实时定量逆转录聚合酶链反应检测大肠癌患者术前外周血 CK20 mRNA和CEA mRNA的临床意义
CK20mRNA在大肠癌患者外周血中的表达及意义
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Ｍｅ ｄ Ｗｅ ｉ ｆ ａ ｎ ｇ Ｖ ｏ １ ． ２ ９ Ｎ ｏ ． ． ４ ２ ０ ０ ７
为６ ０ ． ４ ％， Ｃ Ｋ ２ ０ ｍ Ｒ Ｎ Ａ在外周血 中阳性表 达与 Ｄ ｕ ｋ ｅ ｓ 分期、 淋
癌微 转移的研 究 较少 ， 其 表 达 的 阳性率 与 大肠 癌 患 者 临床 分 期、 组织学类 型等 的关 系还 不太 明确 ， 国内外 许 多学者 对其 研
究报道有一定 的争议 。本 试验 通过 巢式 Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ技 术对 ４ ８ 例不同临床分期 的大肠 癌患者 外周 血进 行检 测 ， 结 果发 现 ： 术
期愈 晚 ， 有区域淋 巴结转移 和远处转 移者 ， 外周 血 中 Ｃ Ｋ ２ ０ ｍＲ —
Ｎ Ａ阳性 表达 率越高 ， 预后亦 越差 。本研 究结 果同 时表 明 Ｃ Ｋ ２ ０ ｍ Ｒ Ｎ Ａ阳性表达率 与分 化 程度 、 肿 瘤部 位 、 患者性 别 无 明显 相
关。
关 于手术操作能否引起患者 血循环 中的微转 移 ， 以及后 期
表 ２ 手 术前、 后外周血 Ｃ Ｋ ２ ０ ｍ Ｒ Ｎ Ａ表达 比较
［ 参考文献 ］
［ １ ］ Ｆ ｕ ｎ ａ ｋ ｉ Ｎ Ｏ， Ｔ ａ ｎ ａ ｋ ａ Ｊ ， Ｏ ｈ ｓ ｈ ｉ ｏ Ｇ ， ｅ ｔ １ ａ ． Ｃ ｙ ｔ ｏ ｋ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｎ ２ Ｏ ｍ Ｒ Ｎ Ａ ｉ ｎ ｐ ｅ ．
巴结转 移 、 远处 转 移有关 （ Ｐ＜０ ． ０ ５ ） ；而与 分化 程度 、 肿 瘤部 位、 患者性别无显著相关性 （ Ｐ＞ ０ ． ０ ５ ） ， 见表 １ 。
表 １ 手术前外周血 Ｃ Ｋ ２ ０ ｍＲ Ｎ Ａ 表 达 与 临 床 病 理 关 系
实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测结肠癌患者血CK19mRNA水平及其意义
录聚合酶链反应， 检测结肠癌患者 ７ 例、 ５ 炎症性肠病（ Ｄ 患者 ３ 例、 Ｉ ） Ｂ Ｏ 健康志愿者 ４ 例外周血 Ｃ １ Ｒ Ａ的水 １ Ｋ ９ｍ Ｎ
平。结果 ：５例 结肠癌 患者外 周血 Ｃ ９ｍ Ｎ ７ Ｋ１ Ｒ Ａ的水 平为（ ２６０±７ ０ ）ｃｐｅ／ 。 中 ３ 阳性 。 １ ０ ３１０ ｏ ｉ ｍＬ 其 ｓ ９例 阳性率为
关键词 结肠肿瘤 肿瘤转移 逆转 录聚合酶链反 应 Ｃ ９ｍ Ｎ Ｋ１ Ｒ Ａ
肿瘤细胞在外周血液中的微转移是肿 瘤转移 复 １ ． 总 Ｒ Ａ提取与逆转录反应 总 Ｒ Ａ提取 ： ．１ ３ Ｎ Ｎ 采 发 的重要起始步骤之一。诊断肿瘤的微转移 ， 以判 集受检者 Ｅ Ｔ 可 Ｄ Ａ抗凝血 ２ｍ ， Ｔｉ ｌ氯仿、 Ｌ 用 ｒｏ、 ｚ 异丙醇 断肿瘤的预后 ， 监测疗效 。结肠癌是我 国现阶段发病 等试剂采用常规方法提取全血 Ｒ Ａ，并使用核酸蛋 Ｎ 率较高的恶性肿瘤之一 ，手术为最有效 的治疗手段 ， 白分析仪和 １ ％琼脂糖 电泳对提取 的 Ｒ Ａ进行 分 ． ５ Ｎ 然而术后生存率并不理想。 根治性手术后的患者中仍 析 ， Ｄ ６／ Ｄ ８ Ｏ ２０ Ｏ ２０比值在 １ － ． 之间并且 电泳显示 ． １ ７ 有 ２ ％一 ５ ０ ４ ％可 出现远处转移 ［， 因此早 期定 量检测 Ｒ Ａ 整的标本才用 于 以下操 作 。逆转 录反应 ： Ｎ完 取 出外周血 中的循环肿瘤细胞 ． 并及早有效地进行综合 Ｒ Ａ ０Ｉ ，０ 水浴 ５ｍｎ Ｎ １ Ｌ７ ℃ ｘ ｉ，加入逆转 录液 ，Ｏｍｎ ６ ｉ 治疗 。 