荧光定量PCR实验设计及优化_lxm概要
荧光定量PCR应用中的问题及优化方案
实时定量PCR应用中的问题及优化方案聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）自诞生之日起就决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法，而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具[1]。
随着分子生物学技术研究的不断进展，定量PCR技术取得了突飞猛进的发展，不仅建立了一系列的方法，而且也诞生了许多与这些方法相匹配的新型热循环仪和实验材料。
实时定量PCR(real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术，所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量[2]。
目前它作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，仅2000-2001年，收录在Medline上的以real-time PCR为关键词的文章就达一千多篇。
实时PCR技术较之与以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。
首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。
其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。
另外，它还可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增，即多重扩增[3,4,5]。
本文将对实时定量PCR目前的应用状况、仪器应用、新材料进展以及实验条件的优化作一综述。
实时定量PCR的应用现状实时定量PCR技术自1996年诞生以来，由于它显著的优越性，不仅广泛的应用于分子生物学的各个研究领域，而且也开始作为一种诊断手段应用于临床。
其应用涉及到的范围包括DNA、mRNA和病毒荷载量的定量，核酸多态性分析，基因突变分析等多个领域[3]。
Giulietti 等人[6]对用实时定量PCR测定细胞因子基因的表达作了详细的描述。
细胞因子是一种调节蛋白，它对免疫反应、炎症反应具有重要的调节作用，其量的改变常常与一些疾病，如炎症反应、自身免疫性疾病、移植排斥有密切的关系。
荧光定量PCR实验报告
荧光定量PCR实验报告一、实验目的1、掌握荧光定量PCR技术2、学习如何制备PCR反应体系3、了解实时荧光PCR数据分析4、检测DNA含量二、实验原理荧光定量PCR技术是一种基于PCR扩增原理的DNA分析方法，可定量检测DNA的含量，广泛应用于生物学、医学等领域。
该技术主要依靠荧光标记物，结合荧光信号强度进行定量分析。
PCR反应过程中，引物与模板DNA结合后在酶的催化下形成新的DNA链，每个PCR循环会翻倍模板量。
PCR扩增的温度曲线显示，PCR反应初期呈指数上升阶段，后期呈平台期，最后呈线性上升期。
荧光定量PCR技术基于PCR反应的初期、指数上升阶段的振幅与CT值（Crossing Threshold，荧光信号的阈值值点）之间的关系，对样品中靶序列的含量进行定量分析。
三、实验步骤以10μL体积计算，将荧光定量PCR反应体系制备如下表：试剂名称一次浓度最终浓度10μL体积SYBR Green 1x 1x 1μLdNTPs 10mM 0.2mM 0.2μLMgCl2 25mM 3mM 0.3μLTaq DNA Polymerase 5u/μL 0.04u/μL 0.04μLForward Primer - 0.2μM 0.2μLReverse Primer - 0.2μM 0.2μLTemplate DNA - 1ng-100ng 1μLddH2O - - 7.24μL2、装载PCR板将PCR反应体系均匀装到PCR板中，按照如下步骤进行：① 每组实验会使用96孔PCR板；② 取出PCR板后，先用蒸馏水清洗；③ 按照实验设计，合理地将合适的试剂组合均匀装出到每个孔中；④ 采用专用移液器，能够准确的移液。
3、进行PCR扩增反应在PCR扩增反应期间，我们将执行以下操作：② 进行荧光定量PCR反应；③ 在PCR反应过程中，分别记录下样品的CT值和所测基因的拷贝数；4、数据分析① 利用荧光定量PCR仪进行CT值分析，记录下每个样品的CT值；② 利用以下公式，将CT值成功转化成所测基因的拷贝数：DNA含量（ng）=拷贝数 X DNA分子量/ 6.02 X 10^23;③ 分别计算出每个样品的DNA含量；④ 利用所得数据，绘制出荧光定量PCR的结果图，并进行结果的解释。
