毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化

亲和层析柱中被固定的配体是决定亲和层析 成功的关键因素。 根据配体与生物大分子之间相互 作用体系不同， 可以把亲和层析分为生物亲和层 析、免疫亲和层析、金属离子螯合层析、拟生物亲和 层析 4 种 类型[17]。 固定化金属螯合 层析（Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC） 是 近 年 来 发 展 起 来 的 一 种 亲 和 方 法 。 1975 年 ，Porath[18]首 次 提 出 固 定 化 金 属 螯 合 亲 和 层 析 （IMAC）， 并 发 展 为 一 种 有 效的生化分离技术，该方法利用固定在基质上的过 渡态金属离子和蛋白质表面的组氨酸、 半胱氨酸、 色氨酸等残基的配位作用来实现对金属离子有亲 和 力 的 蛋 白 质 分 离[19]。 其 中 ，组 氨 酸 是 与 金 属 离 子 作用较强的氨基酸，含有多个组氨酸的蛋白质可在 IMAC 中 有 效 保 留 ， 故 多 聚 组 氨 酸 已 成 为 最 常 用 的 蛋 白 质 纯 化 标 签[20，21]。 真 核 表 达 体 系 中 的 毕 赤 酵 母 载体就加入了组氨酸标记，这为应用固定化金属螯 合 亲 和 层 析 （IMAC）提 供 了 方 便 。
收 稿 日 期 ：2008-09-01 基金项目：国家自然科学基金（30560184），国家“863”计划（2007AA02Z114），新世纪优秀人 才 支 持 计 划 （NCET-04-0837），海 南 省 重 点 学 科 建
设 项 目 专 项 与 海 南 省 教 育 厅 高 等 学 校 科 研 项 目 （Hjkj200719 ） 作 者 简 介 ：高 炳 淼 （1982-）， 男 ，安 徽 明 光 人 ，硕 士 研 究 生 ，研 究 方 向 ：海 洋 药 物 通 讯 作 者 ：罗 素 兰 ，Tel ：0898-66289538 ，E-mail ：luosulan2003@
1 酵母表达体系
巴 斯 德 毕 赤 酵 母 （Pichia pastoris）是 在 酿 酒 酵 母 表达体系的基础上， 用其他的酵母菌株构建的、可 高效稳定表达外源基因的新表达系统，即甲醇营养
型 酵 母 （Methy-lotrophicyeast）表 达 系 统 [1]。 作 为 第 2 代酵母表达系统，它不仅克服了大肠杆菌表达系统 不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白不能分泌 到细胞外、背景蛋白多、表达水平低等缺点，并且弥 补了哺乳类细胞、 昆虫细胞表达系统操作复杂、表 达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，此外，还具 有 其 他 酵 母 表 达 系 统 无 法 比 拟 的 优 越 之 处[2]。
IEC） 是 通 过 带 电 的 溶 质 分 子 与 离 子 交 换 剂 中 可 交
换的离子进行交换，而达到分离目的的方法。 该法 主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷 的微小差异进行分离、且有较高的分离容量。 几乎 所有的生物大分子都是极性的，所以离子交换法已 广泛用于生物大分子的分离纯化。 离子交换色谱分 辨率高、工作容量大、易于操作，已成为蛋白质、多 肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要方 法 ，在 合 成 多 肽 分 离 中 约 有 75%的 工 艺 采 用 离 子 交 换 色 谱[8]。
表 1 依据蛋白特性采用的分离纯化方法

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(IEC) (GFC) (HIC)(RPC)
!(AC)"#$% !(IMAC) ’()*+ (EBA)
2.1 离子交换 离 子 交 换 色 谱 （Ion Exchange Chromatography，
2 主要纯化的方法
重组蛋白的分离纯化与传统方式相似，也是利 用其物理和化学性质的差异，即分子的大小、形状、 溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和 性 等 性 质 建 立 起 来 的 （表 1）[7]。 从 表 1 可 看 出 ，高 纯 度的蛋白质主要是依靠色谱法技术得到的。 由于重 组蛋白在组织和细胞中仍以复杂混合物的形式存 在，因此到目前为止还没有一个单独或一整套现成 的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离 出来，而只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索一 套综合的分离程序，以获得较高纯度的蛋白产品。
对于离子交换色谱分离纯化重组蛋白，若要获 得好的分离结果，必须选用适合的基质，其基质主 要 有 3 类 ，包 括 多 糖 、硅 胶 和 有 机 聚 合 物[9]。 Shi 等[11] 采 用 阴 离 子 交 换 色 谱 和 Macro-prep 陶 瓷 羟 基 磷 灰 石分离纯化在毕赤酵母中分泌表达人的过氧化氢 酶 ， 其 纯 度 达 到 95% ， 产 率 60% 。 传 统 的 离 子 交 换 色谱一般采用多糖类凝胶作为基质，但是存在机械 强度差、承受压力小等缺点，且不能进行快速淋洗， 分离时间长，易造成生物分子的变性、失活。 无机硅 胶 [12]填 料 机 械 强 度 大 、 柱 效 高 、 孔 径 和 颗 粒 大 小 易 于 控 制 ， 但 pH 应 用 范 围 窄 （2.0~8.0）， 硅 胶 表 面 残 余的硅羟基对蛋白质产生不可逆吸附等问题，从而 导致蛋白质的质量回收率低，生物活性损失。 硅胶 涂 敷 固 定 相 [13] 在 连 续 使 用 中 涂 层 易 脱 落 、 稳 定 性 差 。 聚 合 物 基 质[14]固 定 相 具 有 良 好 的 生 物 兼 容 性 、 化学稳定性及易于被衍生化的优点，在生物大分子 分离中的地位越来越重要，其亲水性减小了基质与 蛋 白 之 间 发 生 非 特 异 性 相 互 作 用 的 机 会 ， 可 在 pH 为 1~12 内 广 泛 使 用 。 2.2 亲和层析
