细菌学检验基本技术共56页
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微生物学--细菌检验基本技术
5．指示剂
• 常用的指示剂：酚红、中性红、溴麝香草酚蓝、溴甲酚紫、 甲基红等
一、培养基
（二）培养基分类
1．按成分分类
• 合成培养基：是人工合成，组分明确，都是无机盐和化学 纯物质组成的培养基 • 天然培养基：也称复合培养基。是指含有化学成分不完全 明了或各批物质的成分很难一致的天然物质所组成的培养基， 如蛋白胨、牛肉膏、肉浸液、鸡蛋、马铃薯等。细菌检验常 用
一、培养基
6．灭菌 • 高压蒸汽灭菌
• 无糖：103．4kPa
121．3℃维持
15~20min
• 有糖： 68．95kPa 115℃ 维持
15min
• 间歇蒸汽灭菌法：血清、牛乳、鸡蛋 • 血清凝固器灭菌
一、培养基
7．质量检验 • 无菌试验：将制好的培养基在35℃温箱培养过夜，判定是否 灭菌合格 • 效果检查：按不同的培养要求，接种相应菌种，观察细菌的 生长、菌落形态、色素、溶血及生化反应等特征，判断培养基 是否符合要求
（2）结果 抗酸性细菌和非抗酸性细菌
三、细菌染色标本的检查-革兰染色
三、细菌染色标本的检查
•未脱色细菌呈红色为抗酸性细菌 •脱色经复染呈蓝色为非抗酸性细菌
三、细菌染色标本的检查
3．其他染色方法
（1）鞭毛染色 （2）荚膜染色
第二节 细菌的培养与分离技术
重点提示
• 培养基的主要成分及作用 • 培养基的种类 • 培养基制备的基本程序 • 细菌接种与培养方法 • 细菌在培养基中的生长现象
2020/2/28
7
常用诊断流程
• 表解法 区别比较复杂细菌，将各种细菌及其多 种
特性列成矩阵表格，使相互区别点十分明显，便于分析 比较
•
肠杆菌科初步分属
• 常用的指示剂：酚红、中性红、溴麝香草酚蓝、溴甲酚紫、 甲基红等
一、培养基
（二）培养基分类
1．按成分分类
• 合成培养基：是人工合成，组分明确，都是无机盐和化学 纯物质组成的培养基 • 天然培养基：也称复合培养基。是指含有化学成分不完全 明了或各批物质的成分很难一致的天然物质所组成的培养基， 如蛋白胨、牛肉膏、肉浸液、鸡蛋、马铃薯等。细菌检验常 用
一、培养基
6．灭菌 • 高压蒸汽灭菌
• 无糖：103．4kPa
121．3℃维持
15~20min
• 有糖： 68．95kPa 115℃ 维持
15min
• 间歇蒸汽灭菌法：血清、牛乳、鸡蛋 • 血清凝固器灭菌
一、培养基
7．质量检验 • 无菌试验：将制好的培养基在35℃温箱培养过夜，判定是否 灭菌合格 • 效果检查：按不同的培养要求，接种相应菌种，观察细菌的 生长、菌落形态、色素、溶血及生化反应等特征，判断培养基 是否符合要求
（2）结果 抗酸性细菌和非抗酸性细菌
三、细菌染色标本的检查-革兰染色
三、细菌染色标本的检查
•未脱色细菌呈红色为抗酸性细菌 •脱色经复染呈蓝色为非抗酸性细菌
三、细菌染色标本的检查
3．其他染色方法
（1）鞭毛染色 （2）荚膜染色
第二节 细菌的培养与分离技术
重点提示
• 培养基的主要成分及作用 • 培养基的种类 • 培养基制备的基本程序 • 细菌接种与培养方法 • 细菌在培养基中的生长现象
2020/2/28
7
常用诊断流程
• 表解法 区别比较复杂细菌，将各种细菌及其多 种
特性列成矩阵表格，使相互区别点十分明显，便于分析 比较
•
肠杆菌科初步分属
细菌检验基本技术
混合营养物制品。
组成和作用
---营养物质：蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、 鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐类
---水 ---凝固剂：琼脂、明胶 ---抑制剂 ---指示剂
4
培养基的种类（按用途分类）
基础培养基：培养营养要求不高的细菌，如普通平板。 营养培养基：能满足营养需求较高细菌的生长，如血平板。 鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌，如克
液体培养基接种法 半固体穿刺接种法 :用于观察细菌动力 斜面接种法 倾注培养法:用于细菌计数 涂布法
