在毕赤酵母中表达的重组疟疾疫苗(PfCP-2.9)的纯化研究

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在毕赤酵母中高效表达重组猪表皮生长因子的方法[发明专利]

专利名称：在毕赤酵母中高效表达重组猪表皮生长因子的方法专利类型：发明专利
发明人：李巨浪,伊芬娜,刘璨颖
申请号：CN201710452655.6
申请日：20170615
公开号：CN107365374A
公开日：
20171121
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种在毕赤酵母中高效表达重组猪表皮生长因子的方法，其包括如下步骤：(1)构建重组猪EGF表达载体；(2)用重组质粒pJ912‑pEGF电转化毕赤酵母X‑33；(3)生物发酵表达猪EGF。

本发明的方法能够在毕赤酵母中高效表达重组猪表皮生长因子。

申请人：佛山科学技术学院
地址：528000 广东省佛山市禅城区张槎街道江湾一路18号
国籍：CN
代理机构：广州新诺专利商标事务所有限公司
代理人：许英伟
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BMP4重组蛋白在毕赤酵母中表达载体构建与纯化分析

BMP4重组蛋白在毕赤酵母中表达载体构建与纯化分析
赵卓;籍昊天;肖业臣
【期刊名称】《东北师大学报:自然科学版》
【年(卷),期】2022(54)1
【摘要】以骨形态发生蛋白(BMP4)为研究对象,将BMP4基因与IgG-Fc基因结合,改造成为BMP4-Fc融合蛋白,经巴斯德毕赤酵母诱导表达和DEAE阴离子纯化获得目的蛋白,并利用间充质干细胞验证了其生理活性.结果表明:使用巴斯德毕赤酵母能够很好表达BMP4-Fc融合蛋白,通过提纯条件,成功分离纯化BMP4-Fc融合蛋白,其生理活性达到商业化纯品水平,为BMP4生产与开发提供了新路径.
【总页数】6页(P113-118)
【作者】赵卓;籍昊天;肖业臣
【作者单位】吉林师范大学生命科学学院;吉林大学基础医学院生物化学与分子生物学系
【正文语种】中文
【中图分类】Q786
【相关文献】
1.重组hIL-2表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达
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4.重组水貂生长激素真核表达载体的构建及在巴斯德毕赤酵母中的表达
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人ω干扰素在毕赤酵母中的表达和纯化

