山慈菇含药血清对SMMC7-721细胞侵袭黏附能力的影响_曾迪
中药山慈姑对甲状腺癌细胞的促凋亡作用
1． 2 主要试剂 L － 15 培养基（ 武汉博士德生物有限公司） 、胎牛 50% ～ 60% ，密封 4℃ 冷藏 24 ～ 48 h 后滤过，并用 95% 乙醇洗涤
血清（ FBS 杭州四季青生物有限公司） 、四甲基噻唑蓝（ MTT 美国 沉淀，收集滤液。滤液经真空减压回收得深棕色浸膏 6． 0 g。用
前临床上常用于内、外、妇、儿、皮肤等疾病的治疗，尤其是以复方 （ 瑞士梅特勒 － 托利多公司） 、多通道 PCＲ 扩增仪（ PTC － 220 美 的形式用于抗肿瘤治疗［2］。现代药理学研究表明，山慈姑有抗 国 MJ 公司） 、BIO － ＲAD 电泳仪（ 美国 Bio － Ｒad 公司） 、凝胶成像
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时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 1 期
LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 1
试剂） 提 取 总 ＲNA，核 酸 蛋 白 分 析 仪 检 测 含 量 后 以 TIANscript cDNA 第一链合成试剂盒进行逆转录成 cDNA。取 cDNA1． 2μl、 Premix Taq Version 10 μl、上 游 引 物 0． 6 μl、下 游 引 物 0． 6 μl、 ddH2 O 6μl 进行扩增。扩增条件为： 94℃ 预变性 5 min，94 ℃ 变性 30 s，57． 6℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 45 s，35 个循环后 72℃ 延伸 5 min。最后将扩增产物于 2% 琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶成像系 统进行扫描并用 Image J 软件分析图像。 2． 5 统计学处理 数据用 x珋± s 表示，用 SPSS16． 0 统计学软件进 行分析，多组间的比较采用方差分析，LSD 法对各组数据进行两 两比较，检验水准 α = 0． 05，P ＜ 0． 05 有统计学意义。 3 结果 3． 1 山慈姑对 SW579 细胞的增殖抑制作用 山慈姑提取物在 1 ～ 100 mg / ml 范围内对 SW579 细胞有不同程度的促凋亡作用。 在浓度为 1 ～ 30 mg / ml 范围内对细胞增殖的抑制作用呈浓度依 赖性； 山慈姑对 SW579 细胞的抑制作用随着药物作用时间的延 长而增强，呈时间依赖性（ 见图 1） 。在 48h 后对细胞的抑制作用 减缓，且随着作用时间的延长细胞的状态较差，因此选择作用时 间为 48 h 为药物作用观察时间（ 见表 1） ； 经 SPSS16． 0 统计软件 计算得出山慈姑的 IC50 为 18． 81mg / ml。
山慈姑对甲状腺癌SW579细胞BCL-2和C-myc表达的影响
械一 厂） 、 高速低温离 心机 （ ５ ８ １ ０ Ｒ德国 Ｅ ｐ ｐ ｅ ｎ ｎ ｄ ｏ ｒ ｆ
Ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ｉ ｆ ｕ ｇ ｅ 公司 ） 、 Ａ Ｂ ２ ０ ４一Ｅ分析 天平 （ 瑞 士 梅特 勒 一
的趋势 。 。 目前 甲状 腺癌 的治疗 不论 是手 术 治疗 、 内科综 合治疗 或肿瘤 分子靶 向治疗 、 基 因治疗 及免疫
山慈姑有抑制 甲状腺癌 细胞的增殖作 用， 这一作 用可能与下调凋亡相关基 因Ｂ Ｃ Ｌ一 ２与 Ｃ— ｍ ｙ ｃ 表达水平有 关。 【 关键词 】 山 慈姑 ；甲状腺癌 细胞 ； Ｂ Ｃ Ｌ一 ２； Ｃ—ｍ ｙ ｃ ；细胞增 殖
甲状腺癌 是 内分 泌系统最 常见 的恶性肿 瘤 ， 据 国
【 摘要 】 目的 探 讨 中药山慈姑对 甲状腺癌 凋亡相 关基 因Ｂ Ｃ Ｌ一 ２ 和 Ｃ— ｍ ｙ ｃ 表达水平的影响 。方法 不同
浓度的 山慈姑作 用于人 甲状腺 癌 Ｓ Ｗ５ ７ ９细 胞 ４ ８ ｈ后 ， 采用 Ｍ １ Ｔ ｒ法计 算 出 山 慈姑 对 Ｓ Ｗ５ ７ ９的半 数 抑 制 浓度
（ Ｉ Ｃ 。 ） ； 将 实验 分 为 山 慈姑 ０ ． ５ Ｉ Ｃ 。 （ 低浓度 ） 组、 Ｉ Ｃ 。 （ 中浓 度 ） 组、 ２ Ｉ Ｃ 。 （ 高浓 度 ） 组 和 阴性 对 照 组 ４个 组 ， 将 各 浓 度 组 药物 分 别 作 用 于 Ｓ Ｗ５ ７ ９细胞 ４ ８ ｈ后 ， Ｒ Ｔ—Ｐ Ｃ Ｒ检 测 各 组 Ｂ Ｃ Ｌ一 ２和 Ｃ—ｍ ｙ ｃ基 因 的表 达 水 平 。 结 果 山 慈姑 对
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 材料
甲状腺癌细 胞株 ， 又称 Ｓ Ｗ５ ７ ９细胞 （ 中科
基于网络药理学研究浙贝母-山慈菇药对干预甲状腺癌的作用机制