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
其他接种方法
5
细菌培养法
一般培养（需氧培养）
---培养温度：35℃（采用恒温培养箱） ---培养时间：18～24h
二氧化碳培养法：二氧化碳培养箱、烛缸法、化学法 厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养
2017-10-11
细菌内毒素的检测
目的： 主要用于诊断病人是否发生革兰阴性细菌感染。 用于检测注射用液和生物制品有无内毒素污染。
检测方法： 家兔发热法 鲎试验
细菌外毒素的测定
体内毒力试验：细菌外毒素对机体的毒性作用，可被
相应抗毒素中和，若先给动物注射抗毒素，然后再注射外 毒素，则动物不产生中毒症状。
有动力 现象
无动力 现象
细菌的生物化学鉴定技术
3
6
细菌的代谢产物检测与鉴定
碳水化合物的代谢试验 蛋白质和氨基酸的代谢试验 碳源和氮源利用试验 酶类试验 抑菌试验
碳水化合物的代谢试验
糖类发酵试验 氧化－发酵试验 β－半乳糖苷酶试验（ONPG） 七叶苷水解试验 甲基红试验 VP试验
组成和作用
---营养物质：蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、 鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐类
---水 ---凝固剂：琼脂、明胶 ---抑制剂 ---指示剂
4
培养基的种类（按用途分类）
基础培养基：培养营养要求不高的细菌，如普通平板。 营养培养基：能满足营养需求较高细菌的生长，如血平板。 鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌，如克
液体培养基接种法 半固体穿刺接种法 :用于观察细菌动力 斜面接种法 倾注培养法:用于细菌计数 涂布法
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
其他接种方法
5
细菌培养法
一般培养（需氧培养）
---培养温度：35℃（采用恒温培养箱） ---培养时间：18～24h
二氧化碳培养法：二氧化碳培养箱、烛缸法、化学法 厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养
2017-10-11
细菌内毒素的检测
目的： 主要用于诊断病人是否发生革兰阴性细菌感染。 用于检测注射用液和生物制品有无内毒素污染。
检测方法： 家兔发热法 鲎试验
细菌外毒素的测定
体内毒力试验：细菌外毒素对机体的毒性作用，可被
相应抗毒素中和，若先给动物注射抗毒素，然后再注射外 毒素，则动物不产生中毒症状。
有动力 现象
无动力 现象
细菌的生物化学鉴定技术
3
6
细菌的代谢产物检测与鉴定
碳水化合物的代谢试验 蛋白质和氨基酸的代谢试验 碳源和氮源利用试验 酶类试验 抑菌试验
碳水化合物的代谢试验
糖类发酵试验 氧化－发酵试验 β－半乳糖苷酶试验（ONPG） 七叶苷水解试验 甲基红试验 VP试验
细菌学检验-2-细菌学检验基本技术
1．基础培养基
含有基础生长所需的 基本营养成分，最常用 的是肉浸液，俗称肉汤 （broth），主要成分含 牛肉浸液和蛋白胨。
2．营养培养基
最常用的是血琼脂平板、巧克力血平板 等。
3．鉴别培养基
糖发酵管、克氏双糖 铁琼脂（KIA）、伊红镁蓝琼脂和动力-吲哚尿素（MIU）培养基等。
4．选择培养基
三、染色检查法
细菌标本经染料染色后，除能清楚看到细菌的 形态、大小、排列方式外，还可根据染色反应 将细菌进行分类。
染料
大多是人工合成的含苯环或苯的有机物。
色 基：即连接在苯环上带双键的有色化学基团，它 使染料带颜色，其色基越多，颜色越深。 如-NO2(硝基）,-N=N-（偶氮基）。
助色基：不显色，它决定了染料与被染物之间的亲和 性，且有酸、碱之分，决定了染料的酸碱性。 -NH2（碱性） -OH（酸性）
脊液(穿刺)；
三、标本的送检与处理
1.对环境敏感的细菌如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌和 流感嗜血杆菌等应保温并立即送检。
2.其他所有的标本采集后最好在2h之内送到实验室。 3.若不能及时送检，标本应置于一定环境中保存。 4.一般情况下，用于细菌培养的标本保存时间不应超
