流动相组成对保留值的影响
高效液相色谱法
3)极性键合相
常用氨基、氰基键合相。 可用作正相色谱得固定相,洗脱剂常用
非极性或弱极性溶剂,加入适量得极 性溶剂,以调节洗脱强度。 极性小得先出峰,极性大得后出峰。
22
正相色谱常用固定相结构
氰 基
-(CH2)3C=N
氨 基
-(CH2)nNH2 (n=3 or 4)
二 醇
-(CH2)3OCH(OH)CH2OH
等。
33
反相色谱得特点
A 适于分离带有不同疏水基团得化合物。 B 可通过改变溶剂组成与pH,来分离不同极
性得化合物。 C 可分离从极性到非极性得宽范围得化合物。
34
正相色谱得应用
正相色谱适用于分离极性化合物。如:酚 类、胺类、多环化合物、染料、炸药、羟 基化合物、氨基酸与药物等。这些样品在 正己烷或其它烷烃溶剂中得溶解度很小, 在极性溶剂中得溶解度良好。用正相色谱 分离可得到较好得效果。
2)装柱要求 均匀紧密、不破坏颗粒、不形 成裂缝 、颗粒粗细不可分级
53
3、色谱柱柱效得评价
最小理论塔板数 n＞104 分离度R≥1、5 拖尾因子 f =0、95-1、05 相对保留值得再现性
54
4、 色谱柱得保 养
注意流动相得纯化 防止堵塞与污染 柱得操作压力＜装填柱得压力 应该用进样阀进样 防止柱得反冲 贮存色谱柱时应防止干涸 使用保护(预)柱
11
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续保持安静
液-固吸附色谱固定相
HPLC固定相主要用硅胶。
(1)无定形全多孔硅胶 : YWG ( 2)球形全多孔硅胶:YQG (3)堆积硅珠:YQG
高分子多孔微球:YSG
13
化学键合相色谱固定相
将固定液得官能团键合在载体得表面 而构成化学键合相。
反相液相色谱中调整流动相组分比例对分离效果的影响
反相液相色谱中调整流动相组分比例对分离效果的影响黄强;李华勇;刘新国【摘要】用国标法同时测定苯甲酸、山梨酸和糖精钠,通过改变流动相组分比例,即改变流动相极性,对三种比例所得出的分离效果进行比较,考察了三种组分的保留时间、分离度及拖尾因子等参数变化.试验结果表明:(1)增加甲醇比例,三种待测组分保留时间都提前,且糖精钠的变化最大;(2)增加甲醇比例可以使三种组分的分离度和拖尾因子都变小,同时也可以满足对分离度的要求;(3)综合分析试验所得各参数,得出色谱系统所需最适流动相配比,实现较好的分离效果,试验的精密度也满足要求.【期刊名称】《江西化工》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】3页(P39-41)【关键词】液相色谱;流动相;分离度;系统适用性试验【作者】黄强;李华勇;刘新国【作者单位】江西省吉安市质量技术监督检测中心,江西吉安343000;江西省吉安市质量技术监督检测中心,江西吉安343000;江西省产品质量监督检测院,江西南昌33000【正文语种】中文反相色谱法是以表面非极性载体为固定相，以比固定相极性强的溶剂为流动相的一种色谱分离模式，是基于样品中的不同组分和固定相之间作用的不同而将各组分分离，具有柱效高、分离能力强、保留机理清楚等特点，是液相色谱分离模式中使用最为广泛的一种。
反相色谱系统中的固定相一般采用硅胶表面键合疏水基团，流动相首选甲醇-水系统，在一些大分子物质的分离中，多采用离子强度较低的酸性水溶液，添加一定量的乙腈或甲醇等与水互溶的有机溶剂作流动相。
色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个参数。
其中，分离度和拖尾因子是考察分离效果的重要指标。
实际检测中，各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应供试品并达到系统适用性试验的要求。
高效液相色谱法基本知识培训-化验员入门培训
改变α是改变后一组分相对于前一组分的保 留时间。α的改变可以选择不同的固定相或
流动相来实现。但改变固定相在液相色谱 中比较麻烦。如在一个色谱系统中,用二根 不同固定的柱子,则又必须考虑到流动相的
适应性。比较行之有效的办法是改变流动 相的极性,如采用连续改变流动相极性的梯
度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择 性。
k’= tR/tM-1= tR’/tM 可见,容量因子就是调整保留时间与死时间的 比值。在液相色谱中，k’只与固定相、流动相性 质及柱温有关,而与流速和柱尺寸无关。
理论塔板数n和塔板高度H
理论塔板数n是反映物质在固定相和流动相 中动力学特性的重要色谱参数,它是代表色 谱柱分离效能的指标。
计算公式为:
n=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 tR为保留时间, W为峰宽， Wh/2为半高峰宽 塔板高度H计算公式为： H=L/n L为色谱柱长度。
分离因子(α)及分离度（R）
1.分离因子(α) α= k2’/k1’=tR2’/tR1’ α代表了二个物质在相同的色谱条件下的分 离选择性。物质的化学性质或结构上的差 异,反映在与固定相和流动相之间作用力也 有所差异上。这就是色谱分离的基础。