基础研究中国民间疗法 犆犎犐犖犃 犛犖犃犜犝犚犗犘犃犜犎犢，犕犪狉 ２０２４，犞狅犾 ３２犖狅 ５通信作者：樊茜，Ｅ ｍａｉｌ：ｆｑ１３９９４２５２８１２＠１６３．ｃｏｍ第一作者：侯鹏霄，Ｅ ｍａｉｌ：５４４７８２８７０＠ｑｑ．ｃｏｍ （扫描二维码 查看文中图片）基于网络药理学研究浙贝母 山慈菇药对干预甲状腺癌的作用机制侯鹏霄樊茜（山西省肿瘤医院／中国医学科学院肿瘤医院山西医院／山西医科大学附属肿瘤医院，山西太原０３００１３）【摘要】 目的：采用网络药理学的研究方法，探索浙贝母 山慈菇药对干预甲状腺癌的机制。
方法：在中药系统药理学数据库与分析平台（ＴＣＭＳＰ）中查找浙贝母和山慈菇这两味中药的活性成分，检索有效活性成分的作用靶点，利用Ｕｎｉｐｒｏｔ将各作用靶点转换成基因通用名。
在ＯＭＩＭ、ＧｅｎｅＣａｒｄｓ数据库中分别筛选和甲状腺癌有关的靶点，通过Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ３．７．１软件把得到的结果进行可视化，绘制药物 成分 靶点网络图及核心靶点的蛋白质 蛋白质相互作用网络，将药物作用靶点与疾病靶点采用Ｍｅｔａｓｃａｐｅ在线数据库进行京都基因与基因组百科全书（ＫＥＧＧ）及基因本体（ＧＯ）功能富集分析。
结果：浙贝母 山慈菇药对调治甲状腺癌的核心成分有１０种，其潜在的作用靶点有７５个；数据库筛选出与甲状腺癌相关的疾病作用靶点２３５７个，甲状腺癌疾病核心靶点９６个，其中ＮＰＭ１、ＨＳＰＡ５、ＨＤＡＣ５等基因较为关键。
ＧＯ功能富集分析细胞组分主要与核糖核蛋白复合物有关，分子功能主要与组蛋白脱乙酰酶结合有关，生物过程主要与调节细胞对压力的反应有关。
ＫＥＧＧ信号通路富集主要包括新型冠状病毒感染、细胞凋亡、剪接体及缺氧诱导因子 １（ＨＩＦ １）信号通路和细胞周期等信号通路有关。
结论：浙贝母 山慈菇药对干预甲状腺癌的机制包含多靶点、多通路，可为后续临床应用及药物开发提供理论依据和方向。
【关键词】 甲状腺癌；浙贝母 山慈菇；药对；网络药理学中图分类号：Ｒ２５９；Ｒ２８５ 文献标识码：Ａ 犇犗犐：１０．１９６２１／ｊ．ｃｎｋｉ．１１ ３５５５／ｒ．２０２４．０５１９ 我国甲状腺癌的发病率呈持续上升趋势，研究表明，我国甲状腺癌的发病率为２０．３／１０万，是目前常见的内分泌系统恶性肿瘤［１］。
山慈菇提取物抑制血管形成的药效学研究
精 自皮蛋购 自吉林 农 业科技 学院 养鸡场 ；人脐 静 脉细 胞株 （ Ｈ Ｕ Ｖ Ｅ Ｃ） ， 购 自上海 细胞 所 。
１ 。 ２试 验方 法
Ｃ Ｏ： 饱和湿度培养箱中继续孵育 ，孵育 ７ ２小时后即可观察到药 物载体周围新生血管生长 情况 。 山慈菇提取物对鸡胚尿囊膜新生 血管抑 制 率 ：药 物新 生血 管抑 制率 ＝ （ 生理盐 水 组新 生血 管数 一
１ ． ２ ． １山慈菇鳞 茎提 取物 的制 备 真 空干 燥 的 山慈菇 鳞 茎 （ ４ 公斤 ） 粉碎后 ， ８ ５ ％乙醇回流提取 ３ 次， 合并提取液得浸膏（ １ ７ ０ 克） ， 将干 浸 膏用 水 （ ５ ０ ０ 毫升 ） 悬 浮后 ， 依次 用正 丁醇 、 乙酸 乙酯 萃取 ， 回收溶 剂得 正丁 醇部 分 （ ３ 克） 、 乙酸 乙酯 部 分（ ４ ５ 克） 、 水 层部 分 （ １ ２ ０ 克） 。
１ ． １试 验材料
山慈 菇购 自安 徽 毛集 镇 ； ＭＴ Ｔ 、 ｂ Ｆ Ｇ Ｆ 、 Ｒｅ ｔ ｉ ｎ ｏ ｉ ｃ ａ ｃ ｉ ｄ（ Ｓ ｉ ｇ ｍａ 公 司） ， ＭＣ Ｄ Ｂ 一 １ ３ １ 细 胞培 养基 （ Ｇ ｉ ｂ ｃ ｏ Ｂ Ｒ Ｌ公 司 ） ， 胰酶 、 小 牛血 清 、 Ｌ 一谷氨 酰胺 （ 华美 生物 工程公 司 ） ， 其他 试 剂均 为 国产分 析 纯 ； 受
（ ％） ＝（ 对 照组 ０ Ｄ 值 一实验 组 ０ Ｄ值） ／（ 对照 组 ０ Ｄ 值 一空 白组 ０ Ｄ值 ） Ｘ １ ０ ０ ％ 。计 算药物 半数 抑 制浓度 （ Ｉ Ｃ ５ ０ ） 。 １ ． ２ ． ５鸡 胚 绒 毛 尿 囊 膜 （ ｃ ｈ ｉ ｃ ｋ ｅ ｍｂ ｒ ｙ ｏ ｃ ｈ ｏ ｒ ｉ ａ Ｕ ａ ｎ ｔ ｏ ｉ ｃ ｍｅ ｍｂ ｒ ａ ｎ ｅ ， ｃ Ｍ ） Ａ ￣ 管形 态学检 测 参考 文献方 法等 方法 ， 制 备鸡 胚 尿囊 膜 。 设置 山慈 菇提 取物 给 药组 、生 理盐 水阴 性对 照 组 、 Ｒｅ ｎ ｔ ｉ ｎ ｏ ｉ ｃ ａ ｃ ｉ ｄ阳性对 照组 。 甲基纤 维 素 Ｍ２ ０配制 成 Ｏ ． ５ ％ 浓 度溶 液 ， 灭菌 ， 制 备 直径 为 ７ 毫 米 甲基纤 维素膜 药物 载 体贴 于 Ｃ Ｍ 的部 位 。其 中 Ａ 山慈菇 提取物 组平 行设 置 ５ 个 质量 浓度 ， 滴加 １ ０ ｕ ｌ 含 不同 浓度 药 物 的生 理盐 水溶 液于 甲基 纤维 素膜 上 （ 终 浓度 分别 １ ２ ． ５ ｕ ｇ ／ ｍ ｌ 、 ２ ５ ｕ ｇ ／ ｍｌ 、 ５ ０ ｕ ｇ ／ ｍｌ 、 １ ０ ０ ｕ ｇ ／ ｍ ｌ 、 ２ ０ ０ ｕ ｇ ／ ｍ ｌ 的 山慈菇 醇提 物 ） ，同时 以不 含 药 物 的生 理盐 水 为 阴性 对 照组 ， Ｒｅ ｎ ｔ ｉ ｎ ｏ ｉ ｃ ａ ｃ ｉ ｄ （ １ ０ ｕ ｌ 、 １ ０ ０ ｕ ｇ ／ ｍ １ ） 为 阳性 对照 组 ， 每组 １ Ｏ 个鸡胚 ， 将 无菌 贴膜 封闭窗 口 ， 于３ ７ ￣ ｛ ２ 、 ５ ％
