细菌学检验-13-流式细胞技术
流式细胞术在细菌快速检测中的应用研究
流式细胞术在细菌快速检测中的应用研究作者：董成霞来源：《中国卫生产业》 2014年第11期董成霞山东省济南市济阳县人民医院，山东济南 251400[摘要] 流式细胞仪被广泛的应用于光学、生物学、流体学和免疫学等领域。
其中流式细胞术是其检测的关键性技术，具有灵敏、快速的特点，在细菌的快速检测中得到较为广阔的应用。
本文就流式细胞术在环境样品细菌检测、临床细菌检测和趋磁细菌研究中的应用前景进行分析，以促进流式细胞技术的发展和完善。
[关键词] 流式细胞术;细菌;快速检测;应用[中图分类号] R446.5 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2014）04（b）-0194-02流式细胞术于90年代末期被创建，最初仅用于临床检验和科学研究，由于微生物的粒子或细胞较小，因此在微生物领域应用的较晚。
但在近几年来，随着荧光染料的改良和丰富、光学科技的不断完善，以及流式细胞检测仪自身的不断发展进步。
在如今，流式细胞术在微生物领域得到较为广泛的应用，尤其是对于细菌学问题的解决具有多参数测量精确，并且迅速的特点。
1流式细胞术在环境样品细菌检测中的应用以往对环境样品通常应用的方法为平板法，对微生物的多样性和总菌数的深入研究具有严重的制约性，常会给检测结果带来较大的误差，并且其他传统的检测方法，具有操作复杂繁琐的特点。
但流式细胞是在环境样品中的推广应用，具有测定精准、制备简单、可快速的对多参数数据进行采集，以及可对多元数据进行分析。
如今，流式细胞术已广泛的应用于土壤、水和空气等环境中的微生物研究的重要工具，图1为流式细胞术的样品制备技术。
曾有学者应用荧光原位杂交技术结合流式细胞检测仪对猪谷仓空气和实验室空气中的微生物进行测定。
先用液化收集器获取样品，然后用荧光染料染色后，应用流式细胞术辨别样品粉尘杂质中的菌体，并且可通过计数处理，获取细菌总数。
流式细胞术还可用以土壤样品的检测，Jean Christophe等学者应用流式细胞术对土壤样品中的微生物进行定量和定性检测。
流式细胞术课件
Flow cytometry of apoptotic cell death
Phospholipid redistribution
第七节 细胞周期的检测
Flow cytometry of cell cycle
原理：细胞在有丝分裂的过程中 DNA 会加倍。 （n----2n）
以二倍体细胞为例，流式检测细胞周期的过程。 首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞 （G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的 细胞又有 G1 期，S 期,G2 期和 M 期。
Flow cytometry of cell cycle
基本工作原理
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
基本过程
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
现代流式细胞仪包括
液流系统 聚焦细胞以供检测
光学系统 激发和收集光信号
电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分 析
液流系统示意图
鞘液
Fluorescence signals
Focused laser beam
喷嘴
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
2. 光学系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
细菌学检验-13-流式细胞技术
流式细胞仪 激光
细胞、生物粒子 鞘液及流动室 光学信号 PMT、放大电路 计算机，>5000
多参数，综合分析
显微镜 自然光、灯光 细胞、组织等
载玻片 形态及染色 目镜×物镜、光学放大 人工，200 简单，单参数
（二）散射光的测定
细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分
第十三章 流式细胞术
流式荧光免疫技术：是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确地对单个细胞理 化特性进行多参数定量分析和纯化（对特定 群体加以分选）的现代细胞分析技术。 流式细胞仪（flow cytometry，FCM）：集 激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克 隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。
（一）基本工作原理
基本过程
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
流式细胞仪与显微镜的区别
区别 光源 对象 承载工具 检测信号 放大方式 统计 结果
光收集系统：光电倍增管（PMT）
FACSCalibur 光路图
（3）电子数据处理系统
主要由计算机及其软件组成
FACSCalibur
特点：
光路调节系统固定
自动化程度高
操作简便
使用寿命长
配备1-2根激光
临床型（台式机）
细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析
BD LSR
FACS Vantage DiVa
流式细胞检测步骤
流式细胞检测步骤
流式细胞检测是一种常用的细胞分析方法，其步骤主要包括样品制备、细胞染色、细胞分析和数据分析等。
