毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选
毕赤酵母表达知识归纳
毕赤酵母表达知识归纳1a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。
D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。
在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。
天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。
b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中。
说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。
Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。
过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。
然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。
4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。
该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。
都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。
invitrogen手册上可以灭菌的。
酵母基因工程
2）碱金属离子介导转化法 酵 母 菌 完 整 细 胞 经 碱 金 属 离 子 ( 如 Li+) 、
PEG、热休克处理后，可高效吸收质粒DNA。 特点：
共转化现象极为罕见；
吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA， 二者相差80倍。
3）电击转化法
酵母菌完整细胞或原生质体可在电击下 吸收质粒DNA。 特性：
幻灯片 5
第二节 常用酵母表达系统
一、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
表达系统
酿酒酵母中的2环状质粒：
野生型，双链、环状，
REP1
FLP
IR
6kb，拷贝数50-100。 RAF A
STB
IRs: 反向重复序列，同源重组
ori IR
REP2
同源重组
FLP: 编码产物驱动IRs同源重组
四、酵母菌的转化方法 原生质体转化法 碱金属离子介导转化法 电击转化法
原生质体转化法
在Ca2+和PEG存在下，转化子可达原生质体 总数的1-2%。 特点： 1个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，这种 共转化的原生质体占转化子总数的25-33%； 对线型和环状DNA的吸收没有特异性。
原生质体转化法的缺点： 操作周期长； 转化率受原生质再生率的严重制约。
1974 Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵 母中存在质粒。
1978 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导 入另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷，标
志着酵母表达系统建立 1981 Hitzeman用酿酒酵母成功表达人IFN。 1983 我国首次用酵母菌表达HBV HBsAg基因。 1996 完成第一个真核生物--酿酒酵母全基因组测
毕赤酵母常用表达载体
毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
酵母菌表面展示的蛋白质工程操作步骤
酵母菌表面展示的蛋白质工程操作步骤酵母菌表面展示的蛋白质工程是一种重要的技术手段，可以用于研究蛋白质的结构与功能，以及开发新型的药物和生物材料。
下面将介绍酵母菌表面展示的蛋白质工程的操作步骤。
1. 选择适当的酵母菌株选择适合表面展示蛋白质的酵母菌株，常用的有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Hansenula polymorpha)。
根据实验的需要，选择相应的酵母菌株。
2. 构建融合蛋白的表达载体将目标蛋白与酵母菌表面展示蛋白的结构域进行融合，并将融合蛋白的基因插入酵母菌表达载体中。
选择适当的启动子、选择子和标签，确保融合蛋白的高效表达和方便检测。
3. 转化酵母细胞将构建好的表达载体导入酵母菌细胞中，通常采用化学法或电转化法将外源DNA转化到酵母细胞内。
经过培养和筛选后，得到表达目标蛋白的转基因酵母菌株。
4. 表达目标蛋白将转基因酵母菌株进行培养，提供适当的培养基和条件，促使目标蛋白的高效表达。
可以通过检测培养基中目标蛋白的浓度和预测蛋白的位置来确定表达效果。
5. 表面展示目标蛋白利用酵母菌表面展示蛋白质的特性，通过分子生物学的手段，使得目标蛋白质能够在酵母菌表面展示出来。
常用的方法有融合目标蛋白与表面展示蛋白的结构域、或者通过添加信号肽等方式，在酵母菌细胞表面定向展示目标蛋白。
6. 鉴定和纯化目标蛋白使用合适的实验方法和技术手段，对表面展示的目标蛋白进行鉴定和纯化。
例如，可以利用抗体的特异性进行检测，或者利用亲和层析等技术进行纯化。
7. 评估目标蛋白的功能对纯化获得的目标蛋白进行功能评估，例如测试其在特定条件下的结构稳定性、酶活性、配体结合能力等。
同时，还可以对目标蛋白进行结构解析，揭示其功能机制。
总结：酵母菌表面展示的蛋白质工程操作步骤主要包括酵母菌株的选择、构建融合蛋白的表达载体、转化酵母细胞、表达目标蛋白、表面展示目标蛋白、鉴定和纯化目标蛋白以及评估目标蛋白的功能。
一种高效快速鉴定酵母转化子的酵母菌落PCR方法
・研究报告・生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2013年第12期酿酒酵母是最简单的真核生物，同时又具有类似原核生物的生长特性，便于培养和进行遗传操作的优点，是一种模式真核生物和模式实验系统，被称为真核生物的“大肠杆菌”［1］。
它与人类的关系极为密切，是人类实践中应用较早的一类微生物［2］，同时它也被广泛用作基因克隆和表达的宿主菌。
为了鉴定克隆到酵母细胞内的外源基因，可以通过提取酵母基因组后通过PCR 扩增目的基因、与特异性底物形成水解圈、荧光基团、挑取单克隆进收稿日期： 2013-06-30基金项目：广东省科技计划（2012B020311005）作者简介：武可婧，女，硕士研究生，研究方向：微生物功能蛋白；E -mail ：wu.kejing@ 通讯作者：林蒋海，博士，副研究员，研究方向：基因工程，代谢工程；E -mail ：jianghai.lin@一种高效快速鉴定酵母转化子的酵母菌落PCR 方法武可婧 吕一鸣 李晶博 肖文娟 龚映雪 刘泽寰 林蒋海（暨南大学生命科学技术学院，广州 510632）摘 要： 酵母是一种重要的基因工程宿主菌，但是由于其细胞壁结构复杂牢固，普通的菌落PCR 方法的成功率较低。