人ω干扰素在毕赤酵母中的表达和纯化蒙翠凤;饶晓璐;郑成已;王世媛;陈清西【摘要】ω干扰素(IFN-ω)是同IFN-α功能相近但抗原性不同的一类干扰素分子,它具有同IFN-α、IFN-γ以及肿瘤坏死因子α相似的抑制病毒复制的作用.采用5L 发酵罐发酵表达IFN-ω,发酵培养液经超滤膜浓缩、SP层析柱梯度分离,得到糖基化的IFN-ω,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF-TOF MS)和N 端蛋白序列分析仪分析其分子质量和N端序列,用细胞病变抑制法测定活性.结果表明,诱导约48 h时,目的蛋白表达量最高,通过SP梯度洗脱,可将糖基化和非糖基化的IFN-ω分离,质谱分析糖基化蛋白样品,质谱峰为糖基化蛋白特有的峰.纯化后糖基化的IFN-ω抗病毒活性为1.46× 108 U/mL.%IFN-w is a kind of interferon molecules, which has similar function but different antigenicity to IFN-a. It can inhibit virus replication like IFN-a, IFN-y and tumor necrosis factor alpha. 5 L fermenter was used to ferment and interference was expressed. Then,the glycosylated interferon a> was purified by a procedure stepped by ultrafiltration and gradient elution SP chromatography column. Its molecular weight and N amino acid sequence were analyzed by MALDI TOF-TOF MS and the N protein sequence analyzer, respectively. In addition,IFN-a) activity was determined by cell changes suppression method. The results showed that IFN-w expression level reached to highest in induced 48 h. The glycosylated and unglycosylated IFN-co could be separated by SP gradient elution completely. The glycosylated IFN-w showed a series of continuous peaks by mass spectrometry,which is thecharacteristic peak of glycosyl protein. The antiviral activity of the purified glycosylated IFN-w was 1. 46X108 U/mL【期刊名称】《厦门大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(051)006【总页数】5页(P1074-1078)【关键词】IFN-ω;表达;纯化;N端测序;活性测定【作者】蒙翠凤;饶晓璐;郑成已;王世媛;陈清西【作者单位】厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门特宝生物工程股份有限公司,福建厦门361022;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门特宝生物工程股份有限公司,福建厦门361022;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门特宝生物工程股份有限公司,福建厦门361022;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005【正文语种】中文【中图分类】TQ929+.1干扰素（IFN）是一族由多种细胞产生的，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白［1］.根据产生细胞、受体和活性等综合因素可将IFN分为2种类型：Ⅰ型IFN又称为抗病毒IFN，生物活性以抗病毒为主，有3种分子形式：IFN－α、IFN－β和IFN－ω；Ⅱ型IFN 又称免疫IFN［2］，主要是指IFN－γ.IFN－α、IFN－β和IFN－ω的受体为同一种分子，表达在几乎所有类型的有核细胞表面，因此这些IFN的作用范围十分广泛［3］.IFN－ω是同IFN－α功能相近但抗原性不同的一类IFN分子，它具有同IFN－α、IFN－γ以及肿瘤坏死因子α相似的抑制病毒复制的作用［4］，目前，IFN－α已广泛应用于抗病毒、抗肿瘤的治疗，效果显著，而有关IFN－ω的研究报道则较少［5］，有研究表明IFN－ω有比IFN－α更强的抗病毒活性［6］.由于IFN－ω具有较强的抗病毒复制、抗细胞增殖和免疫调节等生物活性，而且IFN－ω 与IFN －α、IFN－β、IFN－γ 的抗原特性不同［7］，不会与IFN－α、IFN－β、IFN－γ 的抗血清或单克隆抗体发生交叉反应［8］，因此，该细胞因子有望用于治疗多种肿瘤、病毒性疾病以及对IFN－α、IFN－β或IFN－γ耐药的患者［9－10］.目前，国外已有采用多种表达系统制备IFN－ω的报道，其中既有大肠杆菌（Escherichia coli）原核表达系统，也有酵母细胞真核表达系统，均表达出具有生物活性的IFN－ω，而国内关于IFN－ω的报道和研究仍很少［11］.