扶正解毒汤含药血清对镍转化细胞增殖抑制作用探究
扶正解毒汤含药血清对镍转化细胞增殖抑制作用研究1吕晓云，蒲晓丽，朱玉真，赵健雄，孙应彪兰州大学中西医结合研究所，兰州（730000）E-mail：lvxy@摘要：目的通过细胞培养方法，研究灌服中药扶正解毒汤（FJD）后兔血清对镍转化细胞（Nt16HBE）增殖的抑制作用。
方法将FJD血清作用于Nt16HBE细胞7d，分别以四甲基固氮唑盐（MTT）法、流式细胞仪（FCM）及TRAP-PCR-ELISA法检测FJD血清对镍转化细胞生长的抑制情况及其对核转录－kB（NF-κB）、端粒酶活性变化的影响。
结果 10％体积分数的高、中、低剂量FJD血清对Nt16HBE细胞生长以及NF-κB、端粒酶活性均有较强的抑制作用，且存在剂量－效应和时间－效应关系(P<0.05~0.01)。
结论FJD血清可显著抑制镍转化细胞增殖，其机制与下调NF- kB、端粒酶表达有关。
提示FJD具有一定的体外拮抗镍致癌效应。
关键词：正解毒汤；含药血清；镍；细胞增殖；核转录因子-κB；端粒酶镍化合物为人类Ⅰ类确证致癌物[1]。
多年来，国内外运用各种实验方法进行了大量有关镍致癌的动物实验及职业病临床研究，取得了重要的进展。
其中，体外镍暴露诱导细胞恶性转化作为敏感的遗传终点之一，具有极高的可信度。
许多实验室已建立了多种镍化合物诱导啮齿类及浦乳类细胞恶性转化模型。
同时，人们也在积极寻求有效的镍毒性包括镍致癌的干预手段。
近十六年来，本课题组运用扶正解毒汤（FJD）进行了系统的镍毒性干预的体内动物实验及临床研究[2，3]，证实了该复方的有效性。
本研究首次以经硫酸镍（NiSO4）诱导恶性转化的人支气管上皮（16HBE）细胞（简称Nt16HBE）[4]为研究目标，从体外途径观察FJD对镍转化细胞增殖的抑制作用并探讨其作用机制，以期为该复方拮抗镍致癌性提供新的理论依据。
1. 材料与方法1.1 材料1.1.1细胞及动物 16HBE细胞及Nt16HBE细胞由广州医学院化学致癌研究所建系并惠赠。
中药学_丽江山慈菇_药材详解课件模板_性味
中医药用价值详解：丽江山慈菇
原始形态： 或过之，先端弯钩状；花被片6，紫色。 蒴果倒卵形或卵圆形，宽约5mm，有棱。 花果期6-7月。
中医药用价值详解：丽江山慈菇
生态环境： 生于山坡草地或松林下。 资源分布：分布于云南、西藏等地。
中医药用价值详解：丽江山慈菇
性状鉴别：
1.性状鉴别：球茎呈不规则短圆锥形，直 径0.7-2cm，高1-1.5cm；顶端渐尖，基部 常呈脐状凹入或平截。表面黄白色或灰黄 棕色，光滑，一侧有自基部伸至顶端的纵 沟。质坚硬，碎断面角质样或略带粉质， 类白色或黄白色。味苦而微麻。
中医药用价值详解：丽江山慈菇
炮制： 取原药材，除去杂质。用时捣碎。 饮片性状：参见“药材鉴别”项。贮干燥 容器内，置阴凉通风处，防蛀、防霉。
中医药用价值详解：丽江山慈菇
性味： 苦；微辛；微温腺癌；鼻咽癌；唾腺肿瘤； 瘰疬；皮肤肿块；痛风。
中医药用价值详解：丽江山慈菇
药理作用：
作用，结果表明秋水仙碱肌内注射每日 125μg／kg，连续给药 4星期，对神经 周围组织的粘连、纤维化的形成，有明显 的抑制作用。家兔腹腔内注入 30mg／L。 秋水仙碱溶液，用量lmg／kg，术后10-15 天剖腹探查，记录粘连处数、致密程度、 粘连面积，并将粘连组织进行电子显微镜 观
中医药用价值详解：丽江山慈菇
药理作用：
注Coilmg疼痛缓解，症状、体征也迅速改 善，止痛机制尚不完全清楚。Col不影响 肾对尿酸的排泄，也不影响尿酸的血浓度。 Col能和微管蛋白结合，妨碍了有丝分裂 中纺锤体的功能并引起粒细胞和其他可移 动细胞中原纤维微管解聚和消失。这一作 用显然是Col有效作用的基础，即抑制粒 细胞移向发炎区
采收和储藏：夏、秋季采收，除去茎叶及 须根，洗净，晒干。
苦参素含药血清对人肝癌细胞株SMMC-7721体外增殖活性的影响
苦参素含药血清对人肝癌细胞株SMMC-7721体外增殖活性的影响湛学军;谢大泽;胡银英;汤幽;周南进;戴革【摘要】Objective To investigate the effect of serum containing matrineon the proliferation of human hepatoma cell line SMMC-7721,provide scientific evidence for liver cancer therapy with matrine. Methods Kunming mice were given matrine by gavage and then the blood was collected to prepare serum containing matrine. Human hepatoma cell line SMMC-7721 and mice serum containing matrine were used the research subject andthe research drug,respectively. Serum containing matrine on the pro-liferation inhibitory activity of the tumor cells were determined