荧光定量pcr实验原理及数据分析
阈值设定
确定荧光信号与背景噪声的界限， 用于计算Ct值。
标准化处理
消除实验间的差异，使数据具有可 比性。
荧光定量PCR数据质量控制
01Biblioteka 0203重复性检验
检查同一样本不同孔之间 的Ct值差异，确保实验可 重复性。
扩增效率评估
通过标准曲线计算扩增效 率，确保实验的准确性。
熔解曲线分析
检查产物的特异性，避免 非特异性扩增对结果的影 响。
荧光定量PCR技术特点
高灵敏度、高特异性、宽线性范围、可重复性好等。
荧光定量PCR技术分类
根据荧光标记物的不同，可分为探针法和染料法两大类。 探针法包括TaqMan探针法、分子信标法等；染料法包括 SYBR Green I染料法等。
02
荧光定量PCR实验原理
PCR技术基本原理
DNA聚合酶作用
PCR技术利用DNA聚合酶的酶促反应， 以单链DNA为模板，合成与之互补的 双链DNA。
多重荧光定量PCR技术的完善与应用
未来将继续优化多重荧光定量PCR技术，提高检测的准确性和通量，并拓展其在临床诊 断和个性化医疗等领域的应用。
与其他技术的融合与创新
荧光定量PCR技术可以与其他技术如质谱技术、蛋白质组学技术等相结合，实现多组学 数据的整合分析，为生物医学研究提供更全面的信息。
THANKS
酶浓度
酶的浓度直接影响扩增效率，需根据实验需 求进行优化。
dNTP浓度
dNTP浓度过高会导致非特异性扩增，过低 则会影响扩增效率，需进行优化。
反应体积
反应体积的大小会影响扩增效率和荧光信号 的检测，需根据实验需求进行调整。
05
荧光定量PCR技术在生物医 学研究中的应用
荧光定量pcr实验原理与应用
荧光定量PCR实验原理与应用一、引言荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR），是一种高灵敏、高特异性的基因定量技术。
它通过检测PCR反应过程中产生的荧光信号，可以快速、准确地测量目标DNA的数量。
荧光定量PCR不仅可以用于基因表达分析、突变检测等生物学研究，还在医学诊断、农业育种等领域得到了广泛应用。
二、原理荧光定量PCR基于传统PCR技术，结合了荧光探针技术，能够实时监测PCR反应过程中荧光信号的累积。
在PCR反应中，DNA模板经过多轮的变性、退火和延伸，产生指数级增加的目标DNA片段。
而将荧光探针引入PCR反应体系中，该探针由一个互补于模板DNA的序列和一个荧光物质构成。
在延伸过程中，荧光探针被3’-5’外切酶降解，导致荧光信号的释放。
通过荧光信号的监测，即可获得PCR反应过程中目标DNA的相对数量。
三、实验步骤荧光定量PCR实验通常包括以下几个步骤：1. DNA提取首先需要从样本中提取目标DNA。
DNA提取方法根据样本的来源，可以采用不同的方法，如酚-氯仿法、盐析法、商用DNA提取试剂盒等。
2. PCR反应体系准备根据实验设计确定PCR反应所需的试剂和体积。
PCR反应体系通常包括模板DNA、引物、荧光探针、核酸酶、聚合酶等。
其中，引物用于定义PCR扩增区域，荧光探针用于监测PCR反应过程中产生的荧光信号。
3. qPCR仪设置将PCR反应体系加载到qPCR仪中，设置PCR反应的温度和周期参数。
qPCR仪通过控制温度，实现PCR反应的变性、退火和延伸过程，并监测PCR反应过程中的荧光信号。
4. PCR反应进行将PCR反应体系置于qPCR仪中，开始PCR反应。
qPCR仪会根据设定的温度和周期参数依次进行PCR反应。
在反应过程中，qPCR仪会实时监测PCR反应体系中的荧光信号，并将信号数据输出。
5. 数据分析通过数据分析软件对荧光信号进行处理，得到PCR曲线和相应的荧光阈值。
实时荧光定量PCR实验体系的设计与优化
实时荧光定量PCR实验体系的设计与优化荧光定量PCR以其精确、快速、方便，越来越多的应用在科研、临床及检验检疫的各个领域。
但是定量PCR是对精确性要求很高的实验，不仅要求在实验前有比较完整的实验设计方案，而且实验的条件对实验结果的影响也非常大。
这些都是很多老师与学生非常关心的问题，下面分别从这两个方面来对定量PCR实验做一些阐述。
定量PCR实验步骤（以mRNA为例）：1.设计实验方案：例如对样品、实验组和对照组的一个实验流程设计2.引物和探针的设计和合成3.抽提RNA，测定提取的RNA的浓度4.反转录PCR5.定量PCR6.数据分析在进行定量PCR实验的过程中，PCR的扩增效率是一个非常重要的影响因素，因为定量PCR原理的理论方程是基于扩增效率最大值1，因此高的扩增效率能保证定量PCR实验的精确性及重复性，影响PCR扩增效率主要有以下几个方面：1，扩增子的长度；2，扩增子的GC含量；3，扩增子、引物和探针的二级结构；4，PCR反应各组分的浓度；5，RNA 或者cDNA的纯度。
