毕赤酵母重组子的MDMM签定方法

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毕赤酵母表达操作手册(PDF精译版)

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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。

不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。

它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。

同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。

这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。

例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。

为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

毕赤酵母的培养基1

毕赤酵母的培养巴斯德毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。

与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。

比赤酵母表达常用的培养基：1 LB培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠1% PH 7.0----------------大肠杆菌培养制作平板加入2%的琼脂粉，121摄氏度20分钟，可于室温保存。

用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / mL（博来霉素，抗菌素）宿主细胞His- -----------诱变造成的。

MD------------酵母转化筛选培养基（营养缺陷型His-）13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖用于表达的毕赤酵母都属于组氨酸缺陷型的只有染色体上成功整合入重组质粒载体基因的毕赤酵母菌株才能在组氨酸缺失的MD培养基生长，以此筛选出重组子。

MM--------------酵母转化进一步筛选培养基仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，成为基本培养基（minimal medium,MM），有时用符号“[ －]”来表示。

不同微生物的基本培养基是不相同的。

2 LLB 培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠0.5%PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。

121℃高压灭菌20min。

可于室温保存数月。

用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2 周.3 YPD培养基酵母粉1%，胰蛋白胨2%，葡萄糖2%，固体加2%的琼脂粉，YPD 培养基可常温保存,是毕赤酵母的最基本培养基，琼脂YPD 平板在4℃可保存几个月。

加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ 培养基，可以4℃条件下保存1～2 周。

4 BMGY培养基酵母粉1% 蛋白胨2%，磷酸钾缓冲溶液平PH 6 100mmol/L YNB（酵母氮源）1.34% 生物素（4×10 -5）%甘油1%，毕赤酵母诱导表达前培养基，YNB和Biotin过滤除菌。

重组酵母的快速鉴定方法

杂草与农作物竞争水分、养料和光照，影响农作物的产量和品质，是许多病虫害的中问寄主或越冬场所。还
由于至少１％２％的转化子是载体Ｈ４基因和Ｇ１５０～０ｉｓＳ１
染色体上的Ｈｓ突变基因位点间的转换而形成，故这种ｆ
ＺｎＹＪｈａｇｕｕｎ
ＷｎｇａＢｉｎ
ＫｏＨｏｎｇａ２
（ｉｇａｎｖｒｉｙｍｄｃｌｃｌｅｅ￥ａｄｎ６０１。ｈｎｏｇｗｎｉｅｉａｏｌｇ）１ｎｄｏＵｉｅｓｔｅｉａｏｌｇ，ｈｎｏｇ２６７；ａｄｎａｊｅｍｄｃｌｃｌｅｅＱＳＡｓｒｃ：Ｔｉａｅｅｃｉｅｈａｉｄｎｉｉａｉｎｏｅｏｂｎｎｅｓ，ｙＭ／Ⅱ ｅｉｍｉｂｔａｔｈＳｐｐｒｄｓｒｂｄｔｅｒｐｄｉｅｔｆｃｔｏｆｒｃｍｉａｔｙａｔＢ￣）ｍｄｕｎ
这种假阳性的克隆的排除只有用ＰＲ方法来鉴定目Ｃ
的基因是否存在于酵母染色体上。传统提取酵母染色体的方法较为繁琐且耗时较长 … ，而其他相对简便的方法中则需使用酵母裂解酶处理。我们将改造的腈水解酶基因转入酵母，目的是鉴定一下经过改造的基因表
因和Ｈ４基因的表达载体（ｐＩ９或ｐＩ～１与ｉＳ如ＰＣＨＬＳ）

靶向性DNA甲基化酶在毕赤酵母中的表达和鉴定

ｍｒｓＡｐｓｔｅｐｔｉａｄｗｉｌｃｌｒｗｉｈｂｕ０ｋｓ０ｎｎｔｅｅｐｅｓｏｒｄｃ．ｗｈｃｉａｃｒ：ｏｉｖｒｅｎｂｎｔｍｏｅｕａｅｇｔａｏｔ５Ｄｗａｆｕｄｉｈｘｒｓｉｎｐｕｔｉｏｈｏｉｈｓｃｏ — ｄｎｔｎｅｅｔｐｔｉ，ａｄｔｉｂｎｏｌｅｓｅｉｃｌｅｏｎｚｄｂｎｉＭｙｎｃｏａｎｉｏｙＣｏｃｕｉｎ：ａｔｗｉｉｔｒｓｒｅｎｈｏｎｈｓａｄｃｕｄｂｐｃｆａｌｒｃｇｉｙａｔｉｙｅ－ｃｍｏｏｌｎｌａｔｄ．ｂｎｌｓｏＴｅｇｎｏａｇｔｇｈｅｅｆｔｒｅｉＤＮＡｎｍｅｈｌａｓｅａｅｔｙｔｎｆｒｓＢ１３ｗａｃｏｅｉｔｔｅｘｒｓｉｎｅｔｒｃｒｅｔａｄｒ－ａｓｌｎｄｎｏｈｅｐｅｓｖｃｏｏｃｌｏｙｎｗａｅｐｅｓｄｓｘｒｓｅ
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文章编号：０９００（０７０－７６０１０－０２２０）５０５ — ３
［键词】ＤＡ甲基化酶；向性；赤酵母关Ｎ靶毕［图分类号】Ｑ８中７［献标识码】Ａ文

一种筛选毕赤酵母高拷贝数转化子的方法

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链霉菌H197 mtg基因毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