具有重要的临床意义。本研究采用实时荧光定 后终止反应 ， 留取产物待用。 量逆转 录聚合 酶链反应 对结肠癌 患者外 周血 Ｃ １ １ ． 常规 Ｐ Ｒ及荧光 定量 Ｐ Ｒ 定量 Ｐ Ｒ采用 Ｋ９ ．２ ３ Ｃ Ｃ Ｃ ｍ Ｎ Ｒ Ａ进行定量检测 ． 并探讨其预测结肠癌细胞通过 上海久盛 医疗用 品有限公司生产的荧光定量检 测试 血源性播散的可能性 。 剂盒 ，在德国 Ｒ ｃｅ ｏｈ 公司 Ｌ ｈＣｃ 型仪上进行检 ｉ ｔｙｌＩ ｇ ｅＩ １ 材 料 与方 法 测， 引物和探针 由浙江大学肿瘤研究所提供 ， 申请 因 １ 标本来源 结肠癌组 ７ 例 ， ４ 例 ， ３ 例 ， 专利中 ，不便列 出序列 。常规 Ｐ Ｒ采用和荧光定量 ． １ ５ 男 ０ 女 ５ Ｃ 平均年龄 ５ ．岁 ． ２ ５ 所有病例 均经病理学确诊。炎症性 Ｐ Ｒ相同的引物序列 ， Ｃ 只是不作标记 。Ｃ Ｐ Ｒ反应体系 ： 肠病 （ Ｄ 组 ３ 例。对照组 ４ 例 ， Ｉ ） ０ Ｂ １ 均为健康 志愿者。 ５ Ｉ Ｄ Ａ，３５ Ｌ Ｈ ０， Ｌ缓 冲液 ， Ｌ Ｍ Ｃ２ Ｌｃ Ｎ ３ ． ２ ５ Ｉ ｘ ｘ ３ ｇ １， 各组受试对象均被抽取 ２ｍ Ｄ Ａ抗凝 的外周血作 １ｔ Ｎ Ｐ 上下游 引物各 １Ｉ ，ａＤ Ａ聚合 酶 ０ ＬＥ Ｔ Ｌｄ Ｔ ， Ｌ Ｌ Ｔｑ Ｎ ｘ ． ５ 为待测标本。 Ｌ 共 ５ Ｌ Ｃ ， ０Ｉ 。Ｐ Ｒ扩增条件 ：５ ５ｒｎ１ ｘ ９ ℃ ｉ 个循环 ； ａ １ 试剂和仪器 淋 巴细胞分离液购 自上海恒信化 ９ ℃ ３ ，２ １ ，２Ｃ １ ，０个 循 环 ；２ ． ２ ５ ０Ｓ６ ℃ ５ｓ７ｏ ５ｓ４ ７ ℃延 伸 学试剂公 司 ；ｒｏ 为 Ｌ ｅｈｏ ｇ ｓ 司产品 ： Ｔｉ ｌ ｉ Ｔ ｃｎｌ ｉ 公 ｚ ｂ ｏｅ 氯 １ ｉ。 ０ｍｎ 反应结束后 。 产物送上海 申能博彩公司进行测 仿、 异丙醇为 国产分析纯试剂 ； 常规 Ｐ Ｒ试剂从大连 序。实时荧光定量 Ｐ Ｒ反应体系： Ｉ Ｄ Ａ ９ Ｌ Ｃ Ｃ ５ ｘ ｃ Ｎ ，． Ｌ ５ Ｔ Ｋ Ｒ 公 司购买 ： Ｋ ９ｍ Ｎ ａａａ Ｃ １ Ｒ Ａ荧 光定 量 Ｐ Ｒ试剂 Ｄ Ｐ Ｃ Ｅ Ｃ水 ， ５ 缓冲液 ， ｗ ｇ Ｉ １ｘ Ｔ ， Ｌ ３ ＬＭ Ｃ２ Ｌｄ Ｐ上下游 ，Ｉ Ｎ 盒由上海久盛医疗用 品有限公 司提供 ；Ｃ Ｐ Ｒ产物测序 引物各 １ｘ ， Ｌ Ｌ ５ 荧光探针。ａＤ Ａ聚合酶 ０ Ｌ Ｉ Ｔｑ Ｎ ． ， ５ 由上 海 申能 博彩 公 司完 成 ；Ｋ ９ 量 试 剂为 美 国 共 ３ Ｌ Ｃ Ｃ １定 ０Ｉ 。Ｐ Ｒ扩增条件 ：５＝ ｉ， 个循环 ；５Ｉ ｘ ９ ｃ ５ｍｎ １ Ｉ ９ｃ ： Ｌ ｅｅ ｉ ｅｉ ｃ ｉ ｋｙＢ ｍ ｄ ｅｈ公司产品；核酸蛋 白分析仪为美 ３ ，２ １ ，２ １ ，０个 循 环 ；２ 延 伸 ｌ ｆ ｏ ｔ ０ｓ６ ℃ ５ｓ７ ℃ ５８４ ７℃ Ｏ 国 Ｂ Ｃ Ｍ Ｎ公 司的 Ｄ ８０型 ；Ｃ ＥＫ Ａ Ｕ０ Ｐ Ｒ扩增 仪为美 国 ｍ ｎ 反应结束后 ， ｉ。 由仪器软件 自动分析计算出定量结 Ｐ Ｅ公司 １０ ；实时荧光定量 Ｐ Ｒ仪为德国 Ｒ ｃｅ 果 。 ０型 Ｃ ｏｈ 公司 Ｌ ｈ ｙｌ Ⅱ型 ；酶标仪为美国 Ａ ａ ｎｓ 公司 １ ＿ 标准 曲线绘制 将标 准品 以 Ｄ Ｐ ｉ ｔ ｃｒ ｇＣ ｅ ｗ ｒ ｅｓ ｅ ．３ ３ Ｅ Ｃ水依 次稀 产 Ｓ ｔ Ｆｘ２０ ｔｅ ａ １０型。 ａ 释为 １ ｌ。ｌ １ １ １ １ １ ｏ ｉ ／ Ｌ ｘ ０、ｘ ０、Ｘ ０ 和 Ｘ ０ ｃｐ ｓｍ ，与待测 ｅ １ 实验方法 ． ３ 样品 同时进行定量 Ｐ Ｒ扩增检测 ，经荧 光定量扩增 Ｃ 仪扩增后 ， 由仪器软件 自动绘制标准 曲线 ， 作为计算 标本中 Ｃ Ａｍ Ｎ Ｅ Ｒ Ａ拷 贝数的依据 。 