实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR国际化标准(二)2024
实时荧光定量PCR国际化标准（二）引言概述实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种高灵敏、高特异性的核酸检测技术，广泛应用于疾病诊断、基因表达分析和药物研究等领域。
为了实现方法和数据的国际标准化，国际上制定了实时荧光定量PCR的国际化标准。
本文旨在介绍实时荧光定量PCR国际化标准的主要内容。
正文内容一、技术要求1.1 具备规范的实验室条件，包括洁净、无尘、无RNA酶污染的实验环境。
1.2 使用具有良好稳定性、一致性和可追溯性的荧光探针和引物。
1.3 验证实验室使用的仪器设备，确保其精确、重复性和灵敏度符合国际标准。
二、质量控制2.1 建立质量控制体系，包括核酸提取、反转录、荧光探针标记等各个环节的质量控制。
2.2 使用合适的内部参照基因或内质控，用于验证试剂盒、仪器设备和实验操作的稳定性和可靠性。
2.3 建立监控样本和质控品的库存管理系统，确保其有效性和可追溯性。
三、方法标准化3.1 设计标准化的实验操作流程，包括样品制备、反转录、PCR 扩增和数据分析等。
3.2 使用适当的PCR引物和荧光探针，根据模板序列设计合理的引物和探针。
验证其特异性和灵敏度。
3.3 建立标准曲线和基准值体系，用于测定目标基因的定量结果，并进行结果的准确性评估。
四、数据分析和结果解释4.1 使用统一的数据分析软件，对实时荧光定量PCR的原始数据进行操作和分析。
4.2 建立标准化的数据处理流程，包括定量结果的计算、统计学分析和差异性评估。
4.3 结果的解释应基于严谨的科学依据和合理的统计学方法，避免主观性和片面性的评价。
五、结果报告和数据共享5.1 根据实验结果的重要性和可信度，及时撰写实验报告，并以适当的形式进行存档和备份。
5.2 结果报告应明确标注实验过程、方法参数、核心数据和评估结果，以便他人能够验证和复现实验结果。
5.3 鼓励将实验结果和数据共享，提供底层数据和分析工具的访问权限，促进实时荧光定量PCR的进一步发展和应用。
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR原理1.PCR基本原理PCR通过在不断循环的体系中复制和放大特定DNA片段，从而实现DNA的快速扩增。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA的双链结构被解开，形成两条单链DNA。
在退火步骤中，引物与目标DNA的互补序列结合，形成引物-目标DNA结合复合物。
在延伸步骤中，DNA聚合酶通过追加互补碱基，并使用引物作为起始点，在目标DNA的基础上合成新的DNA链。
实时荧光PCR是对传统PCR技术的改进，它通过添加荧光探针（也称为探针引物）来实时监测PCR反应的进程。
荧光探针通常由两部分组成：一个荧光标记物和一个定向增效子。
在PCR反应的延伸步骤中，荧光探针与目标DNA的互补序列结合，并被PCR酶切割，导致荧光信号被释放。
3.原理图解实时荧光PCR通常需要使用一个双喷嘴热循环仪（Thermal Cycler），其中一个喷嘴用于控制样品的温度，另一个喷嘴用于实时监测PCR反应的进程。
具体的PCR反应流程如下：-备制PCR试剂：将PCR反应所需的试剂混合均匀，包括DNA模板、引物、荧光探针和内参物。
-生成PCR产物：通过一系列的循环反应，将DNA模板放大成大量的PCR产物。
-荧光信号监测：PCR反应过程中，荧光探针与PCR产物的结合会释放荧光信号。
实时荧光PCR系统通过探测和记录PCR反应体系中的荧光信号，并在每个循环结束时测定信号强度。
4.数据解读和PCR效率计算实时荧光PCR的结果通常以荧光信号的周期阈值（Ct值）表示，Ct值是荧光信号强度超过背景噪音的循环数。
Ct值越低，表示PCR产物浓度越高，反之亦然。
根据Ct值，可以计算PCR的效率。
效率（E）的计算公式为：E =10^(-1/slope) - 1，其中slope为荧光曲线的斜率。
效率越接近1，表示PCR反应越有效。
5.RT-qPCR的应用RT-qPCR可应用于多个领域，包括基因表达分析、病原体检测和药物开发等。
实时荧光定量pcr的原理
实时荧光定量pcr的原理实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是一种用于检测DNA或RNA的数量的分子生物学技术。
它通过利用荧光探针实时监测PCR反应过程中的DNA合成情况，从而可以快速、准确地定量目标序列的数量。
实时荧光定量PCR的原理基于PCR技术和荧光探针技术的结合，具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，因此被广泛应用于基础研究、临床诊断、环境监测等领域。
实时荧光定量PCR的原理主要包括PCR反应、荧光探针和检测系统三个方面。
首先，PCR反应是实时荧光定量PCR的核心步骤。
PCR反应通过不断循环的高温变性、低温退火和中温延伸，使目标DNA序列得以扩增。
在每一个PCR循环中，目标序列的数量呈指数增长，这种指数增长的特点为后续的定量提供了基础。
其次，荧光探针是实时荧光定量PCR的关键。
荧光探针是一种含有荧光染料和荧光淬灭剂的寡核苷酸探针，它与目标序列特异性结合，并在PCR反应中被3'→5'外切酶切割，释放出荧光信号。
荧光信号的强度与目标序列的数量成正比，因此可以通过监测荧光信号的变化来实现对目标序列数量的实时定量。
最后，检测系统是实时荧光定量PCR的重要组成部分。
检测系统包括荧光定量PCR仪和数据分析软件，它能够实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度，并将荧光信号转化为目标序列的数量。