齐连权等在毕赤酵母中分泌表达IFN－ω，但表达量较低，只有10mg／L左右［12］.糖基化是真核细胞中常见和复杂的翻译后修饰方式之一，具有重要的生物学意义，糖蛋白的糖链能修饰并改变蛋白的内在特性，在决定蛋白质的多种生物学功能并且能保护蛋白质免受热力学降解方面发挥重要作用［13］.因此，本文构建了IFN－ω 毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统，筛选得到了较高表达量的转化子，表达约为80mg／L，经层析柱纯化，获得糖基化的IFN－ω，并对糖基化的IFN－ω进行质谱分析、N端测序及对其活性进行了初步的检测.1 材料和方法1.1 材料毕赤酵母工程菌 GS115（IFN－ωPAo815sm），由本实验室构建并保存；酵母提取物和蛋白胨为英国Oxoid公司产品；丙烯酰胺为Promega公司产品；SP Sepharose Fast Flow 填料为 GE Healthcare公司产品；IFN－ω标准品为Ebioscience公司产品；人羊膜细胞（WISH）为美国ATCC公司产品；水泡性口炎（VSV）病毒为美国ATCC公司产品；其他试剂均为国产分析纯.主要仪器：5L全自动发酵罐，德国B.Braun Biotech公司；全温振荡器，哈尔滨东明医疗器械厂；离心机，Beckman公司；P2B005A01超滤膜，Millipore公司；Basic 100蛋白纯化仪，GE Healthcare公司；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI TOF－TOF MS），Bruker公司；N 端蛋白序列分析仪（PPSQ－31），日本岛津公司；M2e酶标仪，MD公司.1.2 方法1.2.1 IFN－ω的发酵表达发酵条件参考文献［14］，将保藏菌株划线于酵母膏胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基（1%（质量分数，下同）酵母粉，2%（质量分数，下同）蛋白胨，1%（质量分数，下同）葡萄糖，1.8%（质量分数，下同）琼脂糖）上，28～30℃ 生化培养箱培养 36h，得 GS115（IFN－ω PAo815sm）单菌落.从YPD琼脂培养基上挑单菌落，接入1L三角瓶装的300mLYPD液体培养基（1%酵母粉，2%蛋白胨，1%葡萄糖）中，于200r／min 28～30℃摇床培养18h.按体积分数为10%的接种量接种，即接300mL摇瓶种子到含3 000mL酵母膏胨甘油（BMGY）培养基（1%酵母粉，2%蛋白胨，1.34%（质量分数）无氨基酵母氮源（YNB），1%（质量分数）甘油，0.4 mg／L生物素）的5L发酵罐中，参数控制：温度为28℃，pH值为6.30，溶氧为20%～30%，转速：与溶氧联动（起始最低转速150r／min）.当甘油消耗尽时（根据溶氧急剧上升判断为甘油消耗尽），补加30mL 80%（体积分数，下同）甲醇诱导表达，此后按20mL／h的流速连续补加80%甲醇，发酵过程以质量分数为14%氨水调pH值，每隔3h取5mL培养液离心取上清电泳，共诱导51 h，发酵结束离心收集发酵上清.取不同时间发酵上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，质量分数为14%聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS－PAGE），最后收集的发酵上清用于进一步纯化.1.2.2 IFN－ω的纯化超滤浓缩：用平衡缓冲液（100mmol／L NaAc，pH 6.0）将 MilliporeP2B005A01超滤膜平衡，超滤浓缩发酵上清20倍，加入等体积的平衡缓冲液替换，如此重复替换10次，最后将蛋白缓冲液体系替换成平衡缓冲液体系.强阳离子交换柱（SP）层析柱分离：A液：100 mmol／L NaAc，pH 6.0，B液：400mmol／L NaAc，pH 6.0；将超滤样品上样于Φ18mm×200mm SP Sepharose Fast Flow层析柱，然后以5mL／min流速用 A液冲洗3个柱体积冲洗未挂柱蛋白，用30%（体积分数，下同）B冲洗3个柱体积，收集30%B洗脱峰样品并电泳检测.梯度洗脱：以流速2.5mL／min，30%B→100%B，200min线性梯度洗脱，分管收集洗脱样品.收集样品分别取样进行SDS－PAGE.1.2.3 IFN－ω质谱鉴定分子质量利用 MALDI－TOF－TOF MS，Daltonics autoflexⅢ，Bruker测定Ⅱ峰样品的分子质量，线性阳离子模式（LP＿ProtMix），离子加速电压为20kV.取样品1μL与含0.1%（体积分数）三氟乙酸的70%（体积分数）乙腈溶液的饱和α－氰基－4－肉桂酸溶液（HCCA）1 μL充分混合，取1μL点样，待自然干燥后质谱分析.1.2.4 IFN－ω氨基酸序列分析采用Edman降解法测定II峰样品的N端15个氨基酸序列，N端蛋白序列分析仪可自动显示测序峰.1.2.5 IFN－ω活性测定参照文献［15］用细胞病变抑制法测定活性：37℃、5%（体积分数，下同）CO2贴壁培养人羊膜（WISH）细胞，并扩增，消化、收集细胞，将细胞配制成浓度为3×105 mL－1的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，培养至形成均匀的细胞单层.用杜尔贝科改良型（DMEM）完全培养液稀释IFN－ω标准品、自制IFN－ω，4倍梯度稀释，共8个梯度，每个梯度2复孔.将稀释好的IFN－ω标准品、自制IFN－ω加入细胞培养液中保护细胞，同时设置阴性对照组，于37℃，5%CO2培养18～24h.弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入100μL含100组织半数感染剂量（TCID50）的水泡性口炎病毒（VSV）病毒攻击细胞，于37℃，5%CO2培养24h.弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入结晶紫染色液30μL，室温放置30 min后，冲去染色液，加入脱色液100μL，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度.计算IFN－ω的活性.2 结果2.1 IFN－ω的发酵表达用SDS－PAGE检测发酵过程不同诱导时间样品，结果表明发酵上清中主要有两条蛋白条带，一条蛋白分子质量约为23ku，该蛋白相对分子质量大于IFN－ω理论分子质量，推测可能为糖基化所致（在目的蛋白的氨基酸序列中，有一个潜在的糖基化位点Asn78－Met79－Thr80），另一条蛋白分子量约为20ku，可能为非糖基化的IFN－ω，整个发酵过程中糖基化IFN－ω比非糖基化IFN－ω的表达量高（图1）.图1 IFN－ω的发酵培养液上清电泳结果Fig.1SDS－PAGE analysis of IFN－ωfermentation在发酵过程，蛋白的总表达量随着诱导时间的延长而增加.诱导27h前，非糖基化的IFN－ω的表达量高于糖基化的IFN－ω，诱导27h后糖基化的IFN－ω的表达量快速增加，而非糖基化的IFN－ω的表达量增加量较少，可能是因为随着发酵时间的延长，各种代谢产物逐渐累积，代谢产物的累积会对蛋白有降解作用，猜测糖基化的IFN－ω比非糖基化的IFN－ω的稳定性好，比较不容易降解，所以表现为糖基化的IFN－ω增加较多.在诱导33h后糖基化比非糖基化的IFN－ω表达量高，在诱导48h时糖基化和非糖基化的IFN－ω表达量均达到最高，51h的表达量与48h的表达量基本一致，表达量不再增长，说明诱导48h时表达量达最高，随后维持相对稳定，这可能与随着发酵时间的延长，各种代谢产物的累积对蛋白表达和累积有影响.通过电泳估算，在诱导48h时，糖基化和非糖基化的IFN－ω的总表达量约为80mg／L.2.2 IFN－ω的纯化超滤结果：IFN－ω的发酵培养液上清通过超滤得到浓缩（电泳结果如图2）.用毕赤酵母表达IFN－ω的培养上清中含有较少的背景蛋白，主要的杂质为色素、盐等，采用超滤方法来初步纯化，可达到快速去除色素、浓缩蛋白、降低蛋白体系中的电导的目的.SP Sepharose Fast Flow 层析柱分离结果（如图3）：30%B洗脱出一个峰（Ⅰ峰），收集1号管，经30%B→100%B，200min线性梯度洗脱得到两个峰（如图中Ⅱ峰和Ⅲ峰），其中2～5号管收集为Ⅱ峰，6～7号管收集为Ⅲ峰.SDS－PAGE检测结果（图4）：1号管样品主要为杂蛋白；2～5号管主要蛋白分子质量约为23 ku，为糖基化的IFN－ω，其中5号样品含有极少量的约20ku的非糖基化的IFN－ω；6号管样品含有糖基化和非糖基化的IFN－ω，7号管样品为非糖基化的IFN－ω.从图可以看出，通过梯度洗脱，糖基化和非糖基化的IFN－ω已得到有效分离，Ⅱ峰主要为糖基化的IFN－ω，Ⅲ峰主要非糖基化的IFN－ω.图2 IFN－ω超滤样品电泳结果Fig.2SDS－PAGE analysis of IFN－ωultrafiltration图3 IFN－ωSP液相分离图谱Fig.3Liquid chromatogram of IFN－ωSP2.3 鉴定分子质量及N端测序用autoflexTOF／TOF质谱仪分析SPⅡ峰样品，质谱图如图5.质谱分析得到的质谱峰并非一尖峰，而是一簇宽峰，这是由于糖蛋白糖基化的不均一性导致峰形展宽，所得的质谱峰约在23ku附近，其测定结果约比理论值（19 984.2u）大3 000u，猜测这是由于IFN－ω的Asn78糖基化所致.图4 IFN－ωSP液相分离样品电泳结果Fig.4SDS－PAGE analysis of IFN－ωSPN端测序结果15个氨基酸及排列顺序为：EAEACDLPQNHGLLS.图5 糖基化的IFN－ω质谱分析图谱Fig.5Mass spectrogram of glycosylation IFN－ω2.4 活性测定活性测定结果：应用 WISH－VSV细胞病变抑制法测定糖基化IFN－ω的活性，分别以IFN－ω标准品、IFN－ω待测品作标准曲线，四参数回归计算法进行处理，结果显示纯化后的糖基化IFN－ω抗病毒活性良好，ED50约小于40pg／mL，糖基化IFN－ω活性约与标准品活性相当，通过下列公式计算，抗病毒活性换算后为1.46×108 U／mL：待检样品效价（生物学活性）（U／mL）＝其中：C1为待检样品相当于标准品半效量的稀释倍数；C2为标准品半效量的稀释倍数；D1为待检样品预稀释倍数；D2为标准品预稀释倍数.3 讨论本文采用毕赤酵母表达IFN－ω，酵母是生产真核异源蛋白的宿主菌，易于遗传操作，兼有原核生物生长特性及真核蛋白的翻译后加工修饰特点.巴氏毕赤酵母在表达外源蛋白时具有可高密度培养、表达量高、稳定性高、能对所分泌的蛋白进行N－和O－糖基化修饰、适应性强、易于处理、自身分泌的蛋白较少等优点［16］，毕赤酵母在生物量扩增阶段，只需少量的抑制物，通常为甘油，既可以满足细胞生长又能有效抑制外源基因表达，在表达阶段，只需让细胞耗尽剩余的甘油，再加入甲醇诱导即可，这样高密度连续培养可以提高表达量.由于毕赤酵母自身分泌的蛋白质量很低，在培养上清中，重组蛋白的比例就相对较高，为蛋白质纯化建立基础［17］.由于该表达系统的诸多优点，人们越来越多地利用它作为外源基因的表达系统来生产目的蛋白.毕赤酵母表达IFN－ω的培养上清中含有较少的背景蛋白，主要的杂质为色素、盐等，但培养液的体积较大，因此实验过程第一步采用超滤膜来捕获目的蛋白，可达到快速去除色素、浓缩蛋白、降低蛋白体系中的电导的作用，SP层析分离过程通过延长洗脱梯度即可将糖基化和非糖基化的IFN－ω较好地分离，得到具有较高生物活性的糖基化IFN－ω.糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰，蛋白质糖基化的一个重要特点是不均一性，即在糖基化发生过程中会产生一系列结构相关的糖链（微不均一性）以及同一糖蛋白中的不同糖基化位点连接有不同的糖链（点不均一性），同时由于糖基化的发生由糖基化相关的几种酶协调作用完成的，受各种生理生化条件的影响很大，造成即使同一个位点也会有糖基化程度［18］.质谱分析糖基化的IFN－ω，质谱图谱峰并非单一的尖峰组成，而是一簇宽峰，这是由于IFN－ω的糖基化的不均一性导致峰形展宽.本实验为进一步研究IFN－ω的结构和生物学特性、发掘其药物价值以及IFN－ω的生产奠定了基础.【相关文献】［1］李臣宾.IFN－ω的研究进展［J］.国外医学免疫学分册，2005，28（1）：7－9.［2］Bekisz J，Schmeisser H，Hemandez J，et al.Human inter－ferons alpha，beta and omega［J］.Growth Factors，2004，22（4）：243－251.［3］许无恨，刘慧玉，薛刚，等.猫干扰素ω3与胸腺肽α1融合蛋白表达及活性检测［J］.中国兽医学报，2009，29（8）：1036－1040.［4］Adolf G R，Maurer－Fogy I，Ingo K I，et al.Purification and characterization of natural human interferonω1：two alternative cleavage sites for the signal peptidase ［J］.The Journal of Biological Chemistry，1990，265：9290－9295.［5］Yang L M，Xue Q H，Sun L，et al.Clning and characterization of a novel feline IFN－ω［J］.Inteferon Cytokine Res，2007，27：119－127.［6］Hennet P R，Camy G A，McGahie D M，et parative efficacy of a recombinant feline interferon omega in refractory cases of calicivirus－positive cats with caudal stomatitis：a randomized，multi－centre，controlled，doubleblind study in 39cats ［J］.Journal of Feline Medicine and Surgery，2011，5（13）：577－587.［7］Mitchell M S.Cancer vaccines，a critical review Part I［J］.Curt Opin Investig Drugs，2002，3（1）：140－148.［8］Mathias M P，Hdga M，Peter L，et al.Open－label study of omega interferon in previously untreated HCV－infected patients［J］.Journal of Hepatology，2002，36（6）：125.［9］Adolf G R.Human interferon omega－a review［J］.Muh Seler，1995，1（Sup.1）：S44－S47.［10］Liu H，Pan H C，Peng L，et al.RP－HPLC determination of rccombinant human interferon omega in the Pichia pastoris fermentation broth［J］.J Pharm Biomed Anal，2005，38（4）：734－737.［11］左爱军，梁东春，郭刚，等.重组人ω－干扰素的制备及活性分析［J］.中国免疫学杂志，2006，22（10）：940－943.［12］齐连权，付玲，于长明，等.人ω干扰素在巴斯德毕赤酵母中的表达及纯化［J］.军事医学科学院院刊，2003，27（4）：268－270.［13］Meynial－Sallers I，Combes D.In vitro glycosylation of proteins：an enzymatic approach ［J］.Journal Biotechnology，1996，46（1）：1－14.［14］郑成已.人ω干扰素基因工程菌发酵条件的优化［J］.海峡药学，2006，18（3）：168－170.［15］国家药典委员会.中国药典［S］.北京：中国医药科技出版社，2010.［16］Cereghino J L，Cregg J M.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast pchia patoris［J］.Fems Microbiology Rev，2000，24（1）：45－66.［17］Rornanos M A，Clare C A，Clare J J.Foreign gene expression in yeast：a review ［J］.Yeast，1992，8（2）：423－488.［18］Dell A，Morris H.Glycoproein structure determination by mass spectrometry ［J］.Science，2001，291：2351－2356.。