过24h。
５.病人标本中可能含有大量致病菌，必须注意安全防 护。
（一）不染色检查
主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动 状况。
常用的方法有：
压滴法 悬滴法 毛细管法
1、压滴法
细菌悬液
盖玻片 载玻片
镜检
2、悬滴法
细菌悬液
凹玻片 盖玻片
镜检
3、毛细管法
方法：选用孔径0.5-1.0mm，长约60-70mm毛细管， 以此管轻取细菌培养物，待液体进入后，两端火 焰封融。 应用：主要用来检测厌氧菌的动力。
微生物学检验基本技术
微生物学检验基本技术微生物学检验基本技术随着现代医学及相关科学技术的发展，各学科相互交叉和渗透，医学微生物学检验技术已深入到细胞、分子和基因水平，许多新技术、新方法已在临床微生物实验室得到广泛应用。
医学微生物学实验室的基本任务之一是利用微生物学检验技术，准确、快速检验和鉴定临床标本中的微生物，并对引起感染的微生物进行耐药性监测，为临床对感染性疾病诊断、治疗、流行病学调查及研究等提供科学依据。
第一节微生物形态学检查细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一，它是细菌分类和鉴定的基础，可根据其形态、结构和染色反应性等，为进一步鉴定提供参考依据。
一、显微镜检查由于细菌个体微小，肉眼不能看到，必须借助显微镜的放大才能看到。
一般形态和结构可用光学显微镜观察，其内部的超微结构则需用电子显微镜才能看清楚。
常用显微镜有如下几种。
1．普通光学显微镜采用自然光或灯光为光源，其波长约为0.4μm。
显微镜的分辨率为波长的二分之一，即0.2μm，而肉眼可见的最小形象为0.2mm。
故用油（浸）镜放大1 000倍，能将0.2μm的微粒放大成肉眼可见的0.2mm。
普通光学显微镜可用于细菌、放线菌和真菌等的观察。
2．暗视野显微镜常用于观察不染色微生物形态和运动。
在普通显微镜安装暗视野聚光器后，光线不能从中间直接透入，视野呈暗色，当标本接受从聚光器边缘斜射光后可发生散射，因此可在暗视野背景下观察到光亮的微生物如细菌或螺旋体等。
3．相差显微镜相差显微镜利用相差板的光珊作用，改变直射光的光位相和振幅，将光相的差异转换为光强度差。
在相差显微镜下，当光线透过不染色标本时，由于标本不同部位的密度不一致而引起光相的差异，可观察到微生物形态、内部结构和运动方式等。
4．荧光显微镜荧光显微镜与普通光学显微镜基本相同，主要区别在于光源、滤光片和聚光器。
目前大多数使用的是落射光装置，常用高压汞灯作为光源，可发出紫外光或蓝紫光。
滤光片有激发滤光片和吸收滤光片二种。
第一章 细菌检验基本技术
霍乱弧菌的制动试验
染色标本检查
检查的内容：
1、对标本合格与否进行评价； 2、了解标本有无细菌及大致菌量； 3、根据细菌形态、染色性质等对病原菌初步识
别分类，决定进一步的生化反应鉴定血清学鉴 定、并为临床选择用药提供帮助。
染色标本检查
常用染色方法有：
革兰染色（常用） 抗酸染色（结核病、麻风病） 荧光染色（结核、麻风、白喉、痢疾） 负染色（墨汁负染色法用于新型隐球菌检查） 特殊染色（鞭毛染色、荚膜染色、异染颗粒（白喉））
二、培养与分离技术（关键）
目的： 鉴定细菌的种类和保存菌种，为进一步确定细菌的致
病性、药物敏感性提供依据。 分类：
基础培养基 营养培养基 选择培养基 鉴别培养基 特殊培养基
二、培养与分离技术（关键）
理想的凝固物质具有的特性：
本身不被细菌利用； 在微生物生长温度范围内保持固体状态， 凝固点的温度对微生物无害； 不因消毒灭菌而破坏，透明度好，黏着力强。
二、培养与分离技术（关键）
接种和分离方法：
1、平板划线法 2、琼脂斜面接种法 3、液体接种法 4、穿刺接种法 5、涂布接种法 6、倾注平板法
二、培养与分离技术（关键）
专性需氧：结核分枝杆菌、霍乱弧菌 微需氧菌（5%氧气、10%二氧化碳、85%氮气）：空肠弯
曲菌，幽门螺杆菌 兼性厌氧菌：大多数病原菌 专性厌氧菌：破伤风梭菌、脆弱拟杆菌 二氧化碳培养（5%~10%二氧化碳）：淋病奈瑟菌、脑膜
炎奈瑟菌； 肠杆菌科细菌借助于克氏双糖、动力-吲哚-尿素、VP试验的组
合区分不同属和种。
四、非培养检验技术