进行定量PCR实验时，必须设计好引物和探针，除了能获得高的扩增效率外，对PCR扩增的特异性、消除DNA的扩增及提高扩增的灵敏度都有很大的影响。
下图就是使用不同的引物和探针对18SRNA进行定量PCR的荧光曲线图（反应条件和模板都相同）。
引物设计原则：1.上下游引物要保守为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行PCR扩增。
所以引物的选取也要非常的保守。
2.上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。
3.确保引物中GC含量在30-80%。
应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。
引物的3’端最好不为G或/和C。
引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。
4.避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。
荧光定量PCR应用中的问题及优化方案
实时定量PCR应用中的问题及优化方案聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）自诞生之日起就决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法，而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具[1]。
随着分子生物学技术研究的不断进展，定量PCR技术取得了突飞猛进的发展，不仅建立了一系列的方法，而且也诞生了许多与这些方法相匹配的新型热循环仪和实验材料。
实时定量PCR(real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术，所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量[2]。
目前它作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，仅2000-2001年，收录在Medline上的以real-time PCR为关键词的文章就达一千多篇。
实时PCR技术较之与以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。
首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。
其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。
另外，它还可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增，即多重扩增[3,4,5]。
本文将对实时定量PCR目前的应用状况、仪器应用、新材料进展以及实验条件的优化作一综述。
实时定量PCR的应用现状实时定量PCR技术自1996年诞生以来，由于它显著的优越性，不仅广泛的应用于分子生物学的各个研究领域，而且也开始作为一种诊断手段应用于临床。
其应用涉及到的范围包括DNA、mRNA和病毒荷载量的定量，核酸多态性分析，基因突变分析等多个领域[3]。
Giulietti等人[6]对用实时定量PCR测定细胞因子基因的表达作了详细的描述。
细胞因子是一种调节蛋白，它对免疫反应、炎症反应具有重要的调节作用，其量的改变常常与一些疾病，如炎症反应、自身免疫性疾病、移植排斥有密切的关系。
荧光定量PCR实验设计及结果分析
荧光定量PCR实验设计及结果分析荧光定量PCR（qPCR）是一种基于Polymerase Chain Reaction（PCR）技术的高灵敏度、高特异性的核酸定量方法。
它通过测量PCR反应体系中特定荧光染料的荧光信号，来实现对目标DNA或RNA的定量分析。
在荧光定量PCR实验设计中，需要考虑样品的选择、引物和探针的设计、实验条件的优化等方面的因素，并根据实验结果进行分析。
实验设计：1.样品选择：根据研究目的选择合适的样品，可以是细胞、组织或者提取的DNA/RNA样品等。
2.引物和探针的设计：根据目标序列的特点设计适当的引物和探针，确保其在PCR反应中的特异性和有效性。
3.实验条件的优化：优化PCR反应条件，包括温度、循环次数、荧光染料浓度等，以提高反应的特异性和灵敏度。