人组织因子在毕赤酵母中的表达和纯化

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人组织因子在毕赤酵母中的表达和纯化
王羽雄敏顾银良于宋后燕
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恶性疟原虫融合蛋白PfCP-2.9自由巯基的测定

恶性疟原虫融合蛋白PfCP-2.9自由巯基的测定钱锋;潘卫庆【期刊名称】《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》【年(卷),期】2003(21)2【摘要】目的检测由毕氏酵母表达的恶性疟原虫融合蛋白(Plasmodium falciparum chimeric protein)PfCP-2.9的自由巯基。

方法使用反向高压液相层析和Ellman氏反应进行检测。

用反向高压液相,检测了3种样本,PfCP-2.9、PfCP-2.9经二硫苏糖醇还原、PfCP-2.9经吲哚乙酸烷基化。

结果两种检测方法均表明PfCP-2.9不含任何自由流基。

结论由毕氏酵母表达的PfCP-2.9中的半胱氨酸残基所含有的硫基均已氧化形成二硫键。

【总页数】3页(P99-101)【关键词】恶性疟原虫;融合蛋白;毕氏酵母;PfCP-2.9;自由巯基;反向高压液相层析法;Ellman氏反应【作者】钱锋;潘卫庆【作者单位】第二军医大学病原生物学教研室【正文语种】中文【中图分类】R382.31;R531.3【相关文献】1.肠毒素大肠杆菌耐热肠毒素与谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白的制备和耐热肠毒素抗体测定 [J], 郑继平;刘向昕;王令春;王芃;李淑琴;张兆山2.沉默调节蛋白6-谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白的克隆表达 [J], 夏天;刘建湘;姚景宏;吴太鼎;刘子建;杨述华3.血清中总巯基与非蛋白巯基含量分别测定研究 [J], 陈震阳;苏春云4.恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9的单克隆抗体制备及功能分析 [J], 王瑞;钱锋;曲莉;潘卫庆5.恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9在不同品系小鼠中的免疫特性(英文) [J], 薛向阳;张青锋;邢金花;潘卫庆因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

毕赤酵母提高产肠毒素大肠杆菌灭活疫苗免疫保护效果的研究

毕赤酵母提高产肠毒素大肠杆菌灭活疫苗免疫保护效果的研究李莹慧;张迪;张兆天;刘迎迎;朱悦;贾垌;卢海强;李妍【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2022(44)12【摘要】为探究毕赤酵母提高产肠毒素大肠杆菌(ETEC)灭活疫苗免疫保护效果的作用,本研究将48只BALB/c小鼠随机均分为4组,分别为毕赤酵母活菌+疫苗组(仔猪大肠埃希氏菌K88、K99、987P三价灭活疫苗)、毕赤酵母灭活菌+疫苗组、疫苗组及生理盐水(对照组)。

免疫后15 d各组随机取6只小鼠采血后剖杀采集其十二指肠样品及肠液,分别采用ELISA检测各组小鼠血清K88ac(菌毛)IgA和K88ac IgG特异性抗体水平与十二指肠液中K88ac分泌型IgA(SIgA)抗体水平;采用q PCR检测十二指肠组织紧密连接蛋白Occludin、ZO-1及黏蛋白MUC2基因的转录水平;制备小鼠十二指肠组织切片,观察其肠道结构完整性,采用Image J 1.41软件定量分析小鼠肠绒毛高度与隐窝深度;对各组小鼠脾脏称重,计算脾脏指数。

采用腹腔注射ETEC K88ac菌株(3×10^(7)cf u/只)方式对每组剩余小鼠攻毒,连续5 d观察各组小鼠的临床症状,统计小鼠的腹泻率和死亡率并称量其体质量。

通过以上检测指标综合分析毕赤酵母对提高灭活疫苗保护效果的作用。

抗体检测结果显示,与疫苗组及对照组相比,添加毕赤酵母活菌与灭活菌均可极显著(P<0.01)提高小鼠血清K88ac IgA、K88ac IgG及十二指肠液中K88ac SIgA特异性抗体水平,且活菌效果极显著(P<0.01)或者显著(P<0.05)优于灭活菌及其他组。

qPCR结果显示,与疫苗组相比,添加毕赤酵母活菌或灭活菌均可显著提高小鼠十二指肠紧密连接蛋白基因的转录水平(P<0.05),极显著提高小鼠十二指肠黏蛋白的转录水平(P<0.01)。

组织切片观察可见,活菌+疫苗组小鼠肠道肠壁绒毛排列相对整齐,绒毛结构基本完整,隐窝清晰,优于灭活菌+疫苗组及其他组。

PCV2 Cap蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及小鼠免疫试验的开题报告

PCV2 Cap蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及小鼠免疫试验的开题报告题目：PCV2 Cap蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及小鼠免疫试验研究背景：猪圆环病毒2型(PCV2)是一种常见的猪病毒，可引起多种临床症状，如呼吸道症状、消瘦、瘫痪等。

目前，疫苗是预防和控制该病的主要手段。

而PCV2 Cap蛋白是一种重要的抗原蛋白，是开发PCV2疫苗的重要组成部分。

因此，研究如何高效、经济地制备PCV2 Cap蛋白为制造PCV2疫苗具有重要的理论和实践意义。

研究内容：本研究将采用基因重组技术将PCV2 Cap基因克隆至毕赤酵母表达载体pPICZαA中，构建pPICZαA-PCV2 Cap表达载体，并将其转化至毕赤酵母Pichia pastoris中，应用甲醇诱导表达的方法进行大规模生产。

