双向电泳笔记
XX生物技术公司蛋白质双向电泳知识学习
胶条平衡
等电聚焦结束后进行SDS-PAGE电泳之前需 进行胶条平衡，以便于被分离的蛋白质与 SDS充分结合，保证SDS-PAGE电泳的顺利 进行 步骤：一般采用两步平衡法，用含SDS、 DTT、尿素和甘油等的缓冲液先平衡一次， 再用碘乙酰胺取代DTT后再平衡一次
SDS-PAGE电泳
使得蛋白质按照分子量的大小不同而分离， 与普通SDS-PAGE相似 在双向电泳系统中无需浓缩胶，因为第一 向等电聚焦已经使得蛋白得到浓缩
等电聚焦
通过10000V高压使得蛋白质按照其等电点特 性进行聚焦 步骤：胶条水化、低压除盐、高压聚焦、低 压维持 聚焦时间：聚焦时间太短，会导致水平和垂 直条纹，过长会造成蛋白图谱变性，在胶条 碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。最佳时 间的确定需要根据蛋白样品类型、蛋白载样 量、PH范围和胶条长度来确定。
图像分析
常用软件： Image-Master (GE Healthcare) PDquest (Bio-Rad) 分析步骤：胶点检测和定量、凝胶匹配、比 较分析
分子量 提取的总蛋 白溶液
2DE图谱
硝酸银染色图谱
考马斯亮蓝染色图谱
双向电泳（DIGE）示意图
样品1： Cy3标记 将标记的 样品混合 样品2： Cy5标记
双向电泳分离
荧光扫描仪扫描
图像重叠分析
DIGE图谱
样品制备
双向电泳的最关键步骤之一 制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质，尽 可能简单的操作步骤，注意防止样品提取过 程中的各种化学修饰，去除样品中核酸、盐 离子等干扰物质
差异蛋白点选取
蛋白酶解及质谱分析 差异蛋白点的成功鉴定
生物学问题的解释
蛋白质双向电泳的基本原理(一)
蛋白质双向电泳的基本原理(一)蛋白质双向电泳的基本原理蛋白质双向电泳是一种常用的分离和分析蛋白质的技术方法。
它通过利用蛋白质在电场中移动的特性，结合两个方向的电场，实现对复杂蛋白质混合物的分离和鉴定。
下面将从浅入深地解释蛋白质双向电泳的基本原理。
1. 电泳的基本原理电泳是一种基于物质在电场中迁移的原理，将带电粒子或分子分离开的技术。
在电泳过程中，带电的蛋白质分子会受到电场的作用力而移动，移动的速度与其电荷大小和分子质量有关。
2. 单向电泳的局限性在传统的单向电泳中，蛋白质样品被施加一个方向的电场，使得蛋白质分子按一维的方向进行迁移。
然而，由于蛋白质复杂性和电泳条件的限制，单向电泳难以有效地分离复杂的蛋白质混合物。
3. 双向电泳的优势双向电泳是为了克服单向电泳的局限性，实现更好的分离效果而发展起来的一种电泳技术。
它利用两个方向的电场交替施加，使得蛋白质分子在水平和垂直方向上均发生迁移，从而实现更高分辨率的蛋白质分离。
4. 蛋白质双向电泳的操作步骤•第一维电泳：将蛋白质样品在一个细长的电泳槽中垂直施加电场，使得蛋白质在水平方向上移动。
一般使用等电聚焦（IEF）技术，根据蛋白质的等电点来完成分离。
•电泳缓冲：在第一维电泳过程中，需要使用特定的电泳缓冲液，以确保蛋白质在移动过程中维持稳定的电荷状态。
•Gel转移：第一维电泳后，将蛋白质分离到一根细长的凝胶条上，凝胶条上有各种不同pH值的缓冲液。
•第二维电泳：将凝胶条垂直放置在另一个电泳槽中，施加另一个方向的电场。
凝胶条上的蛋白质会在垂直方向上继续移动，最终得到更高分辨率的蛋白质分离结果。
5. 蛋白质双向电泳的应用蛋白质双向电泳在生物医学和生命科学研究中得到广泛应用。
它被用于分离和鉴定复杂蛋白质混合物，寻找新的蛋白质标记物或生物标志物，研究蛋白质的功能和相互作用等。
6. 结论蛋白质双向电泳是一种重要的分离和鉴定蛋白质的技术方法，通过结合两个方向的电场，实现对复杂蛋白质混合物的高效分离。
蛋白质双向电泳注意点
蛋白质双向电泳注意点
蛋白质的双向电泳的第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing, IEF）,根据蛋白质的等电点不同进行分离；第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），按亚基分子量大小进行分离。
经过电荷和分子量两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。
注意事项：
1. 一向聚焦与二向电泳之间需要平衡，时间视蛋白质的性质而定，一般为10min，最多不超过15min。
2. 过量的上样量会引起双向图形畸形，特别在一向聚焦时，当样品浓度超过5mg时，则蛋白质凝聚和沉淀，使二向时产生水平和垂直条纹。
3. 含尿素的试剂均应避免过高的温度处理，一般不要超过30℃，否则尿素分解产生异硫氰酸盐会引起羧基甲酰化而导致电荷不均一性。
4. 第一向中过量的去污剂会严重影响双向电泳图谱，因此聚焦完毕进行平衡前，用双蒸馏水冲洗胶条，以除去残留的去污剂。
5. 双向电泳中双向凝胶间的界面紧密接触非常重要，如果接触不好或者两者之间留有气泡，则导致转移时分子扩散。
6. 双向电泳中的条纹现象是常见的问题。
水平条纹可能与一向电泳时间不够，聚焦不好有关，或者在加样处产生沉淀和引起重新溶解所致；纵向条纹则表明样品没溶解，这可以通过调整样品量，增加电泳时间，改善样品的溶解状态，同时在加样前通过高速离心以除掉所有不溶物。
双向电泳实验双向电泳实验过程及相关溶液配置（经典）