4.标准曲线的制备：通过稀释不同浓度的目标DNA或RNA来制备标准曲线，用于定量目标序列在待测样品中的存在量。
实验步骤：1.样品提取：根据实验需要选择合适的样品提取方法，提取目标DNA或RNA。
2.引物和探针设计：根据目标序列的特点，设计合适的引物和探针。
3.PCR反应：将提取的DNA或RNA与引物和探针一起加入PCR反应体系中，进行PCR扩增反应。
4.荧光信号检测：在每个PCR循环结束后，使用荧光探测仪读取PCR 反应管中的荧光信号。
5.数据分析：根据标准曲线，计算待测样品中目标序列的存在量。
结果分析：1.标准曲线的分析：利用标准曲线中各个浓度点的荧光信号与目标序列存在量的关系，计算出待测样品中目标序列的存在量。
可以通过软件进行自动计算，得到定量结果。
2.目标序列的存在量：根据定量结果，可以比较不同样品中目标序列的存在量，分析不同样品之间的差异或相似性。
3.PCR效率的评估：通过标准曲线的斜率来评估PCR反应的效率，斜率越接近-3.3，反应效率越高。
4.优化实验条件：根据结果分析，可以对实验条件进行优化，提高荧光定量PCR的灵敏度和特异性。
荧光定量PCR技术的优化与应用
荧光定量PCR技术的优化与应用PCR技术是一种基于DNA聚合酶的反应，可以在短时间内制备出大量的DNA复制物。
PCR技术在现代生物学研究和医学诊断中广泛应用，荧光定量PCR是一种利用荧光信号进行定量分析的PCR技术。
在该技术中，荧光探针与PCR反应体系中的DNA结合，通过探针荧光强度变化，可以对PCR扩增产物进行定量分析。
本文将探讨荧光定量PCR技术的优化与应用。
一、荧光探针的选择与设计荧光探针是荧光定量PCR技术的核心。
荧光探针分为两种，分别是互补探针和融合探针。
互补探针是包含荧光染料和靶序列互补的短链寡核苷酸探针，当这种探针与靶序列结合时，荧光被激发发出信号。
融合探针是由两个长链寡核苷酸通过接头连接而成的探针，其中一个链上带有荧光染料，另一个链上带有荧光淬灭剂。
当探针与靶序列结合时，荧光染料与淬灭剂分离，荧光被激发发出信号。
在选择荧光探针时需要考虑以下两个因素。
首先，荧光探针的选择要根据实验设计的要求来进行。
例如，如果实验需要同时检测多个信号，那么就需要选择多种荧光探针分别标记各个靶序列。
其次，探针设计需要考虑到检测靶序列的特异性与灵敏度。
对于特异性，探针的序列长度应该足够长，以确保只与目标序列结合，避免误差。
对于灵敏度，需要控制探针的荧光强度，以避免信号过强或过弱，影响扩增结果。
二、PCR反应条件的优化PCR反应条件的优化对荧光定量PCR技术的灵敏度和特异性有着重要的影响。
下面将分别讨论PCR反应体系、探针浓度和热循环条件的优化。
PCR反应体系的优化：PCR反应体系通常包括模板DNA、引物、聚合酶、荧光探针和一些辅助物质。
在荧光定量PCR中，需要控制荧光信号的强度和稳定性，常用的办法是控制反应体系中的荧光染料的浓度。
然而，荧光染料浓度过高容易导致信号饱和，推荐的荧光染料浓度一般为5-40nM。
探针浓度的优化：荧光定量PCR的灵敏度是探针浓度关键因素，探针浓度过低容易导致荧光强度不足，探针浓度过高则容易导致荧光饱和。
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NTC sample 1 sample 1 sample 2 sample 2 original 1:1 0 original 1:10
Template DNA
undiluted and 1:10 dilution
Format SYBR Green I LIghtCycler® DNA Master
引物3’端最后5个碱基有2个以上的G或C 引物3’端最后1个碱基为A
GC含量
40 - 60 % GC GC/AT分布大致均衡,C含量>G
65－70°C
探针复性温度
引物复性温度
60－65°C
3
3
PCR引物与探针
标记 PCR产物长度 淬灭基团采用无荧光背景的如BHQ, 不要用tamra 50－150bp
NTC (no template control) for each primer pair positive control (if available)
MgCl2 Concentration: 2 - 5 mM
9
Basic Optimization in PCR
Use any template nucleic acid (NA) suitable for PCR, sufficiently purified and free of PCR inhibitors
melting curve (杂交探针等模式): 突变检测或亚型分析
8