下面是流式细胞检测的一般步骤：
1. 样品制备：对待检测的细胞进行处理，如细胞培养、组织切片、外周血单个核细胞的分离等，得到单细胞悬浮液或细胞悬浊液。
2. 细胞染色：选择相应的细胞染色方法，如细胞膜荧光染色、核酸染色、细胞器标记等，以准确检测感兴趣的细胞亚群或分子表达。
3. 流式细胞仪设置：根据具体实验需求，设置流式细胞仪的参数，如激光波长、光源强度、挡光镜、滤光片等。
4. 样品注射：将细胞悬浮液或细胞悬浊液注入流式细胞仪，以逐个细胞通过检测通道。
5. 细胞分析：流式细胞仪以高速流体力学原理将细胞单个通过探测器，并同时记录细胞的光学参数，如细胞大小、形状、颜色等，以及某些特定标记的荧光信号。
6. 数据分析：根据实验需求，利用流式细胞仪软件或数据分析软件对收集的数据进行处理和分析，如细胞计数、亚群比例、荧光强度等。
7. 结果解读：根据数据分析的结果，进行相应的统计分析、结果解读和图形展示，得出实验结论。
需要注意的是，不同的实验目的和细胞类型可能需要略有差异的具体实验步骤和参数设置。
论临床医学检验中的流式细胞技术
论临床医学检验中的流式细胞技术本文详细的论述了临床医学检验中的流式细胞技术,并详尽的分析流式细胞技术的分析系统和分析方法。
标签：流式细胞技术临床医学检验1流式细胞技术概述流式细胞技术又可称为流式细胞分析(flow cytometry),主要是依靠流式细胞仪来测量悬浮细胞,并通过激光、计算机、电子、流体力学和多种生物科学技术来分析细胞的特性与功能。
在临床医学检验中流式细胞技术被应用于细胞生物检验、血液检验、肿瘤检验等医学检验。
2流式细胞技术的分析系统流式细胞技术的分析系统主要由3大部分组成,其中包括液流系统、电子系统和光学系统。
2.1光学系统光学系统(optical system)主要由激光和收集光学的元件组成,包括各种激光器和多组透镜。
各种不同功率的激光器可以提供单波长、高强度及稳定性高的不同波长激光,结合透镜的作用使激光束整形和聚焦,以此来检验细胞的特性。
2.2液流系统液流系统(fluidics system)主要是将被测的细胞通过液体流传递至流动室,经过液流聚焦形成单细胞流,并使其通过检测区,完成检验。
不同的仪器流动室也不尽相同,一般供单细胞流过的流动室都具有良好的光学特性,流速也较慢,细胞受照时间也较长,可收集的细胞信号光通量较大,配上收集透镜可获得很高的检测灵敏度和精密度。
2.3电子系统流式细胞电子系统的主要作用是将各种光信号成比例的转换为电信号,并进行数字化处理后传入电子计算机。
在光信号转换过程中光电倍增管具有较高的灵敏度,常用于收集细胞和微球与激光束相互作用产生的较微弱的侧向散射光或荧光信号。
3流式细胞技术的分析方法3.1流式细胞免疫表型分析方法采用荧光素标记的单克隆抗体作为分子探针,流式细胞仪检测细胞上的特异性抗原分子,这种方法被称为流式细胞免疫表型分析。
流式免疫表型分析可以简便、快速的分析出细胞的种类、亚类、功能等特性,通过间接免疫荧光染色、直接免疫荧光染色、多色免疫荧光染色等方法进行检验,流式细胞仪可同时鉴别单个细胞上的多种抗原,而且在极短的时间内能分析大量的细胞,使流式细胞技术成为了当前较为先进的细胞分析技术,在临床应用上也较为广泛,例如:血液淋巴细胞免疫表型、白血病细胞免疫表型、血小板免疫表型等。
流式细胞术在细菌快速检测中的应用研究
术对土壤样品中的微 生物进行 定量和定性 检测 。 应用溴化 乙锭 和 具有较大 的应用价值 。
跟１ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ具 有互 补作用 的荧光探针结合 光散射参数对菌体 的 流式 细胞术在 临床 医学 中的应用 ． 还可应用 于其 他病菌 的检
有学者曾应用结合分支杆 菌采用荧光素 Ｓ Ｙ Ｂ Ｒ Ｇ ｒ ｅ ｅ ｎ Ｉ 和二氧 大小进行限定 ， 然后从土壤微生物 的粉尘碎片和群落 中区分 出絮 测。 化硅纳米颗粒两种燃料标记后 ， 结合流式细胞术进行检测 。其检 凝剂产生菌检测菌【 ｌ 】 。
术 和确证实验两种方法进行两种药物敏感性的检测。其检测结果 曾有学者应 用荧光原位杂交 技术结合流式 细胞检测 仪对猪 表明 ， 流 式细胞术和传统 的检测结果具有 一致性 的特征 。 但 更富 谷仓空气和实验室空气 中的微 生物进行测定 。 先用液化 收集器获 有客观 、 自动化和快速 的特性 ， 能够联合应用 于药敏性 的实验研 取样 品， 然后用荧光染 料染色后 ， 应用 流式细胞术辨别样 品粉尘 究 。流式细胞技术还可获取异质性和药敏性的相关信息 。 属于有
ｌ 器 著
中的应用 ， 最初始于对药敏性的检测 。
Ｉ
Ｉ Ｉ ＿
量
ｌ
鲁
嚣
Ｓ ｕ ｌ ｌ ｅ ｒ 曾应用流式细胞术检测氨苄青霉素 、万古霉素 和头孢 他啶 ， 分别对其金黄色葡萄球菌 、 大肠杆菌 、 绿脓杆菌的药敏性反 应进行检测 。其结果表明 ， 应用流式细胞术能够灵敏 、 快速的对抗 生素的抗菌效应进行检测 ， 同时应用细胞氧化活性燃料 Ｃ Ｔ Ｃ， 可检 测 出多个不同的细胞亚 群 ， 由于不 同的细菌亚群对于抗生素敏感 性并不相同 ， 因此能够较为直观的反映细胞的异质性四 。 付 亮等学
流式细胞技术
流式细胞术（FCM）简述流式细胞术(Flow Cytometry)是70年代发展起来的一种利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理化及生物学特性（细胞大小、DNA/RNA含量、细胞表面抗原表达等）进行定量、快速、客观多参数相关检测分析的新技术。