检测标本斜线图 ： 基金项 目： 台州市科技局科研 基金资助项 目（ 编号 ：５Ｋ ３ ） ０１ Ｙ ７ 相关系数 ＞Ｏ ８ 时 ， ． ５ 认为结果可信 。 ９ 作者单位 ：１００ 浙江省 台州市 中心 医院检验科 （ ３８０ 张黎明 ， 晓 吴 １ ． Ｃ １ 定量 使 用美 国 Ａ ａ ｎｓ 公司产 Ｓ ｔ ．４ Ｋ ９ ３ ｗｒ ｅｓ ｅ ｔｅ ａ 宇， 赖卫强 ， 李招 云）社 Ｘｆ诊 （ ， － 朱珊珊 ） ｌ 通讯作者 ： 李招 云 。－ ａ ：ｙ１１ ６． ｒ Ｅｍ ｉ １ ８５＠１３ ｏ ｌｚ Ｃｎ Ｆｘ２ ０ 型酶标仪 、ｉｋｙＢｏ ｅｉ ｃ ａ １０ Ｌｆ ｅ ｉ ｄ ｅｈ公司试剂 ， ｅ ｍ ｔ 采
胃肠道恶性肿瘤患者CK20 mRNA表达及其临床意义
RT-PCR方法是灵活很高的检测手段，并且简便准确。CK20作为标志基因对胃肠道恶性肿瘤外周血微转移进行检测，对于早期发现微转移，及时采取综合治疗，挺高生存率正确判断预后，有着极其重要的意义。
3 CK20在胃癌患者表达及其意义
胃癌是临床发病率较高的恶性肿瘤，根治手术的治愈率低于30%，这可能与病人手术后的淋巴系统、血循环、骨髓、干、肺等组织器官中存在者微小的细胞灶有关。以此微转移的检测对于转移早期发现、及时采取有效的综合治疗，改善预后具有相当重要的意义。CK20是细胞角蛋白的一种组分，在正常骨髓、血液淋巴结中均无表达，在几乎所有的胃肠道肿瘤中均明显表达，且在肿瘤侵袭、转移、扩散到其他组织器官时，CK20 mRNA的表达始终保持稳定。Nlert[4]等报道40％的胃癌患者外周血中检测到CK20mRNA。有研究显示，正常对照及胃良性病变组均未检测到CK20mRNA表达，而胃恶性肿瘤组有48．1％的表达，证实了CK20表达的特异性。因此，外周血CK20mRNA阳性表达可作为癌细胞血行播散的标志。
1 CK20
细胞角蛋白20 (cytokertin20,CK20)是由MOLL等[3]于1990年发现的一种多肽，它含424个氨基酸，分子量为48533，等电点5.66，其编码DNA总长18Kb，含8个外显子，7个内含因子局限于上皮细胞，是上皮源性恶性肿瘤微转移检测的敏感标志。
CK20的合成首先出现于8周胚胎肠粘膜上皮中，以后扩散到几乎所有的杯状细胞及数目不定的绒毛细胞中。不同于其他CK,CK20具有严格的上皮特异性，正常组织中CK20见于胃粘膜及幽门腺体细胞，十二指肠粘膜，泌尿道伞状细胞，表皮Merkel细胞，舌味蕾细胞，而非上皮细胞或组织如乳腺、平滑肌、血细胞、淋巴细胞、造血细胞均为阴性。但在许多癌中，如胃肠道、乳腺癌等CK20表达增强。CK20在侵袭、转移、扩散到其他组织器官时始终保持稳定，被认为是检测循环癌细胞的敏感标记物。
荧光定量PCR检测大肠癌患者外周血CK19mRNA、CK20mRNA和CEAmRNA的意义
荧光定量PCR检测大肠癌患者外周血CK19mRNA、CK20mRNA和CEAmRNA的意义李招云;戴岳楚;张黎明;吴晓宇【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2006(010)010【摘要】目的探讨荧光定量PCR技术检测大肠癌患者外周血CK19mRNA、CK20mRNA和CEAmRNA的临床意义.方法采用荧光定量PCR技术,检测大肠癌患者76例,健康志愿者30例外周血CK19mRNA、CK20mRNA和CEAmRNA水平.结果 76例大肠癌患者外周血CK19mRNA的水平为5 962.5±19926.1 copies/ml,其中38例阳性,阳性率为50.0%;CK20mRNA的水平为6 244.3±15 113.1 copies/ml,其中28例阳性,阳性率为36.8%;CEAmRNA的水平为7 377.0± 26 281.5 copies/ml,其中36例阳性,阳性率为47.4%.对照组30例未见表达.单项检测阳性率较低,联合其中二项检测阳性率较高,联合三项阳性率可达68.4%.