微生物基因工程培训讲义
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基因工程专题知识讲座
基因工程专题知识讲座
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基因工程专题知识讲座
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5´ 内切酶 3´
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(recBCD)
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内切酶
(recBCD)
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DNA侵扰 (recA)
基因工程专题知识讲座
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一、同源重组
发生在同源序列间重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基础重组。 是最基础DNA重组方式，经过链断裂和再连 接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或 双链片段交换。
以E.coli同源重组为例，了解同源重组机 制Holliday模型。
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DNA 5´
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Holiday中间体
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内切酶
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5´ 3´ 基因工程专题知识讲座
基因工程专题知识讲座
基因工程专题知识讲座
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第一节
基因工程第三章 微生物基因工程
基 因 工 程 GENE ENGINEERING
2、重组异源蛋白包含体表达系统的构建
方法：将外源基因插入到原核表达载体强启动子和有效的SD 序列的下游，表达产物位于胞内，氨基端和羧基端不含有其 他蛋白或多肽序列。
启动子和SD序列可通过一般的重组，PCR扩增甚至化学合成 等方法将两者按照最佳距离及碱基序列连为一体，组成大肠 杆菌表达复合元件。问题是外源基因如何与这类表达复合元 件拼接克隆，才能尽量避免在SD序列与外源基因的起始密码 子之间引入过多的碱基对。（图3-5）
二、大肠杆菌工程菌的构建策略
导致异源重组蛋白在大肠杆菌中不稳定的主要因素有： ①大肠杆菌缺乏针对异源重组蛋白的折叠复性和翻译后加 工系统。 ②大肠杆菌不具备真核细胞完善的亚细胞结构以及众多的 稳定因子。 ③高效表达的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度 的微环境。
基 因 工 程 GENE ENGINEERING
基 因 工 程 GENE ENGINEERING
胰岛素原
19 20
胰岛素
6
7
11 7 基 因 工 程 GENE ENGINEERING
人胰岛素的生产方法
1. 从人的胰中直接提取胰岛素。
2. 由单个氨基酸直接化学合成。 3. 由猪胰岛素化学转型为人胰岛素 4.利用基因工程菌大规模发酵生产重组人胰岛素。
基 因 工 程 GENE ENGINEERING
2、整合型异源蛋白的表达 阻止重组质粒丢失的方法有： ①对于实验规模而言，将克隆菌置于含有筛选试剂的培养基中 生长，这样可以有效地控制丢失质粒的细菌繁殖速度，维持培 养物中克隆菌的绝对优势。 ②将外源基因直接整合在受体细胞染色体DNA的特定位置上， 使之成为染色体DNA的一个组成部分，从而增加其稳定性。
2、重组异源蛋白包含体表达系统的构建
方法：将外源基因插入到原核表达载体强启动子和有效的SD 序列的下游，表达产物位于胞内，氨基端和羧基端不含有其 他蛋白或多肽序列。
启动子和SD序列可通过一般的重组，PCR扩增甚至化学合成 等方法将两者按照最佳距离及碱基序列连为一体，组成大肠 杆菌表达复合元件。问题是外源基因如何与这类表达复合元 件拼接克隆，才能尽量避免在SD序列与外源基因的起始密码 子之间引入过多的碱基对。（图3-5）
二、大肠杆菌工程菌的构建策略
导致异源重组蛋白在大肠杆菌中不稳定的主要因素有： ①大肠杆菌缺乏针对异源重组蛋白的折叠复性和翻译后加 工系统。 ②大肠杆菌不具备真核细胞完善的亚细胞结构以及众多的 稳定因子。 ③高效表达的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度 的微环境。
基 因 工 程 GENE ENGINEERING
基 因 工 程 GENE ENGINEERING