by using MTT assay. It was observed that the effects of different dosage of administration and different culture time on the inhibitory activity. Results Serum containing matrine had different de-grees of inhibition on SMMC-7721. As compared with the cell control group and the normal salinegroup (negative control group) , there was significant difference the inhibitory activity(P<0.05or P<0.01). There was no significant difference when serum containing matrine of the high dosage at concentration of 40% were compared with serum containing 5-fluorouracil (5-Fu) group (positive control group)at the same concentration (P>0.05). And the inhibitory activity showed obvious dose-effect relationship. When serum containing matrine was cultured with the tumor cells for 24 and 48 hours,the inhibitory activity was better than for 72 hours. Conclusion Serumcontaining matrine has good effects of anti-hepatoma in vitro.%目的：探讨苦参素含药血清对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖活性的影响，为苦参素应用于肝癌的治疗提供科学依据。
研究快报 参杖颗粒含药血清对HSC增殖及α-SMA表达的抑 …
Duan YJ, Yin NN, Gao QH, Wan Y, Ma WP, Zhang CW, Lv WL. Shenzhang granules inhibit cell proliferation and reduce α-SMA expression in hepatic stellate cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2014; 22(10): 1396-1401 URL: /1009-3079/22/1396.asp DOI: /10.11569/wcjd.v22.i10.1396
0 引言 肝纤维化是肝脏细胞外基质(extracellular matrix, ECM)异常生成和积累的结果[1]. 当肝脏受到各 种损伤时, 肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC) 被活化并向肌纤维母细胞转化, 主要表现为细胞 增殖、游动、收缩能力增强及细胞因子和ECM 的大量合成, 并导致肝窦毛细血管化, HSC的活 化增殖和收缩功能在此过程中起中心作用[2,3]. 当 HSC转化为肌成纤维细胞时, 能特征性地表达 α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin, α-SMA), 使得肝脏内α-SMA含量增加[4]. 中药复 方抗肝纤维化实验研究表明: 中药复方能抑制 和减少HSC中α-SMA的表达, 从而抑制HSC的 激活和肝纤维化[5]. 因此α-SMA的变化被看成 HSC活化与否的标志, 成为肝纤维化的一个重要 的评价指标[6].
结果: Western blot实验结果显示10倍浓度的 参杖颗粒含药血清对HSC的α-SMA的表达 有明显减少; 同时RT-PCR结果显示α-SMA的 mRNA水平在10倍浓度血清处理的HSC中最 低; 细胞周期检测结果显示细胞明显被阻滞
泰山山慈菇对小鼠肝癌的治疗作用及相关免疫机制研究
泰山山慈菇对小鼠肝癌的治疗作用及相关免疫机制研究目的探讨泰山山慈菇对小鼠肝癌的免疫治疗作用。
方法本课题首先制备泰山山慈菇提取液，体外用山慈菇提取液对H22肝癌细胞进行干预，分为空白组、山慈菇提取液低、中、高剂量组和5-氟尿嘧啶阳性对照组，干预12 h后，Annexin V和7-AAD染色，流式细胞术检测细胞凋亡。
体内制备小鼠H22实体瘤肝癌模型，将50只小鼠分为山慈菇低、中、高剂量组、5-Fu阳性对照组、模型对照组，每组10只。
山慈菇各剂量组均进行灌胃治疗，模型组灌胃等体积生理盐水，5-Fu 阳性对照组进行等体积腹腔注射。
连续10 d，停药后次日摘取小鼠眼球取血后颈椎脱臼处死小鼠，检测小鼠肿瘤大小分析对肿瘤的抑制作用。
酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（IL-2）和γ-干扰素（IFN-γ）的含量。
结果泰山山慈菇提取液体外促进H22肿瘤细胞凋亡且具有剂量依赖性。
体内抑制H22肿瘤的生长，增加血清中TNF-α、IL-2和IFN-γ的含量且呈现剂量依赖性。
结论泰山山慈菇通过增加抗肿瘤细胞因子产生发挥抗肿瘤作用。
Abstract：Objective To investigate the immunotherapy effect of Taishan mountain mushroom on liver cancer in mice.Methods We first prepared the Taishan mountain mushroom extract.In vitro，the H22 hepatoma cells were treated with the extract of mushroom extract in vitro.It was divided into blank group，low，middle and high dose group and 5- fluorouracil positive control group.After 12 h intervention，Annexin V and 7-AAD were stained，and cell apoptosis was detected by flow cytometry.The mice model of H22 solid tumor was prepared in vivo，and 50 mice were divided into low，medium and high dose group，5-Fu positive control group and model control group，with 10 rats in each group.The rats in each dose group were treated by intragastric perfusion，and the model group was given iso-volume intraperitoneal injection of normal saline and 5-Fu positive control group.For 10 d，the mice were killed the next day after extirpation of eyeball and blood，and the inhibitory effect of tumor size analysis on the tumor was detected.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was used to detect the levels of TNF-α，IL-2 and IFN-γ in serum.Results The extract of Taishan mountain mushroom promoted the apoptosis of H22 tumor cells in a dose-dependent manner.In vivo，the growth of H22 tumor was inhibited and the levels of TNF-α，IL-2 and IFN-γ in serum increased.Conclusion Taishan mountain mushroom plays an anti-tumor role by increasing the production of anti-tumor cytokines.Key words：Taishan mountain mushroom；Liver cancer；Tumor necrosis factor -α；Interleukin-2；γ-interferon肝癌是死亡率較高、五年生存率较低、恶性程度极高的肿瘤疾病之一。
山慈菇提取物对肝癌细胞增殖及tnf-α、il-1β、il-6表达的影响
山慈菇提取物对肝癌细胞增殖及TNF-a、IL-10、IL-6的影响唐纯明，何自力，李军湖南师范大学第一附属医院湖南省人民医院，长沙431000摘要：目的观察山慈菇提取物对肝癌SMMC-7721细胞增殖及TNF-a.IL-10.IL-6表达的影响。
方法对SMMC-7721细胞分别给予0、100、200、400、600、800、1000mg/L山慈菇提取物培养24,48,72h,采用CCK-8法检测细胞增殖抑制率。
将SMMC-7721细胞分为0mg/L组、00mg/L组、00mg/L组、00mg/L组，分别加入0、00、600,800mg/L的山慈菇提取物培养24h,采用平板克隆形成实验测算细胞形成率，光学倒置显微镜下观察细胞形态变化，采用qRT-PCR法检测细胞中的TNF-a.IL-10.IL-6mRNA,采用ELISA法检测细胞培养液上清中的TNF-a、IL-10、IL-6。
结果400、600、800mg/L组细胞克隆形成率低于0mg/L组,00.800mg/L组克隆形成率低于400mg/L组（P均＜0.05）。