结论外周血CK19mRNA、CK20mRNA和CEAmRNA可作为大肠癌微转移辅助诊断指标,联合二至三项指标有较高的检出率,定量检测有助于大肠癌微转移的监测.【总页数】3页(P1179-1181)【作者】李招云;戴岳楚;张黎明;吴晓宇【作者单位】台州市中心医院检验中心,浙江,台州,318000;台州市中心医院肿瘤外科,浙江,台州,318000;台州市中心医院检验中心,浙江,台州,318000;台州市中心医院检验中心,浙江,台州,318000【正文语种】中文【中图分类】R73【相关文献】1.荧光定量PCR检测肺癌外周血CEAmRNA CK19mRNA CK20mRNA临床意义[J], 陈晟;赵强;马胜林2.大肠癌患者外周血CEAmRNA和CK20mRNA的联合检测及临床意义 [J], 陈梓宏;梁荣;赖振南;王镇南;余忠华3.喉癌患者治疗前后外周血CK19mRNA、CK20mRNA的表达及临床意义 [J], 孟庆翔;谢景华;高雄辉;事明;王磊;李鹏4.胃癌患者外周血 CEAmRNA 和 CK20mRNA联合检测及意义 [J], 王玉文;任意;费建东;聂双发5.CEAmRNA、CK19mRNA、LUNXmRNA在非小细胞肺癌患者外周血微转移中的表达和意义 [J], 赵霞;刘亚丽;张立生;王丽因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
RT-PCR检测结直肠癌患者外周血中细胞角蛋白20 mRNA的表达
RT-PCR检测结直肠癌患者外周血中细胞角蛋白20 mRNA的表达张敏;丁昌平;韩芳;柳健;曹春梅;童建东【期刊名称】《实用医学杂志》【年(卷),期】2007(023)019【摘要】目的:栓测结直肠癌患者外周血中细胞角蛋白20(CK20)mRNA的表达,并探讨其临床价值.方法:应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应,检测59例结直肠癌患者、12例原发性肝癌患者和26例对照者外周血中CK20 mRNA的表达.结果:对照者及原发性肝癌患者外周血中CK20mRNA均为阴性表达.结直肠癌患者外周血中CK20mRNA阳性表达率为59.3%.结直肠癌患者外周血中CK20mRNA的阳性表达率在不同肿瘤病理分化程度中差异无显著性,而在不同Dukes分期和有无淋巴结转移及远处转移患者间差异有显著性(P＜0.05).结论:检测结直肠癌患者外周血中CK20 mRNA的表达可作为预测肿瘤微转移的评估指标,可监测患者病情变化,识别高危人群,并有助于结直肠癌微转移的判断及鉴别原发性肝细胞肝癌和结直肠癌肝转移.【总页数】3页(P3009-3011)【作者】张敏;丁昌平;韩芳;柳健;曹春梅;童建东【作者单位】225001,江苏省扬州市第一人民医院中心实验室;225001,江苏省扬州市第一人民医院中心实验室;225001,江苏省扬州市第一人民医院肿瘤科;225001,江苏省扬州市第一人民医院中心实验室;225001,江苏省扬州市第一人民医院中心实验室;225001,江苏省扬州市第一人民医院肿瘤科【正文语种】中文【中图分类】R73【相关文献】1.套式荧光实时RT-PCR检测结直肠癌患者外周血中CRD-BP mRNA [J], 王方金;何蕴韶;张常华;何裕隆;程钢2.定量RT-PCR法检测CK20 mRNA、CEAmRNA在胃肠道肿瘤外周血中的表达[J], 娄柏松3.定量RT-PCR检测结直肠癌患者外周血CK20 mRNA的表达 [J], 徐栋;李旭芬;蒋文智;曹江;郑树4.RT—PCR检测胃癌患者外周血中细胞角蛋白20mRNA及其意义 [J], 丁昌平;张敏;韩芳;龚岘;曹春梅;柳健;吴宝军5.RT-PCR检测子宫内膜癌患者外周血中细胞角蛋白20基因的表达 [J], 常爱华;王志宏;张瑞军;徐磊;孙圣凯因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
