特异性的检测结果
M:DL2000 DNA Marker; 1:金黄色葡萄球菌ATCC25923;2:沙门氏菌 CGMCC 111552; 3:沙门氏菌ATCC13067;4:沙门氏菌HJ- 004; 5: ETEC: 44247 (6∶15∶16) ;6: EPEC: 44706 (111∶58∶- ) ; 7:荧光假单胞菌 CGMCC 111802;8:恶臭假单胞菌CGMCC111819; 9:铜绿假单胞菌 ATCC27853;
散法、免疫学方法、基因芯片法、基因探针法、 测试片法、PCR 法等。
环介导恒温扩增技术( loop -mediated isothermal amp lification, LAMP)是Notomi等2000年发明的一种 新颖的扩增技术,其特点是针对靶基因的6个区域设计4 种特异引物,在DNA聚合酶(B st DNA polymerase)的 作用下,恒温条件下进行核酸扩增,具有操作简单、特异 性强特点。另外通过环引物的添加,大大加快了反应的 速度 。国外报道,LAMP被广泛食品等病原菌的检测中, 如巴西芽生菌、锥虫病 、沙门氏菌 、虾中的白斑综合
测金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间 短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄 球菌的新方法。
简介：金黄色葡萄球菌( S taphy lococcus
aureus)是引起食物中毒的主要致病菌之一,也是 引起奶牛患乳房炎的重要病原菌 ,在自然界中广 泛存在,食品受污染的机会很多。近年来随着抗 生素的大量使用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
LAMP环介导等温扩增法技术临床应用
技术改进方向
提高反应灵敏度 提高扩增产物的特异性 提高自动化程度
降低反应时间 降低成本和操作难度 拓展应用领域
应用领域拓展
病原体检测：快速、 准确检测病原体，
提高诊断效率
环境监测：应用于 环境监测，提高环 境监测效率和准确
性
基因编辑：应用于 基因编辑技术，提 高基因编辑效率和
安全性
食品安全检测：应 用于食品安全检测， 提高食品安全检测
04
政策支持：政府加大对医疗 领域的投入，推动技术发展
感谢您的观看
利用LAMP酶，在 特定序列上进行链
置换扩增
扩增产物具有高度 特异性，可区分不
同病原体
扩增过程快速，可 在1小时内完成
适用于多种样本类 型，如血液、唾液、
组织等
技术优势
操作简便：无需昂 贵的仪器设备，可 在普通实验室进行
快速高效：反应时 间短，可在1小时 内完成扩增
灵敏度高：可检测 低浓度样本，适用 于临床诊断
LAMP环介导等温扩 增法技术临床应用
目录
LAMP LAMP LAMP
壹
术 原 理
环 介 导 等 温 扩 增 法 技
贰
术 临 床 应环 用介
导 等 温 扩 增 法 技
叁
术 发 展 前环 景介
导 等 温 扩 增 法 技
1
LAMP环介导等温 扩增法技术原理
工作原理
利用环介导等温扩 增技术，在恒温条 件下进行核酸扩增
特异性强：针对特定基因序列 设计引物，避免非特异性扩增
结果直观：扩增产物可直接通 过凝胶电泳或荧光定量PCR检 测
2
LAMP环介导等温 扩增法技术临床应 用
病原体检测
核酸等温扩增技术及其应用
核酸等温扩增技术及其应用一、引言核酸等温扩增技术是一种新兴的分子生物学技术，其在生物医学研究、临床诊断和基因工程等领域具有重要应用价值。
本文将详细介绍核酸等温扩增技术的原理、方法和应用。
二、核酸等温扩增技术的原理核酸等温扩增技术是一种在恒温条件下进行的核酸扩增方法，通过利用逆转录酶和DNA聚合酶的活性，实现核酸的扩增。
其基本原理是通过逆转录酶将RNA模板转录成互补的DNA链，然后利用DNA聚合酶在恒温条件下合成新的DNA链。
这种等温扩增方法不需要复杂的温度变化，且具有较高的特异性和敏感性。
三、核酸等温扩增技术的方法核酸等温扩增技术主要包括RT-LAMP（逆转录环介导等温扩增法）和RPA（等温扩增法）。
RT-LAMP方法利用4-6个特异性的引物，在同一温度下通过逆转录酶和DNA聚合酶的协同作用，在短时间内扩增目标核酸。
RPA方法则利用DNA聚合酶和DNA单链结合蛋白在等温条件下，通过引物结合、DNA解旋、DNA聚合等步骤，实现核酸的扩增。
四、核酸等温扩增技术的应用1. 医学诊断：核酸等温扩增技术在医学诊断中有广泛应用。
例如，可以通过核酸等温扩增技术检测病毒、细菌和真菌等病原体，快速确认感染病原体的种类和数量，为临床治疗提供依据。
此外，核酸等温扩增技术还可以用于检测肿瘤标志物、遗传病突变等，为早期癌症和遗传病的筛查提供技术支持。
2. 食品安全检测：核酸等温扩增技术可以应用于食品安全检测领域。
例如，可以利用核酸等温扩增技术检测食品中的病原菌、转基因成分和食品中的传染性病毒等。
这种技术具有快速、灵敏和高效的特点，可以为食品安全监管提供重要依据。
3. 环境监测：核酸等温扩增技术在环境监测中也有广泛应用。
例如，可以利用核酸等温扩增技术检测水体、土壤和空气中的微生物，了解环境中的微生物多样性和污染程度。
此外，核酸等温扩增技术还可以用于环境污染源的追踪和监测。
4. 生物工程：核酸等温扩增技术在生物工程领域也有重要应用。
lamp原理
lamp原理和应用情况
LAMP 原理:
环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerasc)的作用下，60--65℃恒温扩增，15-60rain左右即可核酸扩增，效率可达109～10m个数量级，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。
在DNA合成时，从脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs) 中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。
因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。
由于LAMP反应不需要PCR 仪和昂贵的试剂，有着广泛的应用前景。
LAMP法的应用领域:
灵活运用能够简单、快速地进行基因扩增的特征,在各个领域得到广泛应用
食品领域:食物中毒致病菌的检测,食品的卫生管理,食物中毒的防止;
临床领域:病原菌、病毒的检测及鉴定,通过SNP多态性分型决定用药量;
农业领域:植物病害的早期发现及蔓延防止,转基因作物的检测;
环境领域:环境、水中病原微生物的检测;
工业领域:工业产品用大量DNA的生产成为可能;
畜牧业领域:雌雄性别判断,病原微生物的检测,遗传病的发现.。
核酸等温扩增课件
SAT技术的原理
SAT技术（Simultaneous Amplification and Testing）是基于TMA （Transcription mediated amplification）恒温扩增技术发展起来的一项最新 核酸检测技术，是国内企业自主研发的专利技术
SAT技术的优势
• 针对靶标核酸特异设计的引物和分子信标，实现特异性的 扩增和检测，有效防止假阴性结果。
IMSA扩增的优点
• IMSA 不仅拥有 LAMP 检测技术类似的应用优点， 在引物设计和扩增原理上还具有其独有的特点， 使得其具备比 LAMP 更高检测灵敏度的潜力。
• 该技术一定程度上能打破日本 LAMP 专利在我国 的应用限制，使其更好地服务于我国的传染病防 控、食品安全检测和环境物种保护等各个领域。
• 同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸（ RNA）的一个双链DNA拷贝，然后利用T7 RNA多聚酶从该 DNA拷贝上产生多个（100～1000个）RNA拷贝；每一个 RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带 有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。 该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，实时反映扩增循 环情况。
RPA技术
RPA技术简介
RPA（recombinase polymerase amplification）技术，2006年由剑 桥大学的Olaf Piepenburg等人建立。
该技术利用一种重组酶使单链引物与双链DNA模板中互补片段结 合，启动DNA复制；不需要DNA解链过程。
其具有便携，免去PCR仪等大型实验室设备的使用；快速，20分 钟内得到检测结果；灵敏度高，几个拷贝即可检出；便于保藏， 采用冻干粉末状酶等优点。
• • SAT检测的靶标核酸是RNA，而RNA在病原体外的环境中易
环介导等温扩增技术及其应用
Ｐｒ ｏ Байду номын сангаасｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎｅ
环 介 导 等 温 扩增 技 术 及 其 应 用
肖 璐 ， 邬 旭 龙 ， 王 印 ＇ ， 杨 泽 晓 ， 姚 学萍 。
ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ ， Ｆ Ｉ Ｐ）和 外 引 物 （ ｂ ａ ｃ ｋ ｗａ ｒ ｄ ｉ ｎ ｎ ｅ ｒ ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ ，
软件 在 线 设 计 引 物 ， 引 物分 内引物 （ ｆ ｏ ｒ ｗａ ｒ ｄ ｉ ｎ ｎ ｅ ｒ 结构和花椰菜样呈大小不一结构的 Ｄ ＮＡ 混 合
脂糖 凝 胶 电 泳 菌 均 显 示 ， Ｌ ＡＭＰ检 测 具 有 高 特 异
性， 仅 志 贺菌 和入侵 性肠 道杆 菌呈 现 阳性 ， 而其 他 肠 道菌 未 查 见 阳性 反 应 。 Ｌ ＡＭＰ的灵 敏 度 明 显 高 于
是在 反应 管 中加 入 Ｓ ＹＢ Ｒ Ｇｒ ｅ ｅ ｎ Ｉ染 料 ， 通 过 颜 色 的变 化进 行判 定 ， Ｌ ＡＭＰ阳性 反 应 管 在 紫外 照射 的
菌进 行 分离 培养 ， 直接 取 疑 似 患 病 动 物 病 变 组 织 进
行基 因扩增 ， 免 去 了常规 Ｐ Ｃ Ｒ检测 繁 琐 的核 酸提 取
而 提高 反应 的效率 。但 内引物浓 度太 高 是 否会 抑 制
扩 增反应 ， 目前 尚不 清楚 ， 仍 需 进 一 步 的探 究 ， 以设 计最 适 引物 浓 度 以确 保 反 应 快 速 高 效 进 行 。另 外 ， Ｂ ｓ ｔ 聚合 酶促 进 整个 Ｌ ＡＭＰ反应 ， 其 浓 度 也 可 影 响
环介导等温扩增技术
环介导等温扩增技术（LAMP）法扩增
实时浊度检测或目视检测绿色荧光