为解决此问题，提供一种快速、简单、高效的酵母菌落PCR 方法。
该方法先利用溶壁酶溶解酵母细胞壁，然后利用热涨裂解细胞并进行PCR 反应。
此方法将酵母细胞裂解和PCR 在同一个PCR 管中完成。
试验结果显示此方法能成功扩增目的基因且成功率高。
将此方法应用于外源性内切葡聚糖酶（endoglucanase，EG）的酿酒酵母转化子筛选，经与基因组PCR 比较，菌落PCR 与基因组PCR 结果一致。
结果证明此方法具有良好的稳定性，适用于酿酒酵母转化子的快速筛选。
关键词： 酿酒酵母 菌落PCR 转化子 阳性克隆A Rapid and Efficient Yeast Colony PCR Method to Identify PositiveTransformantsWu Kejing L ü Yiming Li Jingbo Xiao Wenjuan Gong Yingxue Liu Zehuan Lin Jianghai（School of Life Science and Technology ，Jinan University ，Guangzhou 510632）Abstract: Yeast is an important host microorganism in genetic engineering and molecular cloning. However, because of the complex structure of their cell wall, ordinary colony PCR method has a low success rate. To address this problem, a fast, simple and efficient yeast colony PCR method was provided. In the novel method, a commercial available cell wall degradation enzyme, lyticase, was used to disrupt yeast cell wall and the resulted protoblast was then bursted by heating. Into the lysis mixture, other PCR components were added and PCR reactions were performed. In the current constructed method, the yeast cell lysis and PCR reaction were performed in one single PCR tube, which is convenient and easy to implement. The success rate of the novel method was relatively high compared to traditional ones. Using this method, the Saccharomyces cerevisiae transformants of exogenous endoglucanase（EG）were screened. Compared to PCR using genomic DNA, the results of colony PCR were consistent with those from genomic PCR. The results indicated that the novel method was of good stability, repeatability and suitable for the rapid screening of the S. cerevisiae transformants.Key words: Saccharomyces cerevisiae Colony PCR Transformant Positive clone行菌落PCR 等一系列方法来鉴定酵母转化后的阳性克隆。
毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍
由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。
整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。
在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。
为方便于操作，通常表达载体都是穿梭质粒。
表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式，单交换整合时，或插入A0X1位点，或插入his位点。
有文献报道，以his4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，偶而可使Laz表达盒丢失，故AOX1位点更好。
一般认为，单交换转化效率比双交换效率高，且易得到多拷贝整合，其发生机制可能是重复单交换引起的。
携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。
甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。
对于大肠埃希氏菌而言，只要把重组表达载体导入细胞体内即可。
因其载体上携带有自身复制原点，可随染色体复制而复制，重组表达载体能够稳定存在。
在甲醇酵母系统中，所有的表达载体均不含酵母复制原点。
这就是说，导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在，外源蛋白才能得到稳定表达，这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。
如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组表达载体极易丢失。
毕赤酵母转化子表型的菌落PCR鉴定方法研究
２１ ０ １年第 ３ ９卷第 ３期
一 ６ ３一
彭苗苗， 李晓玲 ， 张德春．毕赤酵母转化子表型的菌落 Ｐ Ｒ鉴定方法研究［ ］ Ｃ Ｊ ．江苏农业科学 ，０ １ ３ （ ） ６ ６ ２ １ ，９ ３ ：３— ４
毕赤酵母转化子表 型 的茵落 Ｐ Ｒ鉴定方法研究 Ｃ
彭苗苗， 李晓玲 ， 张德春
Ｍ １ ２ ３
中， 也有关 于酶裂 解 、 ａ Ｈ 煮浴 、Ｄ ＮＯ Ｓ Ｓ煮 浴等处 理的酵母 菌 落 Ｐ Ｒ， Ｃ 但是准确性 、 重复性有 待提 高 。
本研究对毕赤酵母转化子进行了菌落 Ｐ Ｒ分析 ， Ｃ 研究结 果 表明 ， 利用菌落 Ｐ Ｒ技 术鉴定 毕赤酵母 转化 子的表 型 ， Ｃ 不 仅 简单方便 ， 而且具有很好 的准确性 和重复性 。毕赤酵母 转
型 ） 型 或 Ｍｕ （ ｅｈｎｌ ｔｉ ｔｎｐｕ ， 表 ｔ ｍ ｔａｏ ｕｉｚ ｉ ｌｓ 甲醇 利 用 野 生 型 ） ｌ ａｏ
行菌落 Ｐ Ｒ分析 ， Ｃ 具体方法如下 ： 用牙 签挑取生 长 ４ ８ｈ重组 管 中， 入 ５ Ｕ ｌ ｉ ｓ 匀 ，０℃ 水 浴 ２ ｉ ，一８ ℃ 加 ｙ ｃ ｅ混 ｔａ ３ ０ｍｎ ０ ５ｍ ｎ 无菌水 稀释后 作为模 板 ， 行 Ｐ Ｒ分 析 ， 应体 系如 ｉ， 进 Ｃ 反