定量RT-PCR法检测CK20 mRNA、CEAmRNA在胃肠道肿瘤外周血中的表达
【 要】 目的 摘 检 测 胃癌 、 肠 癌 、 康 人 外 周 血 Ｃ ０ ｍＲ 大 健 Ｋ２ ＮＡ、 Ｅ ＮＡ 的 表 达 ， 讨 其 临 床 Ｃ Ａ ｍＲ 探
意 义 。方 法 用 定量 ＲＴ—Ｐ Ｒ 法检 测 外 周血 白 细 胞 中 Ｃ ０ ｍＲ Ｃ Ｋ２ ＮＡ、 Ｅ ＮＡ 的 含 量 ， 瘤 组 ３ Ｃ Ａ ｍＲ 肿 Ｏ
胚 抗原 信 使 核 糖 核 酸
本 试 验 胃癌 、 大肠 癌 外 周血 检 测 Ｃ Ａ ｍＲ Ｅ ＮＡ 敏 感 性 和 特 异 性
高 于 ｃ ０ｍＲ Ｋ２ ＮＡ， Ｃ Ａ ｍＲ 但 Ｅ ＮＡ 数 值 高低 与 分 期 无 关 ， Ｋ２ ＮＡ 的表 达 量 与 肿 瘤 分 期 有 关 。 两 ｃ ０ｍＲ
Ｋ２ ｍＲＮＡ、 ａ ｔ ｔ ｅｅ ｔ ｆＣ ０ ｔ ｖ ｏ ＣＥＡｍＲＮＡ ｎ ｐ ｒｐ ｅａ ｌｏ ｆｇ ｓｒｃａ ｄ ｃ ｌｒ ｃａ ａ ｃｒｐ — ｉ ｅｉｈ ｒｌｂｏ ｄ ｏ ａ ｔｉ ｎ ｏｏ ｅｔｌｃ ｎ ｅ ａ
ｔ ｎｓｂ ｅ Ｉ ｔ ｉ ｔ ｙｒａ— ｉ ＲＴ— Ｐ Ｌ ｅ ｍｅ ＣＲ ＯＵ ｉ ｓｎ Ｂａ — ｏ ｇ． （ ｑｈ ｒＦｒ ｔＨｏ ｐｔ１ ｈ ｅ ｅ ｔ ｉｉａ Ｈｏ — Ｑｉｉａ ｉｓ ｓ ｉ ，ｔ ｅＳ ｖ ｎ ｈＣｌ ｃ １ ｓ ａ ｎ
ｐｔ１ ｆＨａ ｂｎＭ ｅ ｉａ ｉｅｓｔ ．Ｈａ ｂｎ，Ｈｅｌｎ Ｊ ｎ ６ ０ ０Ｐ． ｉ ｒ ｉ ｄｃ １ ａｏ Ｕｎｖ ｒｉ ｙ ｒｉ ｉ ｇｉ ｇ １ １ ０ Ｒ． Ｃ ｉａ ｏ ａ ｈｎ ）
［ ｓｒ ｃ］ Ｏｂｅｔ ｅ Ｉ ｈｓｓｕ ｙ Ａｂ ｔａ ｔ ｊｃｉ ｎ ｔ ｉ ｔｄ ．ｗｅｄ ｔｃｅ ｖ ｅｅ ｔｄＣＫ２ ０ｍＲＮＡ ｎ ａ ｄＣＥＡ ｍＲＮＡ ｘ ｒｓｉｎ ｉ ｈ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｎｔ ｅ
荧光定量PCR检测大肠癌患者外周血CK19mRNA、CK20mRNA和CEAmRNA的意义
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用 于临床尿 蛋 白程 度 的评 估和 监测 。
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荧光定量PCR检测直肠癌患者外周血和淋巴结中CK20的表达和其意义
中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。
申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任．论文作者签名：盎主！整日期：塑篁：￡：￡中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。
本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。
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荧光定量ＰＣＲ检测直肠癌患者外周血及淋巴结中ＣＫ２０的表达及其意义前言直肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，在我国占全身癌肿第三位，而转移和侵袭是恶性肿瘤的重要特征，也是肿瘤患者死亡的主要原因，约有３０％～加％行根治术的患者于术后５年内出现转移或复发。
目前临床上对Ｄ汰ｅｓ’Ａ、Ｂ期患者术后是否需妥化疗或者哪些患者需要化疗尚存在分歧，那么外周血及肿瘤周围淋巴结中肿瘤细胞的阳性检出或许可能作为选择的标准。
细胞角蛋白ｚｏ（ＣＫ２０）是由Ｍｏｌｌ等予１９９０年发现的一种多肽，局限在胃肠上皮细胞，不同于其它ＣＫ，ＣＫ２０具有更为严格的上皮组织特异性。