400.600.800mg/L组随着药物浓度增大，细胞形态皱缩，，细胞易脱落，尤以800mg/L组最明显。
400、600、800mg/L组细胞中TNF-a.IL-10.IL-6mRNA表达及细胞培养液上清TNF-a、IL-10、IL-6水平均低于0mg/L组,00.800mg/L组低于400mg/L组（P均＜0.05）。
结论山慈菇提取物可抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖,并抑制细胞中TNF-a.IL-10.IL-6的分泌。
提取通过抑制炎症因子分泌，调节肿瘤微环境，从而抑制细胞增殖。
关键词：山慈菇提取物;SMMC-7721细胞;细胞增殖；TNF-a;IL-10；IL-6doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2020.08.003中图分类号:R285.5文献标志码:A文章编号：1002-266X（2020）08-0011-04Effects of iphigenia indica extract on proliferation and expression of TNF-a,IL-1p,and IL-6of hepatoma SMMC-7721cellsTANG Chunming,HE Zili,LI JunThe First Affiliated Hospital of Hunan Normal University,Changsha431000,ChinaAbstract:Objective To observe the effects of iphigenia indica extract on the proliferation and the expression levels of tumor necrosis factor-a(TNF-a),interleukin-10(IL-10),and interleukin-6(IL-6)of liver cancer SMMC-7721cells.Methods SMMC-7721cells were administered0,100,200,400,600,800,and1000mg/L iphigenia indica extracts for24，48，and72h，respectively，and the cell proliferation inhibition rate was detected by CCK-8.SMMC-7721cells were divided into0mg/L group,400mg/L group,600mg/L group,and800mg/L group,which were cultured with0, 400,600,and800mg/L iphigenia indica extract for24h.The plate clone formation assay was used to detect the cell clone formation ability;optical inverted microscope was used to observe the change of cell morphology;quantitative real-time PCR (qRT-PCR)was used to detect TNF-a,IL-10,and IL-6mRNA;enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was used to detect the levels of TNF-a,IL-10,and IL-6in the supernatants of cell culture fluid.Results The colony formation rates were lower in the400,600,and800mg/L groups than in the0mg/L group,and the colony formation rates were lower in the600,800and800mg/L groups than in the400mg/L group(all P<0.05).With the increase of drug concentrations in the400,600,and800mg/L groups,the cell morphology shrank,adherence was poor,and the cells were prone to fall off,especially in the800mg/L group.The expression levels of TNF-a,IL-10,and IL-6mRNA and the levels of TNF-a,IL-10,and IL-6in cell culture supernatants in the400,600,and800mg/L groups were lower than those in the0mg/ L group,those in the600and800mg/L groups were lower than those in the400mg/L group(all P<0.05).Conclusions Iphigenia indica extract can inhibit the proliferation of liver cancer SMMC-7721cells,and inhibit the expression and se-基金项目：国家自然科学基金资助项目（81372157）。