通过Western blot和ELISA检测毕赤酵母中PCV2 Cap蛋白的表达。

利用小鼠模型，对表达的PCV2 Cap蛋白进行免疫试验，探究其免疫效果。

研究意义：本研究通过毕赤酵母重组技术，高效、经济地制备PCV2 Cap蛋白，为PCV2疫苗的制造提供了一种新途径。

同时，研究表明毕赤酵母表达的PCV2 Cap蛋白能够有效地提高小鼠体内的抗体水平，具有明显的免疫效果，为探索PCV2疫苗的进一步研发提供了新思路。

参考文献：1. Trible, B. R., & Rowland, R. R. R. (2012). Advances in porcine circovirus type 2 vaccines, immunology, and diagnostics. Veterinary microbiology, 156(3-4), 189-197.2. Genzati, I. G., Gardey-Loubat, A., Lozano, E. S., & Odeón, A. C. (2016). Expression and immunogenicity of Porcine circovirus type 2Capsid protein subunits produced in vivo in lettuce (Lactuca sativa) plants. Plant Molecular Biology Reporter, 34(5), 1078-1088.3. Zhou, J. Y., Shang, S. B., Gong, H. S., Chen, Q. X., Jiang, W. M., Yang, J. Y., & Fang, L. R. (2011). Expression of the PCV2 ORF2 protein in Lactococcus lactis and evaluation of its immunogenicity as an oral vaccine in mice. Protein and peptide letters, 18(4), 405-411.。

毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化

1 酵母表达体系
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是在酿酒酵母表达体系的基础上，用其他的酵母菌株构建的、可高效稳定表达外源基因的新表达系统，即甲醇营养
型酵母（Methy-lotrophicyeast）表达系统 [1]。作为第 2 代酵母表达系统，它不仅克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白不能分泌到细胞外、背景蛋白多、表达水平低等缺点，并且弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，此外，还具有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处[2]。
亲和层析（Affinity Chromatography，AFC）是利用
2009 年第 3 期
高炳淼等：毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化
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偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的方法。它具有很高的选择和分离性能以及较大的载量，只需要一步处理即可使某待分离的生物大分子从复杂的混合物中分离出来，达到千倍以上的纯化，并保持较高的活性[15]，是分离纯化以及分析生物大分子尤其是蛋白质的有力工具。自从 1967 年 Axen 等[16]用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法成功制备了固定化酶，此后亲和层析在 20 世纪 70 年代有了迅速的发展，目前已得到广泛应用。
2 主要纯化的方法
重组蛋白的分离纯化与传统方式相似，也是利用其物理和化学性质的差异，即分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的（表 1）[7]。从表 1 可看出，高纯度的蛋白质主要是依靠色谱法技术得到的。由于重组蛋白在组织和细胞中仍以复杂混合物的形式存在，因此到目前为止还没有一个单独或一整套现成的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离出来，而只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索一套综合的分离程序，以获得较高纯度的蛋白产品。