它借鉴了荧光显微镜技术与血球计数原理,同时利用荧光染料,激光技术,单抗技术以及计算机技术的发展,大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数,为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段。
FCM在生命科学中的应用,标志着细胞生物学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平的研究。
为从微观认识细胞及横向比较特征提供了精密、准确的方法和仪器。
FCM的基本原理1、流式细胞仪系统流程：标本→激光系统→流动系统→信号处理系统→放大系统→计算机系统→结果打印2、基本原理：待测标本制备成单细胞悬液通过荧光染色后进入充满鞘液的流动室，鞘液压力与样品流压力是不同的，当二者的压力差异达到一定程度时，鞘液裹挟着样品流中细胞排成单列逐个经过激光聚焦区。
如果我们将细胞中感兴趣的部分特异性的标上荧光染料，那麽这些染料将在细胞通过激光检测区时受激光发出特定波长的荧光,通过一定波长选择通透性的滤色片,我们可将不同波长的散射光、荧光信号区分开来，并送到不同的光电倍增管中，经过一系列的信号转换、放大，数字化处理，我们就可以在计算机直观的统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。
选择不同的单克隆">克隆抗体及荧光染料，我们可以利用FC同时测定一个细胞上的多种不同特征；如果对具有某种特征的细胞有兴趣，我们还可以利用流式的分选功能将其分选出来，以便进一步培养、研究。
3、意义：FCM与单克隆">克隆抗体结合，可对细胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体进行定量检测，成为临床检验与研究的重要指标。
流式免疫荧光技术不仅能将表达位点的细胞群区分开来，而且还能进一步区分各细胞亚群。
流式细胞术实验方法及应用
淋巴细胞
T淋巴细胞（CD3+）
CD3+CD8（CD4+）
IFN-r
IL-4
数据显示采用的图:散点图、直方图、密度图 和二维等高图等。最常用的为单参数直方图 和双参数散点图。
FSC
SSC
参数的意义: FSC的强度与细胞的大小有关，也就是说，细胞越大，
散射光越强，细胞越小,散射光越弱; SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可反
三、单克隆抗体标记荧光探针选择
1.了解激发光波长和发射波长 常用荧光素
异硫氰酸（FITC）
藻红蛋白（PE）
碘化丙啶（PI）
藻红蛋白偶联物（PECY5）
藻红蛋白偶联物（PECY7）
别藻青蛋白（APC）
别藻青蛋白偶联物 （APC-CY7）
激发光波长（nm ）
488 488 488 488
488
633 633
细胞群周期与DNA倍
体时，将DNA含量直 方图分为三部分， 即G0/G1、S、G2/M
G0/G1 (2C)
S (2C→4C)
GG22//MM
(4(4CC) )
三个细胞峰。
方法：
细胞悬液（1*106） 70%冰乙醇 4ºC ，24h 离心去固定液 PBS洗2次 RNase
30min PBS洗1次
八、数据分析
流式细胞术的目的是对我们感兴趣的细胞进行 分析，其中设门技术是流式细胞数据分析中最为独 特的技术，是指在细胞分布图中指定一个范围或一 片区域（门），对其中的细胞进行单参数或多参数 分析。设门包括线性门、矩形门、圆形门、多边形 门、任意门和四象门等。
任意门、矩形门
线性门
四象门
多重逻辑门：当一种细胞有两种以上的参数需要被 分析时，常需要设多个门，各门之间由此出现逻 辑关系，此种设门技术称为多重逻辑门或联合门。
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液流系统（流动室、液流驱动系统）示意图
流动室
鞘液
进样孔
喷嘴
荧光信号
Fluorescence signals
激光束
Focused laser beam
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱
（2）光学系统：激光光源、光收集系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射较长波长的光，通过较
BD LSR
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选
FACSAria
科研型
特点： 分辨率高
选配多种波长和 类型激光器
可把感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（4路和24 孔板）
适用于高速分选 和多色分析
（4）分选系统
配有分选装置，分选带有某 种特性的细胞
单波长、高强度、高稳定性
多采用氩离子激光器或氦氖激光器
一般选配2~4根激光，488nm 、633nm和 355nm、407nmUV激光
最多检测13个荧光参数
光收集系统：滤光片
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
• 线性放大器和对数放大器
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
细胞不被破坏，单个细胞，测量快速、大量、多参数、 准确、灵敏、定量
第一节 概 述
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧 光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分 析和分选基础上发展起来的对细胞的物 理或化学性质（如大小、内部结构、 DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速 测量并可分类收集的高技术。