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http : / / journa. l fmmu. edu . cn 黏附后所测 的 A 值为一定 值 , 则 可用 A 值代替 黏附率作 为黏 附指标 [ 3] . 1 . 2 . 4 侵袭实验 将侵袭 小室 (M illicel1) 水 平放入 24 孔 板 中 , 在小室 内膜上滴加 M atrigel 胶 , 50 L /孔 , 静 止放置 5 h ; 在小室外加入 600 L 含 5 mL /L 胎牛 血清的 RPM I1640 培养 液作为趋化剂 . 取处理后的细胞 , 经胰酶 消化后 , 以 2 ∃ 109 /L 密度重悬于含 1 g /L BSA 的 无血 清 RP M I1640 培 养液 中 . 将 100 L 处 理后 的 7721 细胞 悬液 加入 到上 室 中 ( 1 ∃ 105 个 / 孔 ). 将 24 孔板置于 37∀ , 50 mL /L CO2 的培 养箱 中培养 48 h. 取出 M illice ll小室 , 弃去培养 液 , 用棉签擦去微孔膜上 层的 细胞 , 经 950 mL /L 乙醇固 定 10 m in 后 , 取下滤 膜进 行 HE 染 色及中性树胶 封 片 , 在 40 ∃ 光 镜 下计 数 膜 背面 侵 袭的 细 胞 数 , 计数 3 次并求其 平均值 . 统计学处理 : 数据 以 x % s 表示 , 通 过 SPSS 13. 0 统计 软 件进行 t 检验 , P < 0. 01 为差异有统计学意义 . 2 结果 用黏附实验测定对照血清组 以及含药 血清组 处理 的肝癌细胞的黏附率 , 中药山慈菇含药血清培养的肝癌细胞的 黏附率低于正常血清培养的肝癌细胞的黏附率 [ ( 0. 76 % 0. 13) vs ( 0. 94 % 0 . 20), P < 0. 01]. 用侵袭小室测定对照血清组以及 含药血清组处理后的肝癌细胞的侵袭细胞数, 中药山慈菇含药 血清培养的肝癌细胞的侵袭细胞 数低于正常 血清培养 的肝癌 细胞的侵袭细胞数 [ ( 113 % 9) vs ( 98 % 8), P < 0 . 01]. 3 讨论 山慈菇具有清 热解毒、 化 痰散结 之功 效 , 临床上 常 与黄连、 刺五加配伍治 疗胰 腺癌、 食 道癌 等 . 已有 研究 报道 : 黄连解毒汤含药 血清 对人 肝癌 Be1 7402 以 及人 小细 胞肺 癌 NC I H446 瘤株具有抑制作用 [ 4] , 而刺五加含 药血清 对 HT29 , U 937 和 A549 细胞株均有明显的增殖抑制作用 [ 5] . 中药山慈菇所含 化学 成分 复杂 , 纯 化单 体困 难 , 采用 血 清药理学方法能较好地反映其 抗肿瘤的药 效作用 . 实验 结果 显示山慈菇含药 血清 组 SMM C 7721 细 胞的 黏附 率以 及侵 袭 细胞数均显著低于 对照 组 ( P < 0. 01), 表明 山慈 菇含 药血 清 对 SMM C 7721 细胞的黏附 和侵袭 能力 均具 有明 显的 抑制 作 用 . 这种抑制作用可 能来自 原方 剂的一 些固 有成 分 , 但也 不 排除新产生的代谢产物的抗肿 瘤作用 . 日本学者 增川典 古曾 利用 D ia ion 20, LH 20, 硅胶柱层 析技术 分离得 到山 慈菇的 乙 酸乙酯 及 正 丁 醇提 取 物 , 并 通过 快 速 原 子 轰 击 质 谱 ( FA B M S) 、 NOE 等 技 术 进 行 了 药 理 分 析 , 证 实 了 该 提 取 物 是 以 batatasin 及 3& O m ethy lbatatas in 为配 基的 糖 甙 [ 6] . 利用 药 物 提纯技术对生药山慈 菇的药 物成分 进行提 纯 , 并结 合血清 试 验验证其药理活性 , 将有助 于阐明 中药 山慈菇 抗肿 瘤作用 的 有效成分 . 参考文献 !
山慈菇含药血清对 S MMC 7721 细胞侵 袭、 黏附能力的影响
曾 迪 , 李晓祥 , 边永钎 , 刘利兵 , 梁向艳