对于培养时间长或难以培养的细菌以及细菌毒素、耐 药基因等。
1、免疫学检验技术：抗原检测和抗体检测 2、分子生物学检验技术：核酸杂交技术、聚合酶链反应、生物
染色标本检查
检查的内容：
1、对标本合格与否进行评价； 2、了解标本有无细菌及大致菌量； 3、根据细菌形态、染色性质等对病原菌初步识
别分类，决定进一步的生化反应鉴定血清学鉴 定、并为临床选择用药提供帮助。
染色标本检查
常用染色方法有：
革兰染色（常用） 抗酸染色（结核病、麻风病） 荧光染色（结核、麻风、白喉、痢疾） 负染色（墨汁负染色法用于新型隐球菌检查） 特殊染色（鞭毛染色、荚膜染色、异染颗粒（白喉））
二、培养与分离技术（关键）
目的： 鉴定细菌的种类和保存菌种，为进一步确定细菌的致
病性、药物敏感性提供依据。 分类：
基础培养基 营养培养基 选择培养基 鉴别培养基 特殊培养基
二、培养与分离技术（关键）
理想的凝固物质具有的特性：
本身不被细菌利用； 在微生物生长温度范围内保持固体状态， 凝固点的温度对微生物无害； 不因消毒灭菌而破坏，透明度好，黏着力强。
二、培养与分离技术（关键）
接种和分离方法：
1、平板划线法 2、琼脂斜面接种法 3、液体接种法 4、穿刺接种法 5、涂布接种法 6、倾注平板法
二、培养与分离技术（关键）
专性需氧：结核分枝杆菌、霍乱弧菌 微需氧菌（5%氧气、10%二氧化碳、85%氮气）：空肠弯
曲菌，幽门螺杆菌 兼性厌氧菌：大多数病原菌 专性厌氧菌：破伤风梭菌、脆弱拟杆菌 二氧化碳培养（5%~10%二氧化碳）：淋病奈瑟菌、脑膜
炎奈瑟菌； 肠杆菌科细菌借助于克氏双糖、动力-吲哚-尿素、VP试验的组
合区分不同属和种。
四、非培养检验技术
对于培养时间长或难以培养的细菌以及细菌毒素、耐 药基因等。
1、免疫学检验技术：抗原检测和抗体检测 2、分子生物学检验技术：核酸杂交技术、聚合酶链反应、生物
细菌生物学检验基本技术
（一）不染色标本检查
应用：主要用于观察活菌的动力和运动 方式。 常用方法：压滴法、悬滴法、暗视野映 光法。
1、压滴法
细菌悬液
盖玻片 载玻片
2、悬滴法
凹玻片 细菌悬液 盖玻片
镜检
染色检查法
细菌标本经染色后，除能清楚看到细菌 的形态、大小、排列方式外，还可根据 染色反应将细菌进行分类。
染色检查法
芽孢染色法
【结果】芽孢呈绿色，菌体呈红色。 【注意事项】①菌液中应含较多芽孢菌以保 证涂片质量。②也可采用先取菌制备涂片， 再进行初染→脱色→复染过程。但由于初 染过程是用火焰直接加热玻片，应掌握好 加热温度和加热时间。
鞭毛染色法
鞭毛是细菌的运动器官。由于其直径只有10nm~20nm，一 般染色不能看到，故须先用媒染剂增粗鞭毛，再经复染使其 着色。
抗酸染色法
【方法】将结核病人痰、麻风病人鼻分泌物或麻风病人 皮肤刮取物，按涂片→干燥→固定过程制备涂片。
呈 蓝 色 。
杂 菌 和 背 景 物
分 枝 杆 菌 呈 红 色
【 结 果 】
异染颗粒染色法
细菌异染颗粒是某些细菌（白喉杆菌、鼠疫杆菌、 结核杆菌等）常见的胞质颗粒。奈瑟（Neisser）法 是常用染色方法。
化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关。
等电点学说：与细菌所带电荷有关。
染色检查法
染色的一般原理和程序
染色材料准备→涂片制备→染色。
染色材料准备要注意染液配制、玻片处理、标本采集 等几个环节。 涂片制备是在玻片上制备菌膜的过程。通常是用接种 环将细菌涂成1cm~2cm大小菌膜，待自然干燥后经 固定处理再行染色。 染色是增加被染物折光性过程。根据形态学检查要求 可将染色法分为单染色法和复染色法。
1.细菌学检验基本技术(1)
用途 沙门氏和志贺氏菌属分离 志贺氏菌分离鉴别 大肠杆菌、产气杆菌分离鉴别 肠道致病菌分离 绿脓杆菌分离鉴别 志贺氏、沙门氏菌分离 肠道菌分离鉴别 霍乱弧菌分离 真菌、酵母菌分离
27
（5）鉴别培养基
➢ 利用各种细菌分解糖类和蛋白质等的能力及其代谢产物 的不同，在此类培养基中加入了某些特定的作用底物， 用于检查各种细菌的生化反应，以鉴别和鉴定细菌。
可降低氧化还原电势，吸收环境中的氧气，从而造 成缺氧状态。 （7）特殊培养基 ➢ 如培养L型细菌及支原体的软琼脂培养基、孢子培 养基等。
29
小结
细菌学检验的样品有哪些类型？ 细菌检验样品的采集及运送原则 不同类型培养基的灭菌要求有何不同？ 培养基的分类