ＧＡＣＧＧＧＧＡＡＡ；
下游：ｃＲＩＣＧＡｒＴｒＣＧＣＧＣＥｏＣＧＡ１ＣＡＧＣＡＣＣｒ
将提取的总基因组做为模板进行ＰＲ扩Ｃ
ＴＣｒＧＴ，引物合成由上海赛百盛基因技术有限公司
过电泳检测（图１于２ｋ见）３ｂ处可见明亮的总ＤＡＮ带，明提取效果很好．Ｓｒｔｙｅｓ．Ｈ９说以ｔｐｏｃｐ１７菌株ｅｍｓ
３５个循环；２１ｍｎ１ｃ保温３ｒｎ７ ℃ ０ｉ，Ｉ０Ｃ０ｉ．ａＰＲ产物０８Ｃ．％琼脂糖凝胶电泳检测，用回收并
试剂盒将目的片段回收．１２３毕赤酵母胞内表达载体ｐＩ３５．．ＰＣ．ｋ的提取将ｐＩ３５／Ｈａ大量培养，ＰＣ．ｋＤ５采用碱裂解法取质粒，利用０８．％琼脂糖凝胶电泳检测，２ ℃保存．一０１２４ＰＣ．ｋＭＴ．．Ｉ３５／Ｇ酵母表达载体的构建对凝胶回收的ＭＧ基因片段和ｐ’ ３５ＴｔＣ．ｋ质粒Ｉ分别进行ＢｍＩＥｏＩａＨ和ｃＲ双酶切，酶切物电泳进行
完成．
ｓ．１７为本实验室保存．ｐＨ９
１１２主要试剂．．
重组质粒ＰＲ鉴定引物合成，序列如下：Ｃ引物
５ＡＯＸ１ｉｒＧＡＣＩｍｅＰｒ ’ ＧＧＴＴＡＡＴＣＣＴＧＡＣＡＡＧＣ：
ＥＴｑ酶、ｘａ限制性内切酶ＥｏＩＢ，Ｈ和４ＤＡｃＲ、６ＩＮｍ连接酶均购自Ｔｋｒ司；Ｎｒｅ购自ＢＩａａａ公ＤＡＭａｋｒＢ公

毕赤酵母表达操作手册(PDF精译版)

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不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。

它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。

同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。

这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。

为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

毕赤酵母PCR表型鉴定的模板制备方法

毕赤酵母PCR表型鉴定的模板制备方法
方法一：
取对数生长期酵母菌株1.5ml，13000r/min，离心15s，去上清，双蒸水洗涤一次，13000r/min 离心15s，沉淀悬浮于200ulTE缓冲液中，在沸水上煮10min，冰浴10min，13000r/min，离心5min，将上清液储存于－20度取2ul用于PCR。

方法二：
1.尽量多挑菌落，悬于100ul悬浮液中，混匀。

2.加入150ul裂解液，混匀，煮沸10min。

3.加入等体积酚氯仿，抽提5－10min。

4.14000rpm，10min，取上层清液，转入另一个1.5ml离心管中。

5.加等体积异丙醇，冷冻10min，14000rpm，10min。

6.轻轻倒去上清，扣干，55度烤干。

7.加入适量（20ul）TE复溶，看情况调整浓度，可做PCR模板
方法二肯定能提到供表型鉴定的DNA，提完后可以跑电泳看看是否有DNA，如果有提到，但PCR扩不出，那可以把模板稀释5倍或10倍，再扩应该没问题。

这个方法没有第一个快，但稳定，也不像其它资料上说的那么麻烦，所以是个很好的方法。

悬浮液和裂解液是一般抽提质粒用的那种，在分子克隆手册上可以找到配方，在这里就不再详述了。

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培养基的配方：
YPD完全培养基：酵母提取物10g/L ，蛋白胨20g/L ，葡萄糖20g/L，（固体培养基1.5%琼脂）；
MM：13.4 g/L YNB，4x10-4 g/L 生物素，5 ml/L 甲醇，15 g/L 琼脂
MD：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖
操作方法：
用无菌牙签挑取his+转化子的单克隆并分别按先后顺序划到MM和MD平板上（不同的克隆需换牙签），30℃培养两天，观察平板。

在MM和MD平板上均能正常生长的菌落表型为Mut+（Methanol utilization plus），在MD 平板上能正常生长但在MM 平板上生长相对缓慢或者不生长的菌落表型为Muts (Methanol utilization slow)。

用点MM、MD平板点方法。

准备几块MM、MD，平板用maker笔划小格子，标号，两种平板点标号要一一对应。

准备无菌牙签，点取G418板上长出点菌落，先轻轻点MM平板（小格内），再点到MD平板相同标号点小格内。

如此点约100个转化子，30℃培养2-5天，观察比较MM、MD上相同标号点菌落，MD平板上生长快，MM平板上生长缓慢或不生长点为Muts，生长速度一样点为Mut+。

原理是Mut+能够快速利用甲醇为碳源，而Muts则不能利用甲醇为碳源。

所以Mut+能够在含甲醇（MM)平板也快速生长，而Muts只能在含葡萄糖（MD)平板快速生长。

MD培养基是怎么筛选酵母的?细菌在这种培养基上是不是不生长?MD （Minimal Dextrose Medium，最小葡萄糖培养基）组成如下：（YNB 13.4g/l、葡萄糖20g/l、生物素4×10-4g/l、若制平板加琼脂粉15g/l），它属于组氨酸缺陷型培养基，细菌能生长，配制完后仍需高压蒸气灭菌处理。

用于表达的毕赤酵母都属于组氨酸缺陷型的，只有染色体上成功整合入重组质粒载体基因的毕赤酵母菌株才能在组氨酸缺失的MD培养基生长，以此筛选出重组子。

酵母菌可以利用有机物和无机物作为氮源，有机氮源有酵母浸膏、蛋白胨、胰蛋白胨等，无机氮源有尿素、醋酸铵、硫酸铵、磷酸氢二铵等铵盐。