胰岛素原
19 20
胰岛素
6
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11 7 基 因 工 程 GENE ENGINEERING
人胰岛素的生产方法
1. 从人的胰中直接提取胰岛素。
2. 由单个氨基酸直接化学合成。 3. 由猪胰岛素化学转型为人胰岛素 4.利用基因工程菌大规模发酵生产重组人胰岛素。
基 因 工 程 GENE ENGINEERING
2、整合型异源蛋白的表达 阻止重组质粒丢失的方法有： ①对于实验规模而言，将克隆菌置于含有筛选试剂的培养基中 生长，这样可以有效地控制丢失质粒的细菌繁殖速度，维持培 养物中克隆菌的绝对优势。 ②将外源基因直接整合在受体细胞染色体DNA的特定位置上， 使之成为染色体DNA的一个组成部分，从而增加其稳定性。
基因工程与生物技术行业培训资料
生物技术的应用前景
在未来的发展趋势中，生物技术将成为推动社会 进步和经济发展的重要引擎。科技创新与产业转 型将催生出更多生物技术的应用领域，为人类创 造更美好的生活。
● 06
第六章 总结
基因工程与生物 技术的重要性
基因工程与生物技术 已经成为现代科技的 重要支柱，对医学、 农业、环保等领域起 到了不可替代的作用。 通过基因工程技术， 人类可以实现对基因 的编辑和调控，从而 研发新药、改良农作 物、解决环境问题， 推动社会的发展与进 步。
基因编辑技术在药物研发中的应用
精准编辑基因
靶向治疗
药物研发
未来前景
基因编辑技术如CRISPRCas9可以精确编辑人类基 因，修复遗传疾病的基因 突变，为治疗疾病提供了 新的方向。
基因编辑技术可针对特定 疾病相关基因进行修饰， 实现精准治疗，提高疗效 并减少副作用。
基因编辑技术可以加速药 物研发过程，提高药物的 安全性和有效性，为新药 的开发提供了新的解决方 案。
品质提升
优化猪肉口感 改善家禽蛋品质
健康监控
抗疾病能力提升 改良乳制品质
繁殖效率
提高繁殖率 改善后代品质
基因工程的环境 影响评估
基因工程在农业领域 应用的同时，也需要 进行环境影响评估， 确保转基因农产品对 环境和人类健康的安 全。这一过程需要严 格监管和科学评估， 以维护生态平衡和人 类健康。
基因工程的作用与挑战
概述基因工程与生物技术
基因工程与生物技术是通过对生物体的基因进行 操作和改造，达到改变生物特性或生产工业品的 目的。这一领域在医药、农业和食品行业等各个 领域均有广泛应用。
基因工程的历史与发展
起源于20世 纪70年代的 基因工程已 经经历多次 重要突破。
基因工程和生物技术行业培训资料
基因工程和生物技术行业培 训资料
汇报人：XX
2024-01-11
• 基因工程概述 • 生物技术基础知识 • 基因工程与生物技术关系 • 基因工程实验操作技能培训 • 生物技术实验操作技能培训 • 行业前沿动态与趋势分析
01
基因工程概述
基因工程定义与发展
基因工程定义
基因工程是通过对生物体的遗传物质进行直接操作，以改变其遗传性状的一门 技术。它涉及将外源基因导入受体细胞，以获得具有新遗传特性的生物体。
随着基因工程和生物技术的广泛应用，生 物安全问题将日益突出，需要加强相关法 规和技术标准的建设。
04
基因工程实验操作技能培训
DNA提取、纯化及鉴定方法
01
DNA提取方法
介绍常用的DNA提取方法，如酚氯仿法、试剂盒法等，以及不同样本
类型（如血液、组织、细胞等）的DNA提取注意事项。
02
DNA纯化技术
抗体制备与纯化
熟悉抗体的类型和制备原理，掌 握多克隆抗体和单克隆抗体的制 备方法。了解抗体纯化的技术， 如亲和层析、凝胶电泳等。
免疫检测技术
掌握免疫学检测技术，如酶联免 疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光 技术、免疫组化技术等。了解其 在生物医学研究中的应用。
免疫学实验设计与
分析
了解免疫学实验设计的原则和方 法，掌握实验数据的处理和分析 技巧。熟悉免疫学相关软件的使 用，如流式细胞术数据分析软件 等。
医学领域
基因工程在医学领域的应用包括基因 诊断、基因治疗、生物制药等。例如 ，利用基因工程技术生产重组蛋白药 物、基因疫苗等。
基因工程伦理与法律问题
伦理问题
基因工程涉及对生命体的干预和改造，可能引发一系列伦理 问题，如人类尊严、生命价值、生态安全等。因此，在进行 基因工程研究时，需要遵循伦理原则，尊重生命和生态平衡 。
汇报人：XX
2024-01-11
• 基因工程概述 • 生物技术基础知识 • 基因工程与生物技术关系 • 基因工程实验操作技能培训 • 生物技术实验操作技能培训 • 行业前沿动态与趋势分析
01
基因工程概述
基因工程定义与发展
基因工程定义
基因工程是通过对生物体的遗传物质进行直接操作，以改变其遗传性状的一门 技术。它涉及将外源基因导入受体细胞，以获得具有新遗传特性的生物体。
随着基因工程和生物技术的广泛应用，生 物安全问题将日益突出，需要加强相关法 规和技术标准的建设。
04
基因工程实验操作技能培训
DNA提取、纯化及鉴定方法
01
DNA提取方法
介绍常用的DNA提取方法，如酚氯仿法、试剂盒法等，以及不同样本
类型（如血液、组织、细胞等）的DNA提取注意事项。