中保留程度的参数,并作为色谱定性的指标。 其表示方法有保留时间、保留体积、调整 保留时间和调整保留体积。
保留时间和保留体积
一般认为,当进样量很小 时,样品从柱中流出呈高斯曲 线分布。从进样开始到峰极 大值所需时间时间称为保留 时间,以tR表示。由于流出时 间与流动相流速成反比,因此 又可用保留体积作为保留值 参数,以VR表示。VR=tR・FC 式中, tR为保留时间(min), FC 为流动相流速（ml/min)。
分类
化学键合相的分类可以有不同的依据。按 键合相的表面结构为单分子键合和聚合键 合；按性质分为Si-O-C,Si-O-Si-N,Si-O-S-C； 按键合有机硅烷的功能团分为极性键合相、 非极性键合相和离子性键合相三种。
HPLC中固定相和流动相
HPLC中固定相和流动相在色谱分析中,如何选择最佳的色谱条件以实现最理想分离,是色谱工作者的重要工作,也是用计算机实现HPLC分析方法建立和优化的任务之一。
以下是填料基质、化学键合固定相和流动相的性质及其选择。
一、基质(担体)HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质,也可以是有机聚合物基质。
无机物基质主要是硅胶和氧化铝,无机物基质刚性大,在溶剂中不容易膨胀;有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯,有机聚合物基质刚性小、易压缩,溶剂或溶质容易渗入有机基质中,导致填料颗粒膨胀,结果减少传质,最终使柱效降低。
1、基质的种类:1)硅胶硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。
除具有高强度外,还提供一个表面,可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基,制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。
硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。
缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。
通常,硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2~8。
硅胶的主要性能参数有:①平均粒度及其分布。
②平均孔径及其分布,与比表面积成反比。
③比表面积:在液固吸附色谱法中,硅胶的比表面积越大,溶质的k值越大。
④含碳量及表面覆盖度(率):在反相色谱法中,含碳量越大,溶质的k值越大。
⑤含水量及表面活性:在液固吸附色谱法中,硅胶的含水量越小,其表面硅醇基的活性越强,对溶质的吸附作用越大。
⑥端基封尾:在反相色谱法中,主要影响碱性化合物的峰形。
⑦几何形状:硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶,前者价格较便宜,缺点是涡流扩散项及柱渗透性差,后者无此缺点。
⑧硅胶纯度:对称柱填料使用高纯度硅胶,柱效高,寿命长,碱性成份不拖尾。
2)氧化铝具有与硅胶相同的良好物理性质,也能耐较大的pH范围。
它也是刚性的,不会在溶剂中收缩或膨胀。
但与硅胶不同的是,氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。
不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相,并显示出优秀的pH稳定性。
高效液相色谱习题及答案 (1)
高效液相色谱法习题一、思考题1．从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。
2．液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处? 3．在液相色谱中, 提高柱效的途径有哪些?其中最有效的途径是什么?4．液相色谱有几种类型? 5．液-液分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？6．液-固分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？7．化学键合色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？8．离子交换色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？9．离子对色谱的保留机理是什么?这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么?10．空间排阻色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？11．