正常组织中，ＣＫ２０见于肠粘膜细胞、胃粘膜及幽门腺体细胞、十二指肠粘膜、泌尿系伞状细胞、表皮Ｍｅｒｋｅ｜细胞，而其它正常组织如乳腺、平滑肌、血细胞、淋巴细胞、造血细胞等均为阴性。
ＣＫ２０在所有大肠癌几乎都明显表达且在侵袭、转移、扩散到其他组织器官时始终保持稳定，ＣＫ２０的分布特点使其成为良好的肿瘤标志物，因而成为肿瘤分子生物学领域的一个研究热点。
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实时定量逆转录聚合酶链反应检测大肠癌患者术前外周血CK20 mRNA和CEA mRNA的临床意义首席医学网2009年03月25日09:52:22 Wednesday73作者：周海茵，葛成华，王世伟，叶古祥，唐文贤，赵旭鸿，范珍妮作者单位：200090 上海，上海市杨浦区中心医院普外科（△中心实验室）【摘要】目的探讨大肠癌患者外周血CK20 mRNA和CEA mRNA的表达及其临床意义。
方法采用实时定量逆转录聚合酶链反应（QRT-PCR）技术，对68例大肠癌患者及30例健康志愿者（对照组）术前外周血CK20 mRNA和CEA mRNA水平进行检测。
结果在对照组中CK20 mRNA和CEA mRNA 均无表达，而在大肠癌组中CK20 mRNA阳性表达率为45.6%，CEA mRNA阳性表达率为39.7%，二者联合检测阳性率为55.9%，较单项检测阳性率高（P>0.05），二者的表达与性别、肿瘤部位和肿瘤分化程度无明显相关，与肿瘤临床分期、淋巴结转移和肝脏转移明显相关。
结论CK20 mRNA和CEA mRNA可作为大肠癌细胞血行播散的标志，联合检测有助于提高肿瘤微转移的检出率及判断预后。
【关键词】大肠肿瘤；微转移；外周血Clinical significance of CK20 mRNA and CEA mRNA in peripheral blood of patients with colorectal cancer by real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reactionZHOU Hai-yin,GE Cheng-hua,WANG Shi-wei,YE Gu-xiang,TANG Wen-xian,ZHAOXu-hong,FAN Zhen-ni.Department of General Surgery,The Central Hospital of Yangpu District,Shanghai 200090,China［Abstract］Objective To investigate the expression of CK20 mRNA and CEA mRNA in peripheral blood of patients with colorectal cancer and its clinicalsignificance.Methods CK20 mRNA and CEA mRNA were detected in 68 patients with colorectal cancer before operation,30 health adults by QRT-PCR.Results CK20 mRNA and CEA mRNA were undetected in the control group,the positive rate of CK20 mRNA among colorectal cancer patients was 45.6%,and of CEA mRNA was 39.7%.The positive rate of combination detection was 55.9%.It was higher than the rate of detectionalone.There