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优缺点
• 优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）； 反应时间短（30～60分钟就能完成反应）；临床使用不需 要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浊度仪）；操 作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、 酶和模板混合于反应管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左 右保温30～60分钟，肉眼观察结果）。
其检测结果可直接肉眼观察白色沉淀 或者绿色荧光，是一种适合现场、基层快 速检测的方法。
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原理
扩增启动阶段 循环扩增阶段
延伸循环阶段
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扩增启动阶段
FIP F3
（5）:有1个环状构造（Fc1末端5’端游离） 的单链
BIP B3
（8）:有2个环状构造（F1末端即3’端游 离和Bc1末端即5’端游离）的单链
环介导等温扩增技术
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主要内容
• 定义 • 原理 • 操作步骤 • 优缺点及
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定义
环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是指在等 温（60-65℃）条件下，利用链置换DNA聚 合酶短时间（通常<1h）内进行核酸扩增， 是一种“简便、快速、精确、低价”的基 因扩增方法。
精品
• FIP
F1末端延伸至形成一个环状构造（B1末端即3’端游 离）；FIP 退火到茎环结构（8）上，引导链置换DNA 合 成反应，产生结构（9）的产物；随后产物（9）的B1末 端即3’ 端自动引导链置换DNA 的合成，生成产物(10） 和茎环结构（8’）（与开始的产物（8）序列互补的）；
环介导等温扩增技术及其在病原微生物检测中的应用
环介导等温扩增技术及其在病原微生物检测中的应用循环介导温扩增技术（Cycling Primer Extension, CPE）是一种高效的分子生物学技术，主要用于基因、控制序列、表达调控物质和相关蛋白质之间的相互作用分析。
它常被应用于病原性微生物检测以及病毒基因分子变异分析等方面。
一、循环介导温扩增技术的原理循环介导温扩增技术是一种改良的PCR技术，它能将DNA模板扩增成上百万亿倍左右的数量，以满足分子生物学研究的需要。
该技术的基本原理是将待检测模板上特异性引物结合，并施加高温、低温及中间温度等三种温度环境，在低温下用引物扩增模板，并在特定温度中支配引物限制片段扩增，最后在v高温环境中扩增产物释放，从而通过三种温度环境积累构建双螺旋样的DNA桥梁而达到扩增的目的。
二、循环介导温扩增技术的优势（1）快速、灵敏：循环介导温扩增技术利用低温度和高温度振荡循环，大大提高了扩增速度，并且增强了信号效率，可以充分利用模板，进而提高检测灵敏度。
（2）省时省钱：循环介导温扩增技术使用到的耗材比PCR来得少，扩增速度更快，是一种省时省钱的技术。
（3）容易操作：CPE程序简单，操作过程相对PCR要简单，与实验室常规仪器一般可以完成，且实验室中的反应条件也相对简单，不存在PCR实验中的活性危险，也不存在贴壁细菌和操作技术考验棘手的问题。
三、循环介导温扩增技术在病原微生物检测中的应用（1）病毒检测：CPE技术可以快速灵敏地检测SARS-CoV-2病毒，从而帮助监测新型冠状病毒的传播趋势。
（2）细菌检测：CPE技术可以检测各种细菌产生的毒力因子，如真菌毒素和E. Coli有毒因子。
（3）NDM-1耐药基因及AMR的表型检测：NDM-1耐药基因和AMR 抗药菌的表型检测，可以快速确定环境中微生物的耐药基因断裂和AMR抗药菌表型，为后续的抗药策略的分析提供了依据。
四、总结循环介导温扩增技术灵活、方便，既可以用于病毒检测，也可以用于细菌检测，此外，它还可以用于耐药基因及抗药性表型的检测。
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核酸环介导等温扩增技术原理及引物设计与实例
1．LAMP引物的设计：
LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F 3c、F2c和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。
FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。
F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因
的F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3’ 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。