毕赤酵母 （ ｉ ｉ ｐ ｓ ｒ ） Ｐｃ ａ ａｔ ｉ 是一种比较成 熟的外源 蛋 白表 ｈ ｏｓ 达系统 ， 仅具有 高等真 核表达 系统 的许 多特 点 ， 蛋 白加 不 如 工、 折叠 、 翻译后修饰 等 ， 而且还具 有操作简单 、 成本低廉 、 外 源蛋 白表 达水平高等优点 … ， 已被广泛应 用于外 源蛋 白的表 达， 迄今 已有 数百种细菌 、 病毒 、 动植物及人 的外 源蛋 白在毕
毕赤酵母表达系统资料整理
毕赤酵母表达系统Mut+和Muts毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产品，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。
AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。
简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。
为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。
注意即使在甘油中生长(去抑制)时，仍缺乏以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必须的。
AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。
在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培养基中，不管是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。
Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts 在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。
菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。
GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可抵偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。
这些受体菌自发突变成组氨酸野生型的概率一般低于10-8。
GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts(载体取代AXO1基因)，可以在MM和MD培养基上鉴定表型。
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毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选 菌体的准备： 1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250-300r/min培养过夜； 2. 取100-500µl （≤1:100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜 (约20h)，至OD600 达到1.3~1.5； 3. 将细胞培养物于4℃，1500g 离心5min，用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬； 4. 按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬 5. 按步骤3 离心，用2-5ml，1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬； 6. 按步骤3 离心，用160µl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul； 备注：可将其分装为80 µl 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。 比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。 ✓ KM71比GS115生长的要慢。毕赤酵母都应该是白色菌落的 ✓ 对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入 Cu2+ 离子，提高表达量和蛋白活性? 菌种保存： 挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1:1加入30%灭菌甘油， -80oC ul/管冻存
（一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。 乙醇沉淀主要步骤如下： 1）酶切体系（80ul）中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC，混匀 2)-20℃ 20分钟沉淀 3)13200rpm，20min，离心后弃上清 4)75%乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清 5)37 度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。 6)20ul ddH2O重溶） 电击转化： 8. 将5~20 µ g 的线性化DNA 溶解在5~10 µ l TE溶液中，与80 µ l 的上述步骤6 所得的菌体混匀，转至0.2cm 冰预冷的电转化杯中； 9. 将电转化杯冰浴5min； 10. 根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击； 11. 电击完毕后，马上加入1ml 1M的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml 的EP管中；（置于30度摇床低速培养1h，再涂板） 12. 将菌体悬液涂布于MD平板上，每200~600 µ l 涂布一块平板； 13. 将平板置于30℃倒置培养，直至单个菌落出现 （3-4天）。