1 2: 口腔医学系二 队八年制学 员 , 基础 医学教 学实验中心 , 陕西 西安 710033) 关键词 ! 含药血清 ; SMM C 7721; 侵袭 ; 黏附 ; 山慈菇 中图号 ! R 743 文献标识码 ! B 0 引言 山 慈菇 甘、 微 辛、 寒 , 有小 毒 , 入 肝脾 经 , 有 消肿 散 结、 化痰清热解毒之功 [ 1] . 近些年来 , 山 慈菇在临床 上作为抗 癌药而引起 关 注 . 我们 采用 正 常血 清 和含 药 血清 分 别 处理 SMM C 7721肝癌细胞的方法 , 利 用黏附、 侵袭实验检 测中药山 慈菇对 S MM C 7721 细胞体外侵袭、 黏附能力的影 响, 进而从细 胞水平上探索中药山 慈菇 对肝癌 细胞 浸润、 侵袭 能力的 抑制 作用 . 1 材料和方法 1. 1 材料 RP M I1640 培养液购自 G IBCO BRL 公司 . M a tri ge l及侵袭小室 (M illice l1) 购自 BD 公司 . BSA、 结 晶紫及 明胶 均为 S igm a公司产品 . Lambda25UV /v is紫外分光光度 计 ( Per k in E l m er) . 成年大耳白兔 , 雌性 , 体质量 1 . 5~ 2. 0 kg, 由动物 实验中心提供 . 人 SMM C 7721 肝癌细胞来源于上海生化与细 胞生物学研究所细胞库 . 中药山慈菇 ( 购自西京 医院中药 科 ) 捣碎 , 30∀ 水 浸泡 1 h, 先 武 火煎 熬 20 m in, 再 文 火煎 熬 60 m in, 合并 水煎液 , 3000 r /m in 离心 10 m in, 过滤上 清液 , 终浓 度为生药 890 g /L , 4∀ 冰箱保存 . 1. 2 方法 1. 2 . 1 空白血清与 含药血 清的制 备 [ 2] 成 年雌性 大耳 白兔 4 只 , 随机分成对 照组 ( 生理盐水 ) 和给药组 ( 13 g /kg), 每组 2 只 . 给药组 , 每天 灌胃 给药 2 次 , 每次 30 mL, 连续 5 d; 对照 组 , 每天灌服等量 生理盐 水 . 末次给 药前 12 h, 禁食 不禁 水 . 末次给 药 2 h 后 , 心 脏 取 血 , 静 止 12 h, 3000 r/m in 离 心 10 m in, 分离血清 , 0. 22 m 微孔滤膜除菌 , - 20∀ 冰箱保存 . 1. 2 . 2 细胞培养与分组 人 SMM C 7721 肝癌细 胞常规 培养 于含 15 mL /L 小牛血清的 RPM I 1640 培养液 中 , 在 37∀ 、 饱 和湿度、 50 mL /L CO2 孵箱中培养 , 每 2~ 3 d 换液 传代培 养 . 以 1: 4 的比例将得到的含药血清、 空白 血清分别与 RPM I1640 配制成培养 液 , 并 用该 培养液 培养 SMM C 7721 细 胞 48 h, 作 为空白对照组和含药 血清组 . 1. 2 . 3 黏 附 实验 用 M atr ige l 胶 ( M 胶 # 无血清培养液 = 1# 300) 包被 96 孔 培养板 , 50 L /孔 , 4∀ 过 夜 . 加入含 20 g /L BSA 的 PBS 于 室温封闭 30 m in, 再以 PBS 洗 涤 . 取 处理 后的 细 胞 , 经胰酶消化后 , 以 2 ∃ 109 /L 密度重悬于含 1 g /L BSA 的 无血清 RP M I1640 培 养液 中 . 将 细胞 接种 于 M atrigel 包被 的 96 孔培 养板中 , 2 ∃ 104 个细 胞 /孔 , 置 37∀ , 50 mL /L CO2 培 养箱中培养 . 60 m in 后 , 弃去培养液和未 黏附的细 胞 , 每 孔加 入 2 g /L 结晶紫 50 L , 室温 放置 10 m in, 轻 轻洗去除 多余的 染料 , 通风干燥 24 h . 然后加入 100 L 细胞裂 解液室温 放置 20 m in , 用酶标仪于波长 540 nm 测定 A 值 . 黏附率 即为 所测 得的 A 值与 细胞全部黏 附后所测 A 值 的比值 , 由于细 胞全部
[ 1 ] 骆红梅 , 童 红 , 徐 洪 . 山慈菇 质量标准研究 [ J] . 中国 药业 , 2007, 16( 10 ) : 57 . [ 2 ] 杨仙凌 . 中药血清药理学研究方法应用现状及展望 [ J] . 浙江中 医药大学学报 , 2007 , 31( 5 ): 662 - 665 . [ 3 ] 郭 昱 , 郭 霞 , 韩 俊岭 , 等 . 肝 瘾 口服 液含 药 血清 对 人肝 癌 BEL 7402细胞 系生 物 学行 为 的 影响 [ J] . 中 药 药理 与 临 床 , 2007, 23( 5) : 153- 155 . [ 4 ] 孙 健 , 温庆辉 , 李 夏 , 等 . 黄连解毒汤及其含药血清的 化学成 分及抗肿瘤作用对 比研 究 [ J ]. 中国 中药杂 志 , 2006, 31 ( 18 ) : 1526 - 1529 . [ 5 ] 蔡 宇 , 陈 冰 , 余绍蕾 , 等 . 刺 五加提 取物含 药血 清抗肿 瘤作 用的研究 [ J]. 上海中医药杂志 , 2006, 40 ( 1) : 58- 59 . [ 6 ] 增川典古 , 北岛润一 . 生药山慈菇的成分及药理活性研究 [ J] . 国 外医学 中医中药分册 , 2006, 29( 7) : 30 - 32 . 编辑 袁天峰
收稿日期 : 2008 05 13 ; 接受日期 : 2008 10 06 通讯作者 : 刘利兵 . Te: l ( 029) 84774764 Em ai: l l iu lib ing@ 163 . com 作者 简介 : 曾 迪 . 本 科生 . Te: l ( 029 ) 82502364 Em ai: l di lal6891@ 163. com