30
不耐高温的血清、尿素等：滤过除菌
外观：完整性、水分浸入、色泽异常、培养基外溢、干裂等弃去。 无菌试验：放入36±1℃过夜，有菌生长弃去。 功能检查：标准菌株培养24～48h，无菌或生长不好。重复接种 结果仍同前，弃去。
冷藏，不宜过久。
防止干涸、变质和污染。
13
所用器材及过程
培养基、玻璃器皿 天平、药匙
矫正pH
先调pH，沸水加热5-10min，冷却 后过滤；滤纸、绒布等过滤
过滤澄清
液体：不超过容器2/3；斜面： 1/５管；半固体培养基： 1/3管 ；高层斜面：1/4～1/3管 ；平板：13~15ml
分装 灭菌 检定 保存
耐高压：121℃，15min 含糖：115 ℃，15min 鸡蛋、牛奶等：间歇灭菌3天3次
名
称
蛋白胨水培养基
乳糖胆盐发酵培养基
0.5%乳糖发酵培养基
半固体培养基
三糖铁琼脂培养基（TST）
用
微生物学检验基本技术
微生物学检验基本技术随着现代医学及相关科学技术的发展，各学科相互交叉和渗透，医学微生物学检验技术已深入到细胞、分子和基因水平，许多新技术、新方法已在临床微生物实验室得到广泛应用。
医学微生物学实验室的基本任务之一是利用微生物学检验技术，准确、快速检验和鉴定临床标本中的微生物，并对引起感染的微生物进行耐药性监测，为临床对感染性疾病诊断、治疗、流行病学调查及研究等提供科学依据。
第一节微生物形态学检查细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一，它是细菌分类和鉴定的基础，可根据其形态、结构和染色反应性等，为进一步鉴定提供参考依据。
一、显微镜检查由于细菌个体微小，肉眼不能看到，必须借助显微镜的放大才能看到。
一般形态和结构可用光学显微镜观察，其内部的超微结构则需用电子显微镜才能看清楚。
常用显微镜有如下几种。
1．普通光学显微镜采用自然光或灯光为光源，其波长约为0.4μm。
显微镜的分辨率为波长的二分之一，即0.2μm，而肉眼可见的最小形象为0.2mm。
故用油（浸）镜放大1 000倍，能将0.2μm 的微粒放大成肉眼可见的0.2mm。
普通光学显微镜可用于细菌、放线菌和真菌等的观察。
2．暗视野显微镜常用于观察不染色微生物形态和运动。
在普通显微镜安装暗视野聚光器后，光线不能从中间直接透入，视野呈暗色，当标本接受从聚光器边缘斜射光后可发生散射，因此可在暗视野背景下观察到光亮的微生物如细菌或螺旋体等。
3．相差显微镜相差显微镜利用相差板的光珊作用，改变直射光的光位相和振幅，将光相的差异转换为光强度差。
在相差显微镜下，当光线透过不染色标本时，由于标本不同部位的密度不一致而引起光相的差异，可观察到微生物形态、内部结构和运动方式等。
4．荧光显微镜荧光显微镜与普通光学显微镜基本相同，主要区别在于光源、滤光片和聚光器。
目前大多数使用的是落射光装置，常用高压汞灯作为光源，可发出紫外光或蓝紫光。
滤光片有激发滤光片和吸收滤光片二种。
用蓝光的荧光显微镜除可用一般明视野聚光器外，也可用暗视野聚光器，以加强荧光与背景的对比。
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第一节 样本的采集与送检
在公共卫生及预防医学领域所涉及的细菌学检验样 本种类繁多，包括来自食品、化妆品、涉水产品、 消毒及卫生用品、环境及物品（水、土壤、空气， 各种物品）、正常人体及临床等的样本。
许欣
1
一、临床样本的采集与送检
（一）血及骨髓样本的采集 1. 采样时间：发热期、用药之前、 病情发展 2. 采样部位及频率：多部位、高频率 3. 样本采集的量：成人血量10ml，婴儿1ml～2ml，儿
养基或pH7.0的甘油PBS 3. 注意事项：无菌操作、可能厌氧培养
许欣
3
一、临床样本的采集与送检
（四）痰及上呼吸道样本的采集 1. 采样时间：晨痰、鼻咽拭子 2. 采样方法：自然咳痰法、支气管镜采集法、胃内采痰
法、气管穿刺法等 ；咽拭子 3. 注意事项：先漱口、结核分枝杆菌和真菌可4℃保存
许欣
15
二、不染色检查
细菌的活体观察，主要用于观察动力 悬滴法——凹玻片
压滴法——平玻片
许欣
16
三、染色检查
常用碱性染料（美蓝、孔雀绿、碱性复红、结晶紫、 沙黄等）
