蛋白层析仪器系统原理讲座

AKTA梯度性能考察
A：水 B：0.5-1.0%(v/v)丙酮
蛋白质的梯度洗脱注意事项

层析过程优化采取梯度洗脱或者阶越式洗脱方式； 反相层析探索条件时，梯度应尽可能长（>20个柱 体积）；

当发现进错样时，不可以为了节约时间，而直接用 100%流动相B（有机相）洗脱，否则会不可逆地损 坏层析柱。

Signal Dark A log10 reference Dark
纵坐标为吸光度A，横坐标为时间作 出的曲线即为层析图谱

分类

单波长检测器 多波长检测器

二极管阵列检测器
固定波长紫外检测器
汞灯光谱图 滤光片原理示意图
固定波长紫外检测器
Pharmacia UV Monitor UV-1 AKTA PRIME和UPC所配检测器 汞灯为光源，荧光片和滤光片来选择波长，通常为 254和280nm，分别用于核酸和蛋白的监测 结构简单，价格较便宜 可配套国产色谱工作站（如N2000）进行数据采集 国产8823B
AKTA process三元隔膜泵
德国QuaΒιβλιοθήκη BaidutroFlow四元隔膜泵
梯度洗脱系统
B
A
磁力搅拌器
比例阀
B
A
脱气机
B
A
梯度混合器
低压梯度
高压梯度
梯度混合器
B
A
磁力搅拌器
两杯液位始终保持平衡； 两杯溶液混合速度以及输出流量均可调节，可以作出各种不同斜率的线性梯度； 按不同阶段的时间作适当的输出流量调节，还可以做出各种不同的台阶形梯度。


一定要使用合规格的进样器，规格为外径0.028英寸，长2英寸的平 头针。一定不能使用尖针，它会严重刮坏转子垫圈。 废液口：出口末端应与进针口水平以防倒吸或虹吸
进样阀操作注意事项

进样阀靠转子和定子的面密封，无法保证100%不泄露 缓冲液泄露会导致盐析出，损伤密封面和导流槽，严重时造 成漏液和两个导流槽之间短路

因此，如无特殊需要，最好使用单波长检测 隔一段时间运行一下多波长检测

6.维护——每天
系统
◇ ◇ ◇ ◇
清洁擦拭外表，防止试剂或结晶的盐腐蚀设备 溶液和样品必须过滤 检查系统管路和接头有无破损，系统是否渗漏。 使用完毕，须用水将系统冲洗干净，之后用20%乙醇清洗系并保存所有的流路。
pH计
◇ 使用前校正pH计。 ◇ 用后将pH计拆下放入保护液（1:1 pH 4 buffer和 2
P-903 (10 ml/min) Low Flow LC Filter
缓冲液筛网
检查入口溶液的筛网是否很脏，如有必要须更换。
P-901(100ml/min) High Flow LC Filter
Polymer Support
泵冲洗系统
◇ 更换泵后冲洗液（20%乙醇）。 ◇ 如果冲洗液瓶中液体量增加，说明泵头密
可变波长紫外-可见检测器
氘灯光谱图
氘钨双光源光谱图 钨灯光谱图
AKTA检测器
氙灯作为光源 优点：全波长、光强高 缺点：脉冲灯，每次闪耀光强不一样
氙灯光谱图
二极管阵列和CCD光纤光谱仪
紫外检测器光源

一台AKTA 开灯后，每小时光源烧掉10元，如果加上光栅的损耗（60,000 元/3000 hr）， 每小时耗费30元，一天（8小时）为240元，一个月（20天）为4800元； 为节省操作费用，必须注意：
多柱组合层析
多柱组合层析纯化蛋白质实例
白蛋白、AT-Ⅲ、运铁蛋白均达到了电泳纯（纯度≥99%） α1-AT和结合珠蛋白（两个条带）的纯度也在95%以上 整个过程用时140分钟 采用收集洗脱峰，人工换柱层析，则至少需要3天
5 检测系统
古老的方法：目测、离线显色反应