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、
材料与方法
（）料一材
１．试剂ＰｅｙＳｐａｏｅ．．料、Ｓｐａｏｅ．．料、别用Ｆ液（１ｍｌｈｎｌｅｈｒｓＦＦ填ＱｅｈｒｓＦＦ填ＯｍｏＬ柠檬酸／檬酸钠＋０ｍｏＬ氯化钠，／柠８ｍｌ／ＳＳｐａｏｅ．．ＰｅｈｒｓＦＦ填料、ｕｅｄｘ５ｇ０６０预装柱均为ＧＳｐｒｅ７ｐ６／０Ｅ公ｐ．和ｃ液（ＯｍｏＬ柠檬酸／酸氢二钠＋．ｍｌＨ４８）１ｍｌ／磷Ｏ４ｏ／Ｌ氯
原中，高度保守的裂殖子表面蛋白１ＭｅｏｏｅｕｆｃＰｏｅｎ，液超滤，滤膜截留分子量为１Ｋ超滤至５０ｍ时，（ｒｚｉＳｒｅｒｔｉｌｔａ超０Ｄ，００以滤
ＭＰ１Ｃ末端１ｋＳ—）９Ｄ片段（Ｐ — ９）ＭＳ１１和裂殖子顶端膜抗原ｌ出液相同的速度泵人ｃ液（５ｏＬ柠檬酸／酸氢二钠，１ｍｍｌ／磷
陈佩新，松，书生，海华，秀东高王徐黄
（海万兴生物制药有限公司．上上海２１００２６）
摘要：文章对毕赤酵母工程茵Ｇ１５ｐＩ９ — ｆＰ．表达的重组疟疾疫苗ＰＣ２９的纯化工艺进行了研究。研究表Ｓ１／ＰＣＫＰＣ２９ｆＰ．明，分泌在发酵上清液中的目的蛋白，先后经Ｐｅｙ疏水层析，滤更换缓冲液，ｈｎｌ超Ｑ强阴离子交换层析，Ｐ强阳离子ｓ
成功构建了由ＭＳＩ１Ｐ一９和Ａ一ＭＡ１的 Ⅲ亚区［ＭＡ一ｍ）ＰＥ分析。Ａ１（］ＡＧ
通过接点序列连接而成的融合蛋白，名为ＰＣ一．，在毕定ｆＰ２９并
３Ｓｐａｏｅ．．．ＱｅｈｒｓＦＦ阴离子交换层析将上步中的超滤液，
一
出液并合并。取样测定蛋白含量，进行ＳＳＰＧＤ — ＡＥ分析。４ＰｅｈｒｓＦＦ阳离子交换层析将上步中的收集液．ＳＳｐａｏｅ．．调节ｐＨ值至４８后，经Ｅ液（１ｍｌ．上０ｍｏＬ柠檬酸／檬酸／柠钠，Ｈ．平衡好的柱子，Ｅ液淋洗至无蛋白流出后，ｐ４８）用分
交换层系和Ｓｐｒｅ７凝胶过滤层析，纯度大于９％的目的蛋白，白得率为５％，ｔｎｂｔｕｅｄｘ５获得８蛋０Ｗｅｒｌ分析其具有免ｅ— ｏ
疫原性，够满足后续临床试验用药的要求，能为疫苗的产业化铺平了道路。
关键词：重组疟疾疫苗；毕赤酵母；白纯化；蛋疫苗产业化中图分类号：３２Ｒ８文献标识码：Ａ文章编号：０９２７（００）３０４ — ３１０ — ３４２１１— ０７０
司产品；酸铵为Ａｅｓｏ公司进口分装；．５．２１滤膜化钠，Ｈ．洗脱，硫ｍｒｃ０４／２１０３ｐ６５）收集各峰。并分别取样测定蛋白含量，进
为Ｓ￣ｆｓ司产品；抗５２ＲｂｉｎｉｆＳ１０第二军行ＳＳＰＧａｏｕ公ｉ单．、ａｂｔｔＣＰ９，ａＰＤ — ＡＥ分析。医大学病原微生物教研室提供；抗兔Ｉ羊ｇＧ— ＡＰ标记，华美生物工程公司；它试剂均为国产分析纯。其５ｕｅｄｘ５凝胶过滤层析将上步中收集的Ｇ液洗．Ｓｐｒｅ７脱收集液６ｍｌ经Ｈ液（０ｏＬ柠檬酸／檬酸三钠０上２ｍｍｌ／柠
（ｐｃｌｍｒｎＡｎｉｎ，ＡｊＭｅｂａｅｔｅＩＡＭＡＩ是目前两个最有希望的红ｐ６５）并不停搅拌超滤液，至超滤液的ｐ电导和ｃ液一ａｇ —）Ｈ．，直Ｈ、内期亚单位疫苗。上海第二军医大学病原微生物教研室己经致。对超滤液和滤过液分别取样，定蛋白含量，行ＳＳ测进Ｄ—
赤酵母中得到了高水平表达。本文主要研究了毕赤酵母表达上经Ｄ液（０ｏＬ柠檬酸，２ｍｍｌ／磷酸氢二钠，Ｈ６平衡好的ｐ．５）的融合抗原ＰＣ一．ｆＰ２９的纯化工艺，实现了融合抗原的大规模柱子，用Ｄ液淋洗至无蛋白流出，后收集上样流出液和淋洗流制备，为疫苗的产业化铺平了道路。
２１００年第１期３（总第１８期）４
串固高｛技术企业Ｉｒｒｓｓ
Ｎ０．３．０１１２０
（ｕｌｉｔＮ．８ＣｍｕａｖｙＯ１）ｔｅ４
在毕赤酵母中表达的重组疟疾疫苗（ｆＰ２９）ＰＣ一．的纯化研究
疟疾是人类最古老的传染病之一，至今仍在全球肆虐。无蛋白流出，Ｂ液（０ｍｏＬ柠檬酸，用２ｍｌ／磷酸氢二钠＋．ｍｌＯ３ｏ／目前约４％的世界人口仍处在疟疾威胁之中，年有３～５Ｌ硫酸铵，Ｈ．洗脱并收集洗脱峰；着用注射用水洗脱柱０每ｐ６５）接
亿人感染疟疾，中约１０３０万人死亡，其０～０大多数为儿童和孕床并收集洗脱峰。分别取样，测定蛋白含量，进行ＳＳＰＥＤ — ＡＧ妇。现在研究者普遍认为，制安全、研价廉和有效的疟疾疫苗分析。
是人类控制乃至根除疟疾的重要途径。在众多的疟疾候选抗２．疏水层析收集液的超滤脱盐将上一步骤中蛋白收集