单染色法，复染色法，特殊结构染色法（鞭毛、芽孢、 荚膜等），负染色法、荧光染色法，革兰染色法（结 晶紫、碘液、95%酒精、碱性复红），抗酸染色法 （分枝杆菌、石炭酸复红、美蓝）
许欣
13
第二节 细菌的形态结构检查法
了解标本中有无细菌及其大致的数量。 验证培养物是否为纯种。 形态检查结果可做初步诊断。 不染色检查法和染色检查法。 借助显微镜对形态、大小、排列、结构的直接观察。
许欣
14
一、显微镜检查
1、普通光学显微镜(light microscope)：分辨率0.2μm， 用于细菌染色标本的观察。
许欣
4
一、临床样本的采集与送检
（五）其它临床样本 化脓和创伤样本：棉拭子 脑脊液、胆汁、胸水、腹水、心包液、关节液和鞘膜液
等：穿刺 生殖道：棉拭子 组织样本：内镜 炎症或组织坏死部位：手术
许欣
5
二、食品卫生细菌学检验样本
（一）样品采集原则 注意代表性，防止样品受污染、变质和细菌生长 大样(一整批 )、中样(混合200g )和小样(检样25g) （二）样品采集方法 无菌用具、包装完好、混合、震摇、冷冻、冷藏 （三）采样的数量 根据食品种类的不同，采样的数量也应不同 （四）注意事项 3h内送实验室，无菌操作
2、暗视野显微镜(dark-field microscope)：具有暗视野聚 光器，用于观察不染色标本活菌的形态、运动方式。
3、相差显微镜(phase contrast microscope)：具有环状光 栅聚光器和相差物镜，既可观察活体细胞的外形和运动 方式，又能观察其内部细微结构及这些结构的数量。
按照采样器所用介质性质又可分为固体及液体采样器。 按采样器的工作原理可分为六种：撞击式、沉降式、过
滤式、静电吸附式、旋风式和离心撞击式采样器。
许欣
12
六、空气样本
（二）空气中细菌等微生物采样的介质 采样介质(包括培养基)对细菌等微生物具有支撑、黏附、
保护和生长作用。常用有凡士林、聚硅酮，氧化烯二十 二烷酮(OED)和SGB(糖、甘油、牛血清白蛋白) （三）空气中细菌等微生物采样方法及送检 1. 平板沉降法：参见医院空气采样规定。 2. 空气采样器采样：常用Andersen采样器
童3ml～5ml；当怀疑为真菌感染时，应采集双份量， 分别作双相培养(37℃/28℃)。骨髓1 ml～2 ml。 4. 样本的送检：尽快，室温 5. 注意事项：同时需氧和厌氧培养
许欣
2
一、临床样本Biblioteka 采集与送检（二）尿液样本的采集 1. 采样时间：晨尿、用药前 2. 采样方法：10ml，中段尿、肾盂尿、导尿 3. 注意事项：无菌操作，用药前 （三）粪便样本的采集 1. 采样时间：急性期、新鲜粪便 2. 采样方法：自然排便、直肠拭子、Cary-Blair运送培
微生物直接采到固体培养基上(如Andersen采样器)， Ⅱ类是把微生物先采到液体或其它介质上，再转种到培 养基或细胞上显示(如Porton采样器)。
许欣
11
六、空气样本
按照流量的有效数字分，3位数以上为大流量(≥500 L/min)，2~3位数为中流量(499L/min～11 L/min)，1 位数为小流量(≤10L/min)。
许欣
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四、生活饮用水细菌学检验样本
（一）水样采集
许多水体随时间和空间会发生很大变化，要采集具有代 表性的样品，必须定出合理的采样规划。
（二）采样点的选择
注意样品的代表性，河水、湖水、地下水、自来水 （三）采样器具 采样瓶、自动采样器、容器可加硫代硫酸钠 （四）样品送检及注意事项 4h内检验、可冷藏
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五、消毒及卫生用品
（二）一次性使用的卫生用品 同一批号3个运输包装中至少随机抽取12个最小包装
量；1/4用于检测、1/4用于留样、2/4就地封存准备复 测。
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六、空气样本
平板沉降法和采样器采集法 （一）空气微生物采样器分类 按照采样方式的不同可分为两类(Ⅰ和Ⅱ类)，Ⅰ类是将
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三、化妆品细菌学检验样本