02
DNA纯化技术
抗体制备与纯化
熟悉抗体的类型和制备原理，掌 握多克隆抗体和单克隆抗体的制 备方法。了解抗体纯化的技术， 如亲和层析、凝胶电泳等。
免疫检测技术
掌握免疫学检测技术，如酶联免 疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光 技术、免疫组化技术等。了解其 在生物医学研究中的应用。
免疫学实验设计与
分析
了解免疫学实验设计的原则和方 法，掌握实验数据的处理和分析 技巧。熟悉免疫学相关软件的使 用，如流式细胞术数据分析软件 等。
医学领域
基因工程在医学领域的应用包括基因 诊断、基因治疗、生物制药等。例如 ，利用基因工程技术生产重组蛋白药 物、基因疫苗等。
基因工程伦理与法律问题
伦理问题
基因工程涉及对生命体的干预和改造，可能引发一系列伦理 问题，如人类尊严、生命价值、生态安全等。因此，在进行 基因工程研究时，需要遵循伦理原则，尊重生命和生态平衡 。
基因工程的基本内容学习教材PPT课件
在获取真核细胞中的目的基因时,一般 用人工合成基因的方法.
• 哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？ 1）DNA序列自动测序仪： 对提取出来的 基因进行核苷酸 序列分析。 2）PCR技术： 使目的基因的片段 在短时间内成百万倍 地扩增。
• 步骤二：目的基因与运载体重组
1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现 一个切口，露出黏性末端。 2）用同一种限制酶切断目的基因，使其 产生相同的黏性末端。 3）将切下的目的基因片段插入质粒的切 口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一 个重组DNA分子（重组质粒） 目的基因与运载体的结合过程，实际 上是不同来源的基因重组的过程。
• 外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细 胞(如棉花细胞)？ 导入过程需要运输工具——运载体。 • 运载体的作用有哪些？ 作用一：作为运载工具，将外源基因(抗虫基 因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。 作用二：利用运载体在受体细胞(棉花细胞) 内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。
• 作为运载体必须具备哪些条件？ 1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。
2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。
3）具有某些标记基因，便于进行筛选。 如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应 的基因等。
常用的运载体主要有两类： 1）细菌细胞质的质粒 2）噬菌体或某些动植物病毒
• 质粒： 质粒是染色体外能够进行自主复制的 遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌 细胞中核区外的DNA分子。现在习惯上用 来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核 以外的DNA分子。 质粒是基因工程最常用的运载体。 绝大多数细菌质粒都是闭合环状DNA 分子。有的一个细菌中有一个，有的一个 细菌中有多个。
大量的目的基因
• 步骤四：目的基因的检测和表达
微生物学第八章微生物和基因工程PPT讲稿
基于以上事实，宿主细胞的生长和外源基因的表达应该分成两 个阶段进行。第一阶段使含有外源基因的宿主细胞迅速生长直至 获得足够量的细胞。第二阶段是启动开关，使所有细胞外源基因 同时高效表达，产生大量有价值的表达产物。
在原核基因表达调控中，阻遏蛋白－操纵基因系统起着重要调节开关的 作用。当阻遏蛋白与操纵基因相结合时，能够阻止基因的转录。加入诱导 物，使其与阻遏蛋白结合，解除阻遏，从而启动基因转录。
通过基因工程改造后的菌株被称为“工程 菌”。
现在您浏览的位置是第四页，共七十六页。
基因工程是一门崭新的生物技术。 它的出现标志着人类已经能够 按照自己意愿进行各种基因操 作，大规模生产基因产物，并 可设计和创建新的蛋白质和新 的生物物种。
现在您浏览的位置是第五页，共七十六页。
DNA的特异切割、DNA分子克隆、
噬菌体质粒载体在应用上具有许多优点： ① 载体本身分子小，约为3 000bp，便于分离和操作； ② 克隆外源DNA容量较M13噬菌体载体大，可克隆10kb外源DNA片段； ③ 可用于制备单链或双链DNA，克隆和表达外源基因。
现在您浏览的位置是第十八页，共七十六页。
6、真核生物的克隆载体
真核生物载体，主要有以下几大类：
DNA快速测序这三项技术的建立 为基因工程奠定了基础。
现在您浏览的位置是第六页，共七十六页。
第一节 微生物与基因工程的关系
•
微生物与和技术。