通过合理设置PCR反应条件和分析荧光信号的曲线，可以实现对目标序列的快速、准确定量。
总的来说，实时荧光定量PCR的原理是基于PCR技术和荧光探针技术的结合，通过PCR反应、荧光探针和检测系统三个方面的协同作用，实现对目标序列数量的实时定量。
这种原理使实时荧光定量PCR成为一种高效、快速、准确的分子生物学技术，为科研和临床诊断提供了重要的技术支持。
实时荧光定量pcr的原理
实时荧光定量pcr的原理实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是一种用于测定DNA或RNA在样本中的数量的技术。
它可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号，从而实现对目标序列的定量分析。
实时荧光定量PCR在生物医学研究、临床诊断、环境监测等领域具有广泛的应用价值。
实时荧光定量PCR的原理基于PCR技术，但在PCR反应过程中引入了荧光探针，使得PCR过程中的荧光信号与目标序列的数量成正比。
下面将详细介绍实时荧光定量PCR的原理。
首先，实时荧光定量PCR需要使用一种荧光探针，通常有两种类型，双标记探针和DNA间接染料。
双标记探针是一种含有荧光素和荧光淬灭剂的探针，当它与目标序列结合时，荧光素和淬灭剂之间的距离被拉大，从而导致荧光信号的增加。
DNA间接染料则是一种无需特定探针的染料，它可以与PCR产物结合并发出荧光信号。
其次，实时荧光定量PCR需要使用一种特殊的PCR仪器，称为实时荧光定量PCR仪。
这种仪器可以在PCR反应过程中实时监测荧光信号的强度，并将其转化为目标序列的数量。
实时荧光定量PCR仪器通常配备了特定的软件，可以自动分析荧光信号的强度，并计算出目标序列的起始数量。
最后，实时荧光定量PCR的原理是基于荧光信号与目标序列数量成正比的关系。
在PCR反应过程中，荧光信号的强度随着PCR产物的增加而增加，从而可以通过监测荧光信号的动态变化来实现对目标序列的定量分析。
实时荧光定量PCR可以实现高灵敏度、高特异性和高准确性的目标序列定量分析，因此在科学研究和临床诊断中得到了广泛的应用。
总之，实时荧光定量PCR是一种基于PCR技术的定量分析方法，它利用荧光探针和实时监测荧光信号的PCR仪器，可以实现对DNA或RNA目标序列的高灵敏度、高特异性和高准确性的定量分析。
实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断和环境监测等领域具有广泛的应用前景。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量（Real Time quantitative PCR）是检测RNA或DNA的一种常用技术，通过检测特定目标的增加（或减少），可以用来测定RNA 或DNA的表达水平，或者基因等的转录水平。
下面我们就对实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的实验步骤进行具体介绍。
1.搭建实验
第一步是搭建实验，即准备实验所需的干燥试剂，第二步是准备RNA 样本，第三步是准备标准曲线，最后是根据实验需要准备实验板和实验试管。
2、RNA样品提取
在实验中，会使用到多种RNAs，一般情况下使用TRIzol或Phenol 抽提方法进行RNA抽提，不同的细胞、组织中RNA的杂质含量不一样，因此需要根据实验需求进行适当调整抽提浓度。
3、RT-qPCR反转录
在RT-qPCR反转录之前，首先要准备反转录试剂，一般采用qPCR反转录试剂盒，这种试剂盒含有足够的反转录荧光探针以及反转录引物，它可以有效帮助反转录过程。
反转录过程通过复制DNA片段的过程完成，最终转录出的cDNA存在细胞核中。
4、qPCR扩增实验
qPCR扩增实验是在反转录完成后进行，一般来说，这个步骤可以采用qPCR扩增试剂盒，该试剂盒中包含所需的扩增物质如DNA聚合酶、前驱核苷酸、dNTPs，检测细胞核中的cDNA。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实时荧光定量PCR国际化标准(一)
实时荧光定量PCR国际化标准（一）引言概述:实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，简称qPCR）是一种基于PCR技术的高灵敏度和高特异性的核酸检测方法。
随着其在基础科学研究、临床诊断和生物工程中的广泛应用，国际化标准的建立变得尤为重要。
本文旨在介绍实时荧光定量PCR国际化标准的相关内容。
正文:一、样品准备1. 样品的收集、保存和预处理2. 样品加载量的标准化3. 样品质量验证和污染检测4. 基因组DNA和cDNA的质量控制5. 防止样品交叉污染的措施二、引物和探针设计1. 引物和探针序列选择的标准2. 引物和探针的纯化和稀释3. 引物和探针的特异性验证4. 引物和探针设计软件的使用5. 引物和探针批次一致性的验证三、PCR反应体系和条件1. PCR反应体系的配制2. 反应管的选择和处理3. 温度梯度实验和温度优化4. 补偿和矫正实验条件中的误差5. PCR反应重复性的验证四、阳性和阴性对照1. 阳性对照品的选择和制备2. 阳性对照品的定量和标准化3. 阴性对照的添加和验证4. 阳性和阴性对照的检测范围和灵敏度5. 对照品的质量控制和存储五、数据分析和结果解释1. 荧光曲线分析和阈值设置2. 标准曲线的绘制和斜率计算3. 样品浓度的计算和质权矫正4. 数据处理和统计分析方法5. 结果的解释和报告撰写总结:实时荧光定量PCR国际化标准的确立对于确保实验结果的准确性、可比性和可重复性具有重要意义。
通过规范样品准备、引物和探针设计、PCR反应体系和条件、阳性和阴性对照以及数据分析和结果解释等环节，我们能够实现实时荧光定量PCR方法的国际化标准化，从而为该技术的应用提供更可靠的支持。