（一）采样数量 每批两个大包装抽取4个包装，10g或10ml （二）样本的处理 1. 液体样品：10倍稀释，油性物用液体石蜡、土温-80 2. 膏霜乳剂样品：亲水性-玻璃珠，疏水性-先行乳化 3. 固体样品的处理：均质后取上清液 （三）样品送检原则及注意事项 1. 维持样品污染原状（出厂污染状态） 2. 去除残留防腐剂及抑菌剂（吐温-80和卵磷脂 ） 3. 注意事项（室温存放，多项目时先做微生物）
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五、消毒及卫生用品
（一）医疗卫生机构消毒及卫生用品 物表 ：5cm×5cm灭菌规格板，100cm2 区域 空气：高度150cm、距墙100cm；面积≤30m2，设
一条对角线上内、中、外3点；面积 ＞ 30m2，设4 角及中央5点，暴皿5min；或用采样器 手/皮肤粘膜：含中和剂棉拭子，5cm×5cm规格板 医疗用品：破坏、棉拭子 消毒剂：1ml加至9ml中和剂中
在公共卫生及预防医学领域所涉及的细菌学检验样 本种类繁多，包括来自食品、化妆品、涉水产品、 消毒及卫生用品、环境及物品（水、土壤、空气， 各种物品）、正常人体及临床等的样本。
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一、临床样本的采集与送检
（一）血及骨髓样本的采集 1. 采样时间：发热期、用药之前、 病情发展 2. 采样部位及频率：多部位、高频率 3. 样本采集的量：成人血量10ml，婴儿1ml～2ml，儿
养基或pH7.0的甘油PBS 3. 注意事项：无菌操作、可能厌氧培养
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一、临床样本的采集与送检
（四）痰及上呼吸道样本的采集 1. 采样时间：晨痰、鼻咽拭子 2. 采样方法：自然咳痰法、支气管镜采集法、胃内采痰
法、气管穿刺法等 ；咽拭子 3. 注意事项：先漱口、结核分枝杆菌和真菌可4℃保存
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二、不染色检查
细菌的活体观察，主要用于观察动力 悬滴法——凹玻片
压滴法——平玻片
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三、染色检查
常用碱性染料（美蓝、孔雀绿、碱性复红、结晶紫、 沙黄等）
单染色法，复染色法，特殊结构染色法（鞭毛、芽孢、 荚膜等），负染色法、荧光染色法，革兰染色法（结 晶紫、碘液、95%酒精、碱性复红），抗酸染色法 （分枝杆菌、石炭酸复红、美蓝）
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第二节 细菌的形态结构检查法
了解标本中有无细菌及其大致的数量。 验证培养物是否为纯种。 形态检查结果可做初步诊断。 不染色检查法和染色检查法。 借助显微镜对形态、大小、排列、结构的直接观察。
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一、显微镜检查
1、普通光学显微镜(light microscope)：分辨率0.2μm， 用于细菌染色标本的观察。
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一、临床样本的采集与送检
（五）其它临床样本 化脓和创伤样本：棉拭子 脑脊液、胆汁、胸水、腹水、心包液、关节液和鞘膜液
等：穿刺 生殖道：棉拭子 组织样本：内镜 炎症或组织坏死部位：手术
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二、食品卫生细菌学检验样本
（一）样品采集原则 注意代表性，防止样品受污染、变质和细菌生长 大样(一整批 )、中样(混合200g )和小样(检样25g) （二）样品采集方法 无菌用具、包装完好、混合、震摇、冷冻、冷藏 （三）采样的数量 根据食品种类的不同，采样的数量也应不同 （四）注意事项 3h内送实验室，无菌操作
2、暗视野显微镜(dark-field microscope)：具有暗视野聚 光器，用于观察不染色标本活菌的形态、运动方式。