微生物在基因工程中的兴起和发展过程中起着
不可替代的作用。可以说一切基因工程操作都
离不开微生物。
现在您浏览的位置是第七页，共七十六页。
3、柯斯质粒载体
柯斯质粒载体（cosmid vector）即粘粒载体，是由λ噬菌体的粘性末端和质粒 构建而成。柯斯质粒载体含有来自质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多 个限制酶单一位点，以及来自λ噬菌体粘性末端的DNA片段，即cos位点，其对于 将DNA包装成λ噬菌体粒子是必需的。
在原核基因表达调控中，阻遏蛋白－操纵基因系统起着重要调节开关的 作用。当阻遏蛋白与操纵基因相结合时，能够阻止基因的转录。加入诱导 物，使其与阻遏蛋白结合，解除阻遏，从而启动基因转录。
通过基因工程改造后的菌株被称为“工程 菌”。
现在您浏览的位置是第四页，共七十六页。
基因工程是一门崭新的生物技术。 它的出现标志着人类已经能够 按照自己意愿进行各种基因操 作，大规模生产基因产物，并 可设计和创建新的蛋白质和新 的生物物种。
现在您浏览的位置是第五页，共七十六页。
DNA的特异切割、DNA分子克隆、
噬菌体质粒载体在应用上具有许多优点： ① 载体本身分子小，约为3 000bp，便于分离和操作； ② 克隆外源DNA容量较M13噬菌体载体大，可克隆10kb外源DNA片段； ③ 可用于制备单链或双链DNA，克隆和表达外源基因。
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6、真核生物的克隆载体
真核生物载体，主要有以下几大类：
DNA快速测序这三项技术的建立 为基因工程奠定了基础。
现在您浏览的位置是第六页，共七十六页。
第一节 微生物与基因工程的关系
•
微生物与和技术。
微生物在基因工程中的兴起和发展过程中起着
不可替代的作用。可以说一切基因工程操作都
离不开微生物。
现在您浏览的位置是第七页，共七十六页。
3、柯斯质粒载体
柯斯质粒载体（cosmid vector）即粘粒载体，是由λ噬菌体的粘性末端和质粒 构建而成。柯斯质粒载体含有来自质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多 个限制酶单一位点，以及来自λ噬菌体粘性末端的DNA片段，即cos位点，其对于 将DNA包装成λ噬菌体粒子是必需的。
《微生物基因工程》课件
02
微生物基因工程的基本技 术
基因克隆技术基ຫໍສະໝຸດ 克隆技术定义基因克隆技术是一种将特定基因或基因片段分离出来，并在体外进行复制、剪切、拼接等 操作，最终将重组的基因或基因片段导入受体细胞，实现基因的体外操作和扩增的技术。
基因克隆技术原理
基因克隆技术的核心原理是DNA的半保留复制。通过将外源DNA片段插入到载体DNA中 ，形成重组DNA，然后将重组DNA导入到宿主细胞中，实现外源DNA的扩增。
利用基因工程改造微生物，提高生物 燃料的产量和效率，降低生产成本。
药物生产
通过基因工程手段改良微生物，实现 高效的药物生产，降低生产成本。
环境保护
利用基因工程改造微生物，提高污染 物的降解效率和速度，降低环境污染 。
农业领域
通过基因工程手段改良农作物，提高 农作物的抗逆性和产量，改善农业生 产效益。
改良农作物优点
通过基因工程技术，可以提高农作物的抗逆性、产量和品 质，为农业生产的发展做出贡献。
改良农作物挑战
改良农作物需要经过严格的试验和审批，确保安全性、有效性和 可持续性。同时需要加强农业技术的推广和应用，提高农民的素
质和能力。
04
微生物基因工程的前景与 挑战
微生物基因工程的发展前景
生物燃料
基因操作技术
包括基因克隆、转化、表达等关键技 术，是实现基因工程应用的基础。
微生物基因工程的历史与发展
起源
20世纪70年代，随着DNA双螺旋结构的发现和分子生物学的兴起 ，基因工程技术开始起步。
发展历程
经历了从简单到复杂、从单一到多基因的转化，技术不断进步，应 用领域不断扩大。
未来展望
随着基因编辑技术的发展，微生物基因工程将更加精准、高效，有 望在生物医药、生物能源等领域发挥更大作用。
基因工程的原理和技术讲解培训课件
二、基因工程操作步骤：
1.第一步：目的CR)技术扩增目的 基因（目的基因的序列已知） ③化学方法合成目的基因（目的基因的序列 已知）
本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依
将含有某种生物不同基 因的许多DNA片断，导入受 体菌的群体储存，各个受体 菌
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②利用PCR处技，请术联扩系网增站或目本的人删基除。因
聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基 因。
在此基础上，怎样鉴别已导入重组质粒的细胞？
抗氨苄青霉素基因
四环素抗性基因
α点为目的基因与 质粒A的结合点
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图a示基因工程中经处常，选请联用系的网载站体或—本人—删除。 Ampr