Standard Conditions in PCR
Template Primers Probes Controls
DNA or cDNA 0.5 µM each (final concentration) 0.2 µM each (final concentration)
6
PCR的建立与优化
PCR试剂体系
引物、探针的设计
核酸纯化与逆转录
7
建立新的PCR体系:
General Hints
模板 - DNA或 cDNA 为模板
对照 - NTC (no template control) 每个探针引物组合 - 阳性对照 (如果可能) 分析 - 扩增: sensitivity and efficiency of PCR (crossing points) - 熔解曲线分析 (SYBR Green I format):检测引物二聚体或其 它非特异性扩增 凝胶电泳: 验证非特异性扩增
Design
primer design software，选择序列保守区域
如果保守区域太短，可以在引物中考虑引入
LNA提高Tm
探针可以考虑引入LNA或改用MGB或自淬灭 taqman探针
简并引物或探针需要同时考虑多种情况下的Tm高低4PC Nhomakorabea引物与探针
• SNP的Taqman双色检测中，突变探针一般Fam标记
10
Basic Optimization:
MgCl2 Titration
• MgCl2 Titration: 2 - 5 mM
• Format: SYBR Green I • LC FastStart DNA Master
11
Basic Optimization:
Template Concentration
Example: Universal ProbeLibrary assay
• Higher primers/probe concentrations give better signal to noise ratio (higher fluorescence signal intensitiy)
• Only minor influence on Cp when used in medium concentration ranges
NA Storage Store nucleic acids in high concentrations and aliquots For low template concentrations, use siliconized tubes and add carrier NA (10 ng/µl), e.g. MS2 RNA
Template Concentration: genomic DNA
plasmid DNA RNA cDNA and 1:100 dilutions
建议测试多个稀释度 (最少2个梯度,10^2) 50 ng - 5 pg
approx. 106 copies ≤ 500 ng total RNA or 100 ng mRNA ≤ 50 ng equivalent of total RNA ，RT product undiluted, 1:10
荧光定量PCR实验设计及优化
picture placeholder
PCR的建立与优化
PCR试剂体系
引物、探针的设计 核酸纯化与逆转录
2
PCR引物与探针
长度 序列 16 - 24 bases（引物） 不能有以下情况： 任意2个引物或探针之间的序列互补 引物或探针本身有二级结构
连续的> GGG，引物的5’端有G
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SYBR Green I Format PCR Analysis Example
模板拷贝数越低，越容易出现引物二聚体
Quantification
Melting Curve Analysis
13
Optimization:
Influence of PCR Inhibitors
• 相对定量分析中内参基因一般Hex标记 (例如Roche的UPL相对定量解决方案)
• 对检测要求更高的建议Fam标记(灵敏度或者 定量 vs 定性) 扩增效率较差的建议Fam标记
5
Reaction Conditions
Primers and Probes
Concentration Range (final con.) • Primers: 0.1 µM – 1.0 µM each • Probes: 0.1 µM – 0.5 µM Standard Concentrations (final conc.) • Primers: 0.5 µM each • Probes: 0.2 µM