实时荧光定量pcr名词解释
实时荧光定量pcr名词解释
实时荧光定量 PCR 是一种用于检测和分析 DNA 或 RNA 的方法，通过在 PCR 反应体系中添加荧光基团，实时检测 PCR 扩增产物对应的荧光信号，从而对起始模板进行定量和定性分析。
荧光基团包括荧光染料和荧光探针两种形式。
荧光染料如 SYBRGreen 是一种结合于
双链 DNA 的双螺旋小沟区域的绿色荧光染料，在游离状态下发出微
弱的荧光，一旦与双链 DNA 结合后，荧光大大增强，可以根据荧光
信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量。
而 TaqMan 荧光探针则是在 PCR 扩增时添加的一条特异性的荧光探针，其中 5"端标记一个报告荧光基团，3"端标记一个淬灭荧光基团。
在 PCR 扩增时，Taq 酶的 5"-3"外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。
实时荧光定量 PCR 具有灵敏度高、操作简单、实时监测等优点，广泛应用于基因表达分析、基因突变检测、病毒检测等领域。
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荧光共振能量传递
FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）探针是 根据荧光能量共振传递原理设计的探针。
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TaqMan---水解型杂交探针
E
R
E
Q
E
R
23
E
Q
TaqMan作用机理
24
TaqMan作用机理
上游引物
3’ 5’
R
TaqMan 探针
Q
5 ' 3 5 ' '
5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' '
5 ' 3 5 ' ' 5 ' 3 5 ' '
8
由于PCR扩增效率的差异使得相同的样品 扩增结果存在很大的差异
同时扩增96的相同样品的结果
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基线
阈值
Ct值
[DNA]0
10
基线
阈值
Ct值
[DNA]0
什么是基线？
基线就是扩增曲线中的水平部分。
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特异性的熔解曲线
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定量PCR的光学原理
典型的光学结构图
光源 滤光镜 反射镜 CCD 相机 夫累尔透镜 96孔透镜组 滤镜轮 96孔板 双色镜 多元镜
32
基线
阈 值
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C T值
为什么CT值 ∝ [DNA]0 ？
Rn = RB + X0 (1+ e)n Rs
第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分 子的荧光强度(即单位荧光强度，RS)与分子数目的乘积。
设n=CT，则：
RCT = RB + X0 (1+ e)CT Rs log (RCT - RB) = log X0 + CT log (1+ e) + log Rs CT log (1+ e) = - log X0 + log (RCT - RB) – log Rs
实时荧光定量PCR原理
王争强
Application Specialist, MCB Hotline: 4006209660 cnmcbsupport@
定量PCR技术的应用
绝对定量（Absolute Quantification） 相对定量（Relative Quantification） MicroRNA研究（MicroRNA Research） 基因拷贝数变异（CNV Research） 蛋白与基因相互作用（Gene Regulation） 基因分型/SNP分型（Gene Genotyping） 阴阳性分析（Positive/Minus Assay） 转基因成分检测（GMO Detection） 基因扫描（Gene Scan） 蛋白熔解曲线（Protein Melting） 。。。。。。。。。
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基线
阈值
Ct值
[DNA]0
什么是CT值？
从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数 线性图谱 对数图谱
CT值
13
CT值
基线调整规则
如果CT值 >18，不需调整，使用自动分析结果 如果CT值 <18，修改终点，再分析一次 起 点：进口试剂取3，国产试剂取6 终 点：最小的CT值 – 4，通常为15 长 度：大于或等于6个循环
●
Hale Waihona Puke 2007年：ABI推出了第4代荧光定量PCR仪StepOne和StepOnePlus，以操作的灵活方便性和快速、现代 的设计理念为市场所瞩目。在欧美、日本等地广泛受到好评。2007年IBO 2007年度工业设计大奖， 2008年获得SelectScience的2007年年度最佳生命科学新仪器奖。
5
2
内容
● ● ●
AB公司及其荧光PCR仪 定量PCR的数学原理 荧光PCR的化学原理
3
AB公司及其荧光PCR仪
美国AB公司荧光定量PCR仪发展历史
● ● ● ●