pBR322质粒，Ampr表示氨苄青霉素抗
性基因，Tetr表示四环素抗性基因。目的
四环素抗性基因
抗氨苄青霉素基因
α点为目的基因与 质粒A的结合点
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4.筛选含有目处的，请基联系因网的站或受本体人删细除。胞
怎样筛选出已经导入质粒的细胞？
四环素抗性基因
抗氨苄青霉素基因
α点为目的基因与 质粒A的结合点
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第二节 基因工程的原理和技术
一、教学目标： 1.了解基因工程的基本原理。 2.描述重组DNA技术的基本步骤。 二、教学重点、难点： 基因工程的基本原理和基本操作步骤。
1.第一步：目的CR)技术扩增目的 基因（目的基因的序列已知） ③化学方法合成目的基因（目的基因的序列 已知）
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将含有某种生物不同基 因的许多DNA片断，导入受 体菌的群体储存，各个受体 菌
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②利用PCR处技，请术联扩系网增站或目本的人删基除。因
聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基 因。
在此基础上，怎样鉴别已导入重组质粒的细胞？
抗氨苄青霉素基因
四环素抗性基因
α点为目的基因与 质粒A的结合点
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pBR322质粒，Ampr表示氨苄青霉素抗
性基因，Tetr表示四环素抗性基因。目的
四环素抗性基因
抗氨苄青霉素基因
α点为目的基因与 质粒A的结合点
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4.筛选含有目处的，请基联系因网的站或受本体人删细除。胞
怎样筛选出已经导入质粒的细胞？
四环素抗性基因
抗氨苄青霉素基因
α点为目的基因与 质粒A的结合点
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第二节 基因工程的原理和技术
一、教学目标： 1.了解基因工程的基本原理。 2.描述重组DNA技术的基本步骤。 二、教学重点、难点： 基因工程的基本原理和基本操作步骤。
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原核表达系统的优点
• 1、细菌培养操作简单、生长繁殖快、价格 低廉；
• 2、外源基因表达产物的水平高( 如大肠杆 菌中目的蛋白的表达量可超过细菌总蛋白 量的80%) ；
• 3、基因背景和表达特性清楚。
大肠杆菌表达系统
• 自20 世纪70 年代以来, 大肠杆菌一直是基 因工程中应用最为广泛的表达系统。尤其 是进入后基因组时代以来, 有关蛋白结构以 及功能研究的开展, 对基因表达的要求更高,
微生物基因工程
李刚副教授
教学内容
• 一酶制剂研究中
• 的应用； 四、原核表达系统的选择和高效表达策略；
• 五、真核表达系统的选择和高效表达策略。
四、原核表达系统的选择和高效表达策略
原核生物表达系统主要包括： 大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、 链霉菌表达系统等, 其中应用最广泛的是大 肠杆菌表达系统。
• 这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。
大肠杆菌表达系统的优缺点
• 优点： • 大肠杆菌具有培养条件简单、生长繁殖快、安全
性好、 • 可以高效表达不同外源基因产物等特点, 是许多外
源基因 • 表达系统中最好的一种, 是目前研究最深入、发展
也最完善的表达系统, 大量的有价值的多肽和蛋白 质已在大肠杆菌中获得了超量表达。 • 缺点： • 大肠杆菌表达体系与其他表达体系相比, 也具有一 些缺 • 点: ①高效表达易形成包涵体。②不能进行翻译
大肠杆菌表达系统的操作流程
大肠杆菌表达系统操作的一般程序如下： 获得目的基因－准备表达载体－将目的
基因插入表达载体中（测序验证）－转化 表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋 白的分析－扩增、纯化、进一步检测。
大肠杆菌表达系统的基本概念
• 首先讲述一些大肠杆菌表达的基本概念：一个完 整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌 株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果 是融合表达还包括纯化系统或者检测等等。选择 表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达 量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法 等等。主要归结在表达载体的选择上。