第十三章 流式细胞术
流式荧光免疫技术：是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确地对单个细胞理 化特性进行多参数定量分析和纯化（对特定 群体加以分选）的现代细胞分析技术。 流式细胞仪（flow cytometry，FCM）：集 激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克 隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成（结构）
细胞功能
大小、粒度
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原
表面面积、核浆比例 细胞活性
DNA含量与细胞周期 胞内细胞因子
RNA、蛋白质含量
激素结合位点
钙离子, PH值, 膜电位 酶活性、细胞受体
一、流式细胞仪的基本结构
（1）液流系统 （2）光学系统 （3）电子数据处理系统 （4）分选系统
பைடு நூலகம்
LP 500
SP 500
BP500/50
光收集系统：光电倍增管（PMT）
FACSCalibur 光路图
（3）电子数据处理系统
主要由计算机及其软件组成
FACSCalibur
特点：
光路调节系统固定
自动化程度高
操作简便
使用寿命长
配备1-2根激光
临床型（台式机）
细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析
第二节 工作原理
采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发 效率； 利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检 测的灵敏度和特异性； 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数 信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确 性。
（一）基本工作原理
基本过程
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
前向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细 胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部 结构属性。
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
测得的FS与SS信 号通过计算机处理， 可得到FS-SS图，由 此可仅用散射光信号 对未染色的活细胞进 行分析或分选。
多参数，综合分析
显微镜 自然光、灯光 细胞、组织等
载玻片 形态及染色 目镜×物镜、光学放大 人工，200 简单，单参数
（二）散射光的测定
细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分
为前向散射光和侧向散射光。
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细 胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
短波长的光 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光），
FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
Laser
激光光源
此为血细胞分类 的基本原理，但不能 分析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
（三）荧光测量
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激 发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。
• 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过 波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧 光信号区分开，送入不同的光电倍增管。
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
流式细胞仪与显微镜的区别
区别 光源 对象 承载工具 检测信号 放大方式 统计 结果
流式细胞仪 激光
细胞、生物粒子 鞘液及流动室 光学信号 PMT、放大电路 计算机，>5000
（1）液流系统：流动室、液流驱动系统
• 由样本和鞘液组成。 • 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的
单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进 入流动室形成样本流。 • 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是 包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心 位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。