B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基
因的B3c区域互补。
如图所示：
2．扩增原理
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。
因此，DNA在此温度下合成是可能的。
利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。
使得链置换DNA合成在不停地自我循环。
扩增分两个阶段。
第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。
上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c 结合（如图B所示），在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。
外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链（如图C 所示）。
FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。
自我碱基配对形成环状结构（如图C所示）。
以此链为模板。
下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。
迅速以3’末端的Fl区段为起点．以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。
该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。
第2阶段是扩增循环阶段。
以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。
开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。
迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。
进行DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。
启动新一轮扩增。
且产物DNA 长度增加一倍。
在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结
构结合启动链置换合成，周而复始。
扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。
且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。
3 LAMP的特点
LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点：
(1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。
对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT．LAMP)，不需要特殊的试剂
及仪器。
(2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成
的时间损失．核酸扩增在l h内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1／2，多数情况在20。
30 rain均可检测到扩增产物。
且产物可以扩增至109倍，达0.5 mg／mL．应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。
(3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。
6个区域中
任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。
故其特异性极高。
(4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。
缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300 bp以内。
>500 bp则较难扩增。
故不能进行长链DNA的扩增。
由于灵敏度高。
极易受到污染而产
生假阳性结果。
故要特别注意严谨操作，以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离
方面均逊色于传统的PCR方法。
4 引物设计实例
LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)，只要导入靶基因就能自
动生成成组引物。
以某一微生物的鞭毛基因为例讲解一下LAMP相物设计的过程：首先单击浏览按钮选择靶基因序列文件，靶序列默认的是小于2 2 kbp。
支持三个类型的文件，普通文本格式（仅含序列）, FASTA格式和GenBank 格式文件。
第二，从下面三个选项中选择定参数设定（引物设计条件）条件。
基于GC含量的自动判断, 起始的参数是特定的：如果GC含量小于或等于45%.，则选取AT 丰度高的区,如果GC含量高于60%，则选取GC丰度高的区,其它情况是标准设定
状态。