亲 和 层 析 （Affinity Chromatography，AFC）是 利 用
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高炳淼等：毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化
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Hale Waihona Puke 偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附 目标产物，使目标产物得到分离纯化的方法。 它具 有很高的选择和分离性能以及较大的载量，只需要 一步处理即可使某待分离的生物大分子从复杂的 混合物中分离出来，达到千倍以上的纯化，并保持 较 高 的 活 性[15]，是 分 离 纯 化 以 及 分 析 生 物 大 分 子 尤 其 是 蛋 白 质 的 有 力 工 具 。 自 从 1967 年 Axen 等[16]用 溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法成功 制 备 了 固 定 化 酶 ，此 后 亲 和 层 析 在 20 世 纪 70 年 代 有了迅速的发展，目前已得到广泛应用。
近年来毕赤酵母表达系统极受研究者的青睐， 已有 300 多种外源蛋 白在该表达系统 中 获 得 表 达[5]， 主要用于人类药物的生产，还包括来自植物、动物 和细菌的各种酶，膜受体蛋白，含辅基的蛋白质以 及可用于研究晶体结构的蛋白质等。 它还可以同时 表达酶组分比例适当的一个酶系，使全细胞作为生 物 催 化 剂[6]。 其 中 利 用 毕 赤 酵 母 分 泌 表 达 的 硫 代 羟 腈 裂 合 酶 已 达 到 14.8 g/L 的 高 产 率 ；而 胞 内 表 达 的 羟 腈 裂 合 酶 达 到 了 22 g/L 的 高 产 率[3]。
Key words： Pichia pastoris R ecombinant protein Separation Purification
从生物体中有效分离纯化基因重组蛋白质一 直是个难题。 对于基因重组蛋白纯化技术来说，选 择合适的表达系统是相当重要的，因为表达系统决 定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的 杂蛋白。 毕赤酵母是近年来流行的原核和真核蛋白 质的表达载体。 毕赤酵母能使外源真核基因正确翻 译和翻译后加工，并分泌多种蛋白质，使产物易于 提纯。 纯化重组蛋白质的主要目的是分离出目的蛋 白，主要的方法有浓缩沉淀、离子交换、亲和层析、 反相层析等。
巴斯德毕赤酵母表达系统具有强有力的醇氧 化酶基因启动子， 可严格调控外源蛋白的表达；同 时作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后 的 加 工 与 修 饰 ，从 而 使 表 达 出 的 蛋 白 具 有 生 物 活 性 [3]。 另外，毕赤酵母菌营养要求低、生长快、培养基廉 价，易于进行操作和培养；其高密度发酵技术业已 成熟，便于工业化生产；表达量高，许多蛋白可达到
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin
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每升克级以上水平； 表达的外源蛋白可分泌到胞 外，分泌的内源蛋白少，外源蛋白分离纯化简便；外 源基因通过质粒整合到基因组上，基因工程菌株遗 传稳定性好；胞内表达蛋白的分选和区域化，增加 了表达蛋白的稳定性，减少表达产物对宿主菌的毒 害作用；具有糖基化程度低等多种优点。 与酿酒酵 母 （Saccharomyces ceresiviae）表 达 系 统 相 比 ，巴 斯 德 毕赤酵母具有分泌效率高，表达菌株稳定，表达质 粒不易丢失，不产生过度的糖基化；所分泌的糖蛋 白 的 免 疫 原 性 较 低 ，更 利 于 临 床 应 用[4]。
·综 述 与 专 论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2009 年第 3 期
毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化
高炳淼 长孙东亭 罗素兰 安婷婷
（热带生物资源教育部重点实验室 海南大学海洋学院材料与化工学院 海南大学生物技术实验中心，海口 570228）
摘 要： 随着基因重组技术的快速发展，基因工程产品的利用越来越广泛，但其分离纯化的成本约占总成本的 60%~70%。因此，探索一些简单有效的分离纯化方法尤为必要。简单介绍了目前较为流行的毕赤酵母表达体系，着重概述 了重组蛋白分离纯化技术方法的应用情况。
在 中 性 条 件 下 ，根 据 多 肽 的 带 电 性 IEC 可 以 用 来分离、纯化具有生物活性的多肽，通常分为阳离 子柱与阴离子柱两大类及一些新型树脂。 如大孔型 树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶和 琼 脂 糖 凝 胶 树 脂 等[9]。 Garde 等[10]采 用 阴 离 子 交 换 色 谱 法 使 用 DE52 树 脂 纯 化 人 的 重 组 PSP94 蛋 白 ， 纯 度 大 于 98%。 在 多 肽 类 物 质 的 分 离 分 析 研 究 中 ，对 多肽的性质、洗脱剂、洗脱条件的研究较多，不同的 多肽分离条件有所不同， 特别是洗脱剂的离子强 度、盐浓度等对纯化影响较大。