光学检测器（如紫外-可见、荧光、示差折 光、蒸发光散射、多角度激光散射等） 热学检测器（如吸附热等） 电化学检测器（如pH、极谱、库仑、安培 等） 电学检测器（如电导等）
简单整合型
BioLogic LP (Bio Rad)
AKTA Prime (GE)
复杂整合型
AKTA Explorer (GE)
BioLogic LP (Bio Rad)
按规模分
实验室规模 AKTA pure 流速<150mL/min
中试规模 AKTA pilot 流速4-400mL/min
生产规模 AKTA process 流速0.75-30L/min
封圈渗漏，须更换。
Pump Back-Wash Lines
Syringe fitting
◇ 如果冲洗液不循环，说明单向阀堵塞或
损坏，需要清洗或更换。
20% Ethanol : Water
维护——每月
系统清洗
◇ 按时清洗系统或在遇到问题时清洗系统。用1M
NaOH ，执行SystemWash指令，之后立即用水将NaOH 冲洗干净。 ◇ 检查泵头单向阀工作是否正常。


目测法

色谱名称的由来 最古老原始的方法 在玻璃柱中观察带颜 色物质形成的条带
石油醚
色谱
色素 碳酸钙颗粒
组分
显色反应

没有在线检测器 针对一些没有紫外吸收的物质，如多糖，PEG等 设备要求低 工作量大
紫外-可见检测器

主要组成部分

光源 分光系统 样品池 光强探测器 固定波长检测器 可变波长检测器

实验完成后用纯水在load和inject状态下清洗，20%乙醇保 存

使用完高盐溶液后用纯水冲洗
至少半个小时
定子（Stator）
转子（Rotor）
自动进样

进样动态范围广 样品残留少(连续洗针系统) 延迟体积少 进样重复性高(< 0.5% RSD) 主要应用于分析型色谱
泵进料


按工作方式

并联泵 串联泵
偏心轮双柱塞并联泵
偏心轮
2 1
V0 VB
V
0
-1
-2
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
TIME
通过每圈不同阶段电机转速控制
控制要求较高 AKTA做到了
凸轮双柱塞并联泵
理论速度曲线
加工精度要求较高
加工精度为0.01mm时的速度曲线
柱塞泵的操作注意事项


装填、平衡或者冲洗层析柱时不需要开灯； 完成实验后冲洗系统前把紫外灯关闭；
AKTA紫外可见检测器 操作注意事项

汞灯、氘灯、钨灯使用寿命和点燃次数相关 氙灯寿命与使用时间有关，和点燃次数无关

因此，在不必要的时候，例如装填、平衡或者冲 洗层析柱时随手关灯

多波长检测时，光栅一直处于旋转状态，两个波长 差别越大，旋转角度越大，影响寿命
3 输液系统
流动相输送方式

梯度混合方式

高位槽 气体压力 出口抽真空 泵送系统

梯度混合器 电磁阀（低压梯度） 高压梯度
蠕动泵 最常用 柱塞往复泵 其他类型的泵，如隔膜泵
最简单的方式
压力
高位槽
蠕动泵
真空
蠕动泵（软管泵）工作原理
优点：
结构简单，无密封件，无阀门 维护方便，易于清洗和清洁 可输送含颗粒液体以及高粘流体 很好的自吸功能，可干转 剪切力小，适合输送对剪切力敏感的 物料
1996年－2000年，北京化工大学，化学工程系生物化工专业，本科 2000年-2005年，北京化工大学，生命科学与技术学院，生物化工专业，博士，2006年至今，中国科学院过程工程研究所，生化工程国家重点实验室
成果 发表论文26篇，其中，SCI收录论文21篇，申请专利9项，授权2项。 “多柱组合色谱高通量蛋白质分离设备及层析柱”获得2011中国仪器仪表协会科 技创新奖（第三获奖人）； “以保护活性为目标的生物技术药物层析分离纯化技术”获得2013中国分析测试 协会科学技术奖“CAIA奖”一等奖（第三获奖人）。


进样系统：引入样品 层析柱 检测系统：对分离后各组份进行检测给出响应信号， 并进行处理

产品收集系统：收集分离产物
构造简图
六通阀 梯度 混合 进样环 计量泵
进样系统
流动相贮罐 层析柱
流动相输送系统
工作站
检测系统
检测器
分部收集器
AKTA组成示意图
堆积型
国产
GradiFrac (GE)
4 进样系统

手动进样

直接倒入柱子顶部 进样阀进样

自动进样 泵进样 柱切换进样
进样阀

手动进样阀 自动进样阀

定子（Stator）
转子（Rotor）
AKTA进样阀操作
手动进样注意事项

进样动作：Load状态时平缓推针，切换到Inject后再拔针以防倒 吸 清洗：在Inject状态清洗进样口 对于Rheodyne进样器
缺点：
× 精度差 × 脉动大 × 压力低
蠕动泵类型
单通道泵
多通道泵
柱塞往复泵特点