推荐：电压1.5kV ；电容25µF ；电阻200 Ω。电击时间为4 ～10msec。 Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法 1. 平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时）； 2. 取1ml酵母悬液4000rmp离心，pbs重悬，煮沸5mins，放到冰上5mins，直接就可以用做pcr的模板了 3. 将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。 3. 用灭菌的牙签挑取菌落，在PCR管中涮一下， PCR扩增， 利用5’AOX 1和3’AOX 1引物对转化子进行PCR复筛,同时检测基因插入(如果重组质粒以单交换的方式整合到Pichia pastoris基因组，则会扩增到两条带，一条为2.2kb（KM71为3.6kb）宿主茵AOXI基因，另一条为包括目的基因和成熟肽序列和a-factor信号肽序列的片段。) Each 50 µl aliquot of competent Pichia cells with 3 µg linearized plasmid DNA will yield 50 colonies on selective medium. Muts 表型重组酵母的诱导表达实验 As a general rule when inducing expression, never allow cultures to be more than 10-30% of your total flask volume. 1. 挑选一单菌落，置于装有50ml MGY、BMG 或BMGY培养基的500ml 摇瓶中，于28-30°C /250-300 rpm 培养至OD600 = 2-6 (~16-18 h)； 2. 室温下1500~3000g 离心5min，收集菌体，用1/5到1/10原培养体积的MM, BMM或 BMMY重悬菌体（约2.5~5ml ）； 3. 将步骤2 所得的菌液置于100ml 的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30 ° C/250-300 rpm 的摇床上继续生长； 4. 每24h 向培养基中添加100 ％甲醇至终浓度为0.5 ～1.0%； 5. 按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5ml EP 管中，最大转速离心2~3min ，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：0 、24、48、72、96和120h； 6. 对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液 氮或干冰速冻后，于-80 °C 保存备用； 7. 可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。
Mut+表型重组酵母的诱导表达实验 1. 挑选一单菌落，置于装有25ml MGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28-30°C/250-300 rpm培养至OD600 = 2-6 (~16-18 h)； 2. 室温下1500~3000g离心5min，收集菌体，用MM、BMM或 BMMY重悬菌体，使OD600 =1.0左右（约100~200ml）； 3. 将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30°C/250-300 rpm的摇床上继续生长； 4. 每24h向培养基中添加100％ 甲醇至终浓度为0.5～1.0%； 5. 按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5ml EP管中，最大转速离心2~3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h； 6. 对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C保存备用； 7. 可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。 BMGY和BMMY的换液方式有2种： 1） 一种是离心换液，即在生长培养结束后，转移到灭菌大离心管中，4000rpm室温离心5分钟后，用BMMY洗下菌体，再转移到摇瓶，整个过程均用灭菌移液管操作。 2） 另一种是静止换液，即在生长培养结束后，将摇瓶在无菌室静止4小时后，直接在酒精灯旁倾倒培养液，再加入诱导培养基，此种方法的缺点有少量生长培养基残留。 是离心换液或者静止换液，到底那个好，只有根据自己的实验结果来考量。如果只是从防治污染的角度来说，静止换液也好一些，因为操作毕竟少一些，速度也快。
用新开启的分析纯甲醇，一直放在无菌室里面，每次直接用灭菌TIP吸取加入摇瓶就可以了。也有人试过用膜过滤，结果膜都溶解了。
菌体是在BMMY中培养的，可以不用BMMY做对照，在600nm处测OD值，培养基和PBS光吸收都很低，PBS更方便。
麦芽浸提液培养酵母（不换液，补料），生长阶段结束后，密度可达到10-12，诱导培养结束后，密度可达到18左右。 如果用1体积的BMGY，在生长阶段结束后，换液时，加入1/10-1/2体积的BMMY进行诱导培养（即浓缩培养），细胞密度也可达到20以上。 通常，真正的高密度发酵只有在发酵罐里才能实现，OD600可达到40-60及以上。摇瓶很难达到那样的密度，不过可以采取浓缩培养的方式实现高密度。 摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量，但可以通过装量来暂时替代这个指标。
Mut+/Muts 的筛选 用Sac I，Sal I or Stu I 线性化插入HIS4 位点的载体转化GS155后，多数转化子应为Mut+，但也有His+Muts的转化子存在（见Invitrogen protocol p36），Not I or Bgl II线性化插入AOX I位点的载体转化GS155后，用MD/MM平板可区分Mut+/Muts。 Use the plates containing the His+ transformants and screen for the Mut+ and MutS phenotype as described below. 1. Using a sterile toothpick, pick one colony and streak or patch one His+ transformant in a regular pattern on both an MM plate and an MD plate, making sure to patch the MM plate first. 2. Use a new toothpick for each transformant and continue until 100 transformants have been patched (2-3 plates). 3. To differentiate Mut+ from MutS, make one patch for each of the controls (GS115/His+ MutS Albumin and GS115/His+ Mut+ β -gal) onto the MD and MM plates. 4. Incubate the plates at 30°C for 2 days. 5. After 2 days or longer at 30°C, score the plates. Mut+ transformants will grow well on both MD and MM plates. MutS transformants will grow well on MD plates, but show little or no growth on the MM plates.