was no statistically significant difference of positive rate between two detection methods.The expression of CK20 mRNA and CEA mRNA were not significantly correlated with sex of patients,the place of the tumor or differentiation level of cancer cells,but correlated with clinical stage,lymph nodes metastasis and livermetastasis.Conclusion CK20 mRNA and CEA mRNA were useful maker of blood dissemination of colorectal cancer cell and the positive rate of micrometastasis bemaybe raised by combination detection.The expression of CK20 mRNA and CEA mRNA may be regarded as a reference indicator.［Key words］colorectal cancer;micrometastasis;peripheral blood大肠癌是我国发病率较高的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年升高趋势，其术后复发及远处转移率达20%～45%［1］。
因此早期检测出循环癌细胞对判断肿瘤复发和转移及指导临床综合治疗有重要意义［2］。
1 对象与方法1.1 研究对象68例大肠癌患者选自2007年1月～2008年3月在我院接受手术治疗并经病理确诊的患者，男39例，女29例，年龄26～88岁，中位年龄65岁。
临床分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期24例，Ⅲ期27例，Ⅳ期11例。
肿瘤分化程度：高分化腺癌26例，中分化28例，低分化11例，未分化3例。
对照组30例健康志愿者来自同期我院健康职工。
1.2 仪器与试剂定量PCR仪（美国生物应用公司ABI7500），Trizol试剂（上海闪晶分子生物科技公司），CK20 mRNA和CEA mRNA PCR试剂盒（上海达为科生物科技公司）。
1.3 RNA提取采集对照组及大肠癌组患者术前肘静脉血5 ml（草酸钾抗凝），1 h内用淋巴细胞分离液分离有核细胞，将分离的有核细胞收集到1.5 ml离心管中，12 000 rpm 离心5 min,弃上清，在沉淀中加入Trizol 500 μl,混匀置室温10 min，加入氯仿200 μl混匀，4 ℃10 000 rpm离心5 min，吸取上层水相于1.5 ml离心管中，并加入2倍体积预冷异丙醇混匀，置-20 ℃冰箱20 min，4 ℃10 000 rpm离心10 min（以沉淀RNA）。
弃上清，用预冷75%酒精（DEPC处理水配制）500 μl漂洗一次，4 ℃10 000 rpm离心10 min，弃上清，留沉淀，充分吸尽残留液，65 ℃干式恒温器，干燥10 min，20 μl DEPC处理水融解RNA,-80 ℃保持待用。
1.4 逆转录反应制备cDNA 标本处理后的RNA 70 ℃预变性5 min，迅速置于冰浴以防RNA复性，反应体系的配制方法：RT反应液18 μl，M-MLV逆转录酶1 μl，RN asin 1 μl 加入离心管中混匀，在每个反应管中加入20 μl上述反应液，加入预变性的RNA 5 μl，37 ℃水浴60 min，95 ℃预变性5 min，以灭活M-MLV逆转录酶。