3、相差显微镜(phase contrast microscope)：具有环状光 栅聚光器和相差物镜，既可观察活体细胞的外形和运动 方式，又能观察其内部细微结构及这些结构的数量。
按照采样器所用介质性质又可分为固体及液体采样器。 按采样器的工作原理可分为六种：撞击式、沉降式、过
滤式、静电吸附式、旋风式和离心撞击式采样器。
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六、空气样本
（二）空气中细菌等微生物采样的介质 采样介质(包括培养基)对细菌等微生物具有支撑、黏附、
保护和生长作用。常用有凡士林、聚硅酮，氧化烯二十 二烷酮(OED)和SGB(糖、甘油、牛血清白蛋白) （三）空气中细菌等微生物采样方法及送检 1. 平板沉降法：参见医院空气采样规定。 2. 空气采样器采样：常用Andersen采样器
童3ml～5ml；当怀疑为真菌感染时，应采集双份量， 分别作双相培养(37℃/28℃)。骨髓1 ml～2 ml。 4. 样本的送检：尽快，室温 5. 注意事项：同时需氧和厌氧培养
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一、临床样本Biblioteka 采集与送检（二）尿液样本的采集 1. 采样时间：晨尿、用药前 2. 采样方法：10ml，中段尿、肾盂尿、导尿 3. 注意事项：无菌操作，用药前 （三）粪便样本的采集 1. 采样时间：急性期、新鲜粪便 2. 采样方法：自然排便、直肠拭子、Cary-Blair运送培
微生物直接采到固体培养基上(如Andersen采样器)， Ⅱ类是把微生物先采到液体或其它介质上，再转种到培 养基或细胞上显示(如Porton采样器)。
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六、空气样本
按照流量的有效数字分，3位数以上为大流量(≥500 L/min)，2~3位数为中流量(499L/min～11 L/min)，1 位数为小流量(≤10L/min)。
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四、生活饮用水细菌学检验样本
（一）水样采集
许多水体随时间和空间会发生很大变化，要采集具有代 表性的样品，必须定出合理的采样规划。
（二）采样点的选择
注意样品的代表性，河水、湖水、地下水、自来水 （三）采样器具 采样瓶、自动采样器、容器可加硫代硫酸钠 （四）样品送检及注意事项 4h内检验、可冷藏
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五、消毒及卫生用品
（二）一次性使用的卫生用品 同一批号3个运输包装中至少随机抽取12个最小包装
量；1/4用于检测、1/4用于留样、2/4就地封存准备复 测。
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六、空气样本
平板沉降法和采样器采集法 （一）空气微生物采样器分类 按照采样方式的不同可分为两类(Ⅰ和Ⅱ类)，Ⅰ类是将
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三、化妆品细菌学检验样本
（一）采样数量 每批两个大包装抽取4个包装，10g或10ml （二）样本的处理 1. 液体样品：10倍稀释，油性物用液体石蜡、土温-80 2. 膏霜乳剂样品：亲水性-玻璃珠，疏水性-先行乳化 3. 固体样品的处理：均质后取上清液 （三）样品送检原则及注意事项 1. 维持样品污染原状（出厂污染状态） 2. 去除残留防腐剂及抑菌剂（吐温-80和卵磷脂 ） 3. 注意事项（室温存放，多项目时先做微生物）
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五、消毒及卫生用品
（一）医疗卫生机构消毒及卫生用品 物表 ：5cm×5cm灭菌规格板，100cm2 区域 空气：高度150cm、距墙100cm；面积≤30m2，设
一条对角线上内、中、外3点；面积 ＞ 30m2，设4 角及中央5点，暴皿5min；或用采样器 手/皮肤粘膜：含中和剂棉拭子，5cm×5cm规格板 医疗用品：破坏、棉拭子 消毒剂：1ml加至9ml中和剂中