耐高压 脉冲小 流量宽、无极可调 重复性好、准确度高
柱塞泵工作原理
单向阀结构
宝石球
工作原理
吸液冲程
出口单向阀
排液冲程
抛光面
泵头 球座 流动相 进口单向阀
柱塞泵分类

按柱塞个数

单柱塞 双柱塞 三柱塞
主要内容

1.概述 2.蛋白层析系统的组成 3.输液系统 4.进样系统 5.检测系统 6.日常维护 7.选型购买
1 概述

液相色谱（层析）的发展

古罗马时期人们用布或纸分析染料与色素； 1903年，Tsweet发表首篇有关层析的论文； 1960s, HPLC商用仪器出现



高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效 分离分析方法
层析分类
特性
层析分类
介质粒度 (μ m) 40 ~ 200 25 ~ 40 3 ~ 10
低压 中压 高压
操作压力 (MPa) 不明显高于 1atm 0.5 ~ 4 4 ~ 20
2. 蛋白层析系统的构造

输液系统：

(1)提供连续、稳定而精确的流量； (2)进行梯度洗脱；
pH/电导检测器
◇清洗流动池：拆下pH电极，用1M NaOH清洗pH和电导流动池
30分钟，用 水冲洗。 ◇清洗pH电极（响应慢或校正斜率小于80%时）： 1. 盐沉积：0.1M HCl/ 0.1M NaOH/ 0.1M HCl 交替洗数次，间隔5分钟。 2 . 油脂沉积：1%SDS清洗后水洗。 3. 蛋白沉积：1% 蛋白酶于0.1M HCl 溶液中清洗后水洗。
针对料液中目标产物浓度极低，料液体积较大的 情况（如用离子交换捕捉发酵液中表达量非常低 的基因工程蛋白质）；

料液前处理非常重要，进料前必须用0.45 μm或 更小孔径滤膜严格过滤； 进料过程必须密切注意压力变化； 推荐使用蠕动泵进料。

柱切换进料
解决下列问题

人工换柱带来的泄漏和污染 周期长导致蛋白质失活 通量低和收率低
蛋白层析系统
李秀男 Email:xnli@ipe.ac.cn 中国科学院过程工程研究所 生化工程国家重点实验室
个人简介
研究方向
李秀男，博士，副研，硕导
生物分离工程：重点开展生化分离设备研制与产业化，生物技术药物分离分析新技 术、新方法的研究，蛋白质组合层析快速分离纯化平台，以及新型层析介质的应用 评价工作。 教育背景和工作经历

柱塞杆和密封圈

缓冲液泄露会导致盐析出，损伤柱塞杆和密封圈 使用20%乙醇作为泵后清洗液 保持流动，并定期检查是否流空或者长菌 使用完高盐溶液后用纯水冲洗至少半个小时




单向阀

最怕堵塞 流动相用0.45um膜过滤 超纯水和色谱纯试剂可以直接使用
隔膜泵
生产规模设备常用
特点：低剪切、大流量
M KNO3，或pH4.0的饱和KCl溶液）。
Open
泵
◇检查泵头周围是否渗漏，如果泵头有渗漏,或是流量不准确，则需更换泵
头密封圈。
◇更换缓冲液时，需排尽泵头里的残存气泡，否则会影响流速的准确性。
维护——每周
ON-LINE FILTER change
在线滤器
清洗过滤片，如有必要须更换过滤片，否 则会形成很高的在线压力，流速降低。
在位清洗
根据样品的脏/干净的程度，可按软件中CIP程序定期清洗 系统，防止系统管道被堵，压力增高。11
维护——每半年
压力检测器
零点校正（pressure offset)。
紫外可见检测器
◇用注射器推10%的表面活性剂SDS注入紫外流动池
停留20分钟，用水冲洗。 ◇用用注射器推甲醇或1M NaOH注入紫外流动池，停留20分钟，用水冲洗。
低压梯度
低压梯度比例阀
A B
脱气机
通过电磁阀的分时切换来实现流动相梯度
高压梯度
如何考察梯度混合性能

简单判断梯度比例阀是否泄漏——
设定泵使用一个单独通路（如A），泵出口排空，开大流速，观察其他通 路（B等）的流动相是否流动，正常时均不应流动。

综合考察梯度性能——
流动相A：水；流动相B：1%丙酮 不接层析柱，280nm检测，编辑梯度，设定流速，不进样进行检测