1.5 PCR扩增反应每管取PCR反应液43 μl，Taq酶2 μl加入总无菌离心管中混匀，每个反应管中加入45 μl上述反应液，加入RT反应液5 μl，95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，共40个循环，最后72 ℃延伸10 min；根据所获得的标准曲线得到各检测标本的浓度（copies/ml）。
1.6 结果判断以RNA浓度≥1.0×103 copies/ml为阳性，＜1.0×103 copies/ml阴性［3］。
1.7 统计学处理CK20 mRNA和CEA mRNA阳性率用百分率表示，采用EXCEL软件统计，率的比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。
2 结果2.1 CK20 mRNA和CEA mRNA的表达大肠癌组中CK20 mRNA阳性者的水平为（11 055.95±1 649.61）copies/ml，CEA mRNA阳性者的水平为（12 664.36±2 990.17）copies/ml。
CK20 mRNA和CEA mRNA在各组中表达列于表1。
表1显示大肠癌组CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性率分别为45.6%（31/68）和39.7%（27/68），对照组中CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性率均为0，大肠癌组CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性率之间差异无统计学意义（P＞0.05），CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性率在大肠癌组与对照组之间差异有显著统计学意义（P＜0.01）。
表1 CK20 mRNA和CEA mRNA在各组中的表达2.2 联合检测阳性率（至少一项阳性）与单项阳性比较大肠癌组中联合检测阳性率55.9%（38/68）较CK20 mRNA 45.6%（31/68）与CEA mRNA 39.7%（27/68）单项检测的阳性率有明显升高，但与单项比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.3 CK20 mRNA和CEA mRNA的表达与大肠癌临床病理因素的关系表2显示CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性表达在患者性别、肿瘤部位及分化程度之间比较差异无统计学意义，CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性表达在肿瘤临床病理分期之间比较差异有统计学意义（P＜0.05），CEA mRNA的阳性表达在淋巴结是否转移的患者之间比较差异亦有统计学意义（P＜0.05），而CK20 mRNA的阳性表达在淋巴结是否转移的患者之间比较差异有显著的统计学意义（P＜0.01），CK20 mRNA和CEA mRNA在肝脏有无转移患者阳性表达的比较差异有显著的统计学意义（P＜0.01），可见肿瘤分期越晚，淋巴结和肝脏转移者其阳性表达率越高。
表2 CK20 mRNA和CEA mRNA阳性表达与肿瘤临床病理因素的关系3 讨论大肠癌的复发和转移与其他恶性实体肿瘤一样，以微转移为基础和前提，然而常规检测方法不能有效检测出微循环中的癌细胞和微转移灶，因此术前不能及时发现微转移，不利于肿瘤的正确分期及治疗方案的制定，术后不能及时发现复发及转移，以致不能更好地改善预后和延长生存期［4］。
随着PCR技术的不断发展，实时定量PCR（QRT-PCR）技术能从106～107个细胞中检出1个肿瘤细胞，该技术具有敏感性高、特异性强、简单快速的优点，使外周血肿瘤微转移的检测成为可能［5］。