在液-液分配色谱中，为什么可分为正相色谱及反相色谱？12．何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？13．何谓化学抑制型离子色谱及非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理14．何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异同之处？15．高效液相色谱进样技术与气相色谱进样技术有和不同之处？16．以液相色谱进行制备有什么优点？17．在毛细管中实现电泳分离有什么优点？18．试述CZE的基本原理19．试述CGE的基本原理20．试述MECC的基本原理二、选择题1．液相色谱适宜的分析对象是（）。
A 低沸点小分子有机化合物B 高沸点大分子有机化合物C 所有有机化合物D 所有化合物2．HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为（）。
A 柱前压力高B 流速比GC的快C 流动相钻度较小D 柱温低3．组分在固定相中的质量为MA(g)，在流动相中的质量为MB（g），而该组分在固定相中的浓度为CA（g·mL－1），在流动相中浓度为CB（g·mL－1），则此组分的分配系数是( )。
流动相对色谱峰形及保留值的影响
? 有的药物在结构上同时含有酸性、碱性基团 , 却表现出不同 色谱行为。如环丙氟呱酸和氨甲苯酸呈碱性 , 丙谷胺为酸性 , 而氟呱酸却类似中性。磺胺类药物多为中性或呈弱碱性。
? 一般来说 , 碱性药物的保留值对 pH值的敏感性差异较大 , 保 留值大的药物对 pH值的敏感性较大 , 碱性药物对 pH值敏感 性在 pH>4 时显著增加 , 如酮康哇和益康哇。所以当分离碱 性或酸性药物采用的流动相 pH值在4左右时 , 要特别给予注 意, 以免影响分离度和峰序的改变 , 如环丙沙星与氟哌啶 , 地 卡因与普罗帕酮等在一之间发生峰序倒置。
所谓的促溶效应(chaotropic effect) ,被测物与盐相互作用, 离子化
的被测物相互间的排斥作用减弱 , 从而显著地影响被测物在固定
相上的吸附行为; 在制备色谱系统中或被测物浓度较高时, 流动相
中
应
含
有
足
量
的
缓
冲盐以改善色谱峰形和分离效果。
? 色谱柱的饱和容量可随缓冲盐的单价阳离子 (如Na + 、 NH4+ 、K+ 、Cs+ ) 直径的增加 而降低, 选用Na+ , 色谱 柱的饱和容量相对较高。
? 解离的化合物在固定相表面的相互排斥作用以及较难渗透 进入疏水性的固定相中也是可能的原因，采用反相高效液 相分离可解离的(尤其是碱性的) 化合物时色谱柱易于过载, 甚至低达 10ng 的碱性化合物也可使常规色谱柱的表观柱 效明显降低; 减少进样量则可改善色谱峰形并使表观柱效 显著增加;过载效应可随着流 动相的离子强度的增加而逐渐减弱。
甲醇∶ NH4H2PO4(0.025M) =55∶45
HPLC测验(1)
百度文库 HPLC测验一、填空题1.高效液相色谱法中的高压输液泵按照其工作原理可分为恒压泵和恒流泵。
2.高效液相色请仪通常包高压输液泵；进样系统; 分离系统; 检测系统; 梯度洗脱系统; 等部分。
3.液相色谱中的梯度洗脱技术与气相色谱中的程序升温技术类似,只不过前者连续改变的是流动相的种类和极性，而后者改变的是温度，前者适用于分离极性变化范围宽的样品,后者适用于分离沸点和极性差异大的样品。
4.流动相的极性小于固定相极性的液液色谱,称为正相分配色谐即亲水固定液采用疏水流动相,适合合于分离极性化合物，极性小的先流出，极性大的后流出。
5.利用化学反应将固定液键合到载体表面所制备的固定相称为化学键合固定相。
6.化学键合相色谱的重要优点是化学键合固定相稳定，使用过程中不易流失，适用于梯度洗脱，适合于分配比k'范围宽的样品分析。
7.高效液相色谱分析时,如果进样量超过柱容量(即超载),即柱效迅速降低，色谱峰变宽。
8.高效液相色谱的发展趋势是减小填充颗粒的大小和柱径以提高柱效。
9.改变流动相的组成和极性可以改善液相色谱的分离度及调整出峰的时间。
二、判断题（√） 1.在液相色谱中,常用做固定相，又可用做键合相载体的物质是硅胶。
（×） 2.在正相色谱体系中极性强的组分先出峰。
（× ) 3.流动相和固定相都是液体的色谱，称为液相色谱。
（√）4.液相色谐中流动相组成和极性的微小变化都会引起组分保留值的显著变化。
( √ ) 5.液液色谱中的梯度洗脱就是改变洗脱液(流动相)的组成和极性,以显著地改变组分的分离效果( √ ) 6.高效液相色谱法适用于大分子热不稳定及生物样品的分析。
( × ) 7.高效液相色谱法通常是采用降低分离温度和提高流动相流速来提高分离效果。
( √ ) 8.反相分配色谱法的流动相极性大于固定相极性,适用于非极性化合物。
( √ ) 9.化学键合固定相具有良好的热稳定性,不吸水,不易流失,可用于梯度洗脱的特点。
高效液相色谱实验技术问题解答
高效液相色谱实验技术问题解答高效液相色谱以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测。