• 转录终止子对外源基因在大肠杆菌中的高效上异常表达导 致质粒稳定性下降。放在启动子上游的转录终止子还可以防 止其他启动子的通读，降低本底。转录终止子有两类，分别 是因子作用下使转录终止的终止子和根据模版上的对称序列 形成发夹结构而终止转录的终止子。常见的是 、操纵子的 T1T2串连转录终止子。
• 诱导调控型表达：表达载体采用诱导型启动子， 只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。 这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体 生长的影响，又可减少菌体蛋白酶对目标产物的 降解。特别适合解决有毒蛋白的表达。另外也有 启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶 是诱导表达的，也属于诱导表达系统。
大肠杆菌表达系统的几种表达方式
• 融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（），表达 产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤 或者检测。对于特别小的分子建议用较大的（如）以获得稳定表达； 而一般的基因多选择小以减少对目的蛋白的影响。是最广泛采用的。
• 分泌表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋 白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长， 或者形成包涵体，而且表达产物通常是可溶的活性状态，不需要复性。 通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。
大肠杆菌表达系统的基本概念
• 对于做表达来说，如果不是要研究启动子的强弱，通常比较 少关心或者用到报告基因吧。绿色荧光蛋白是最常用的报告 基因了（注意选择适用原核表达版本的），其他还有半乳糖 苷酶，荧光素酶等等。一些融合表达也有报告基因的功能。 启动子、终止子和核糖体结合位点： 启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。 从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。和，和， T7是最常用的启动子。
大肠杆菌表达系统的基本概念
• 复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。101类质粒是严谨 方式复制，拷贝数低，1，()类的复制子的拷贝数高达500以上，是表 达载体常用的。通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关， 当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。 如果碰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元是否相容的问题。 筛选标记和报告基因：氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记，卡那霉 素或者是新霉素次之，四环素，红霉素和氯霉素等已经日渐式微。抗 性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要 留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。在表达筛选中要注意 的问题应该就是倒板前加抗生素的温度，温度过高容易导致抗生素失 效。今天耐青霉素的超级细菌泛滥，不知道是否有我们实验人员的功 劳呢？大家“随便倒掉”已经获得氨苄抗性的大肠杆菌之前有没有经 过煮沸或者消毒等处理呢？从以前的一针50万单位到现在100多万个 单位，青霉素剂量似乎越来越大了。
大肠杆菌表达系统的基本概念
• 核糖体结合位点：启动子下游从转录起始 位点开始延伸的一段碱基序列，其中能与 16S亚基3'端互补的序列对形成翻译起始复 合物是必需的，多数载体启动子下游都有 序列，也有些载体没有，适合自带序列的 基因表达，要留意。
大肠杆菌表达系统的几种表达方式
• 组成型表达：表达载体的启动子为组成型启动子， 也就是一直努力不停表达目的蛋白的启动子，如 系统。持续性表达通常表达量比较高，成本低， 但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。 因为过量或者有害的表达产物会影响细菌的生长， 反过来影响表达量的积累。
• 表达载体：我们关心的质粒上的元件包括启动子， 多克隆位点，终止密码，融合（如果有的话）， 复制子，筛选标记/报告基因等。通常，载体很贵， 我们可以通过实验室之间交换得到免费的载体。 但是要小心，辗转多个实验室和多个实验室成员 之手的载体是否保持原来的遗传背景？是否还是 原来那个？是我们要特别注意的。