1996年：Applied Biosystems公司发明世界上第一台定量PCR仪7700型； 1997年：ABI面向医院用户推出5700型定量PCR仪，至今许多医院仍在使用； 2000年：ABI推出7900型荧光定量PCR仪，该型号公认为业界最高端定量PCR仪； 2001年：ABI推出7000型荧光定量PCR仪取得巨大成功，以其科学的设计理念获得2002年“最佳仪器奖” （Best Instrument Winner 2002)称号；
log X O log( RT − R B ) − log RS + CT = − log(1 + E X ) log(1 + E X )
即 CT = - k lg X0 + b
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（线性方程）
标准曲线：CT值对[DNA]0作图
C T值
CT = - k lgX0 + b
lg [起始DNA]
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定量PCR的化学原理
常用的荧光标记方法
●
DNA双链染料 SYBR Green 、LC Green、Cyto9、Evagreen
●
序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons（分子信标） Dual Probes (FRET)
●
引物特异性探针 Amplifluor
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荧光的原理
Light
荧光基团发光原理：在一束特定波长（如500nm）激发光源的作用下，荧光基团的电子向高能级跃迁 ，随后从高能级跃迁回较低的能级，释放特定波长的光（如600nm），这个光称为发射光。 由于电子从高能级跃迁回来的时候会损失部分能量，所以发射光的能量会比激发光能量小，结果就是 发射光的波长比激发光波长向红外移动（紫外能量大，红外能量小）。
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熔解曲线(Dissociation curve)
Tm值：50%DNA变成单链时的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有 关，可部分代表序列的特异性 PCR过程中，控制温度缓慢升高 ，双链DNA解链成为单链DNA，SYBR Green 被释放，荧光信号减弱 对熔解曲线求一阶导数，峰值代表斜率改变最大值，即Tm.
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荧光标记方法的原理
●探
针
– TaqMan – TaqMan MGB
●染
料
– SYBR Green I
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TaqMan---水解型杂交探针
与目标序列互补
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光
线性图谱
对数图谱
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基线
阈值
Ct值
什么是阈值？
[DNA]0
1. 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。 2. 偶然误差的结果满足对数分布。 3. 阈值 = 基线（背景）信号标准偏差 x 10。 4. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于10－5。 5. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强度得以测量。
5’ 3’
下游引物
R
3’ 5’
Q
5’ 3’
1. 每产生一条DNA链，就切断一条探针 2. 每切断一条探针，就产生一个单位信号 3. 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
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SYBR Green Ⅰ染料
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SYBR Green Ⅰ作用机理
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SYBR Green Ⅰ作用机理 1. 每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去 2. 染料一结合，就产生荧光信号 3. 信号强度与DNA分子总数目成正比
5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 ' 3 5 ' ' 5 ' 3 5 ' ' 5 ' 3 5 ' ' 5 ' 3 5 ' '
5 ' R primer
5 3 ' ' 5 '
5 ' 3 5 ' '
5 3 ' ' 5 3 ' '
定量PCR仪家族
第一代 7700 5700 第二代 7000 7900 第三代 7300 7500 第四代 stepone /plus
6
定量PCR的数学原理
什么是PCR?
模板，引物，dNTP 缓冲液、镁离子 DNA 聚合酶
F
5 primer 3 ' ' 5 ' 5 ' 3 '
链式反应的雪崩效应
●
2003年：ABI在继拥有PCR仪的专利之后，又获得了荧光定量PCR仪的专利，反映了ABI在PCR业界内 的独特地位。所有其他公司均需得到ABI的专利授权许可；
●
2004年：ABI在7000的基础上推出了第3代荧光定量PCR仪7300和7500型，该两款型号目前已为广大用 户所熟知，拥有极佳的口碑；