1、高效液相色谱是如何实现高效、快速、灵敏的? 解：气相色谱理论和技术上的成就为液相色谱的发展创造条件，从它的高效、高速和高灵敏渡得到启发，采用5一10四微粒出定相以提高柱效，采用高压泵加快液体流动相的流速;设计高灵敏度、死体积小的紫外、荧光等检测器，提高检测灵敏度，克服经典液相色谱曲缺点，从而达到高效、快速、灵敏。
2、与气相色谱法相比高效液相色谱有哪些优点和不足? 解：气相色谱的分析对象是在校温下具有一定的挥发性、对热稳定购物质。
因此它只限于分析气体和沸点低的化合物或挥发性的衍生物。
而高效液相色谱由于以液体作为流动相，只要被分析的物质在选用的流动相中有一定的按解度，便可以分析，所以适用性广，不受样品挥发性和热稳定性的限制，特别适合于那些沸点高、极性强、热稳定性差的化合物，例如，生化物质和药物、离子型化合物、热稳定性差的天然产物等。
在目前已知的有机化台物中，只有20%样品可不经化学处理而能满意地用气相色谱分离，80%的有机化合物要用高效液相色谱分析。
气相色谱中流动相是惰性的，它对组分没有作用力，仅起运载作用、而高效液相色谱的流动相不仅起运载作用，而且流动相对组分有一定亲合力，可以通过改变流动相种类和组成提高分离的选择性，另外可作流动相的化合物多，选择余地广。
与气相色谱相比，高效液相色谱的另一个优点是样品的回收比较容易，只要开口容器放在柱子末端，就可以很容易地将所分离的各组分收集。
回收是定量的，可以用来提纯和制备具有足够纯度的单一物质。
高效液相色谱不足的是，日前检测器的灵敏度不及气相色谱。
必须特别注意“柱外效应”对柱效率及色谱分离的影响。
3、试比较气相色谱与液相色谱的H-u曲线，分析产生不同的原因。
解：从图可看出，气相色谱和液相色谱得到的H-u曲线，形状迥然不同，流动相的流速对柱效的影响也不一样，在气相色谱的H-u曲线上，塔板高度H随u变化呈双曲线.曲线有一最低点，这时柱效最高，板高最小，流速最佳。
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流动相组成对丹皮酚保留值的影响
一、目的要求
1、掌握流动相组成对保留值的影响。
2、熟悉高效液相色谱仪的使用。
二、仪器与试剂
仪器：LC-20AT型高效液相色谱仪，超声清洗器，超纯水器，微孔滤膜，微量进样器，注射器，试剂：甲醇（色谱纯），超纯水。
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三、方法原理
在反相高效液相色谱法，流动相的极性总是大于固定相的极性，固定相最常用的是非极性的十八烷基硅烷键合硅胶，而可做流动相的溶剂种类则很多。
并且可以组成不同配比的二元或多元溶剂系统。
反相高效液相色谱法中流动相极性增大，洗脱能力降低；流动相极性减小，洗脱能力增强。
四、色谱条件
色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（150×4.6mm）
流动相：甲醇-水
流速：1ml/min
检测器：SPD-20A
五、操作步骤
1. 开机准备
①流动相按要求用过滤装置过滤，超声脱气30分钟。
②用流动相配制一定浓度的样品和标准品（浓度相近），用微孔滤膜过滤。
2.开机
打开泵A和泵B的电源开关，将排液阀逆时针旋转180°按purge，灯remote亮，液晶显示purging line，等待，此时仪器自动排除气体；待液晶显示…ML、AX20.0、…MPA、MIN0.0…时，排气结束，将排液阀顺时针旋转180°，按pump键，灯pump亮。
②打开检测器电源开关，仪器自检，待液晶显示…nm OVER，自检结束。
③打开电脑主机和显示器。
3.方法设置
双击LC-solution（如要求填写密码，直接点击“确定”）
双击“分析”进入实时分析页面，左上方显示“LC：就绪”，窗口下方点击“正常”
“简单设置”-时间程序0.01min（默认）；泵：“等浓度洗脱”，设泵A（水）：0.3ml/min、泵B（甲醇）：0.7ml/min；（注：泵A、泵B流速之和为总流速），（或“二元高压”，总流速1.0min，B泵70% ）。
波长通道：274nm。
结束时间20min。
点击“文件”-“另存方法文件”-起文件名保存。
4.样品检测
①助手栏点击“单次运行”-填样品名，选择方法文件，填数据文件名称，自动递增√，进样体积20μl，确定。
将进样器手柄向下推inject，插针；进样器手柄向上拉load，推入样品（注意防止气泡进入），然后将进样器手柄向下推inject，分析自动开始。
数据自动保存。
注意：仪器运行开始后，将针头插入进样器中，同时盖好红色的保护帽。
②将当前方法文件中的流速比例调整为40：60和50：50，各测定一次。
记录数据。
注意：每次更改条件后，必须点击“下载”。
③在甲醇：水=60：40的流动相条件下测定标准品的保留时间，与相同条件下测定的样品比较定性。
六、数据记录
1、什么是反相色谱？其最常用的固定相和流动相是什么？
2、反相液相色谱法中，组分保留值的大小与组分的极性及流动相的极性有什么关系？。