双向电泳实验双向电泳实验过程及相关溶液配置（经典）双向电泳实验双向电泳实验过程及相关溶液配置(经典)3.2点样，上胶分两次吸取样品，每次170ul,按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开Immobiline DryStrip gels(18cm，pH 3-10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品双向电泳实验过程及相关溶液配置A.实验过程一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息二、实验步骤：1.样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白：100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时其中每隔10~15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，-80oC保存2.Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul,5ul,10ul,15ul,20ul的BSA溶解液，另2管中分别加入2ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul)，然后，各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用)，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值(测量过程要在一个小时内完成)例如：编号蛋白量(ul)Buffer(ul)Bradford(ml)OD595值1 080 40 25 75 40.024 310 70 40.061 415 65 40.091 520 60 40.116 Bt4 278 40.079 Bt4 476 4转Bt4 278 40.075转Bt4 476 4标准曲线方程式：Y=aX b.其中Y为OD值，X为蛋白含量a、b 通过作图输入数据可知相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得OD值测量过程：比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值3.双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)3.1水化液的制备称取2.0mg的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05%的溴酚兰，3.5ul(0.5%v/v)IPG buffer(pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min除杂质，取上清在含300ug蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清注意：胶条使用前，要在室温中平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线齐平3.3 IPG聚焦系统跑胶程序的设定(跑胶温度为20oC)S1(30v,12hr,360vhs,step)S2(500v,1hr,500vhs,step)S3(1000v,1hr,1000vhs,step)S4(8000v,0.5hr,2250vhs,Grad)S5(8000v,5hr,40000vhs,step)共计44110vhs,19.5小时其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦3.4平衡用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上吸干(胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条要将两头剪去)，再以超纯水冲洗，滤纸吸。
蛋白质双向电泳
实验报告蛋白质的双向电泳罗云云水产养殖20102190171、第一相等点聚焦电泳的胶条从负极到正极，pH如何排列，为什么？答：从负极到正极PH逐渐减小，也就是PH值小的的一端位于电泳的正极。
因为蛋白质在大于其等电点的PH环境中带负电，在小于其等电点的PH环境中带正点。
根据电泳时正电荷向负极移动原理，如果PH值小的一端位于负极，而此时带正电荷的蛋白质没法再向负极移动，因此只能是PH值小的一端位于正极。
即从负极到正极PH值逐渐减小。
2、为什么双向电泳（无论是第一相和第二相）过程中，要尽量消除气泡？答：第一向：如果在胶条和含蛋白质的水化液之间存在气泡，则气泡下面的蛋白质不能进入胶条。
对结果的影响可分为两种：①如果所有蛋白质在水化液中均匀分布，那么气泡只影响结果的显色程度，即银染后的黑色会减淡。
②如果某种蛋白质很少，恰巧只存在于气泡的下面，则气泡对结果的影响是严重的，直接影响电泳结果所能分析出来的样品中所含有的蛋白质的种类。
第二向：如果放入胶条时在胶条与电泳胶之间产生气泡，气泡会影响其所在通路上的电压分布。
其结果有两种：①蛋白质不能通过气泡，该处的蛋白质被遗漏。
②蛋白质可绕过气泡，但其所在跑道会发生偏移或改变，且移动距离也会发生改变，直接影响结果分析。
3、平衡液中的DTT和碘乙酰胺的作用是什么？答：①ＤＴＴ：即二流苏糖醇，它是一种还原剂。
可以还原蛋白质中的二硫键为巯基。
与巯基乙醇相比效果更好。
②碘乙酰胺：其所用是使蛋白质中由二硫键还原而成的巯基保持还原态。
其机制是在DTT作用的基础上使—SH与I—CH2—CO—NH2发生反映产生HI和—S—CH2—CO—NH2。
这样使—SH 不能复原。
4、水化液中CHAPS的作用是什么？它与SDS有什么区别？答：CHAPS是非离子型表面活性剂，有助于不易溶于水的蛋白质溶解。
SDS也是表面活性剂，但它是离子型的，与蛋白质结合后会使蛋白质分子带上大量的负电荷，从而影响蛋白质的等电点。
双向电泳的概念和原理
双向电泳的概念和原理双向电泳是一种应用在生物和化学实验中的分子电泳技术，它能够将完整的分子进行分离，从而实现提取特定的分子组份。
一、双向电泳的概念双向电泳是一种分子技术，它能够将分子分开并且分离出它们内部的活性组分。
利用电泳技术，可以把一些我们有利用价值的分子聚集到集簇中，把其它不要的环境分子分离出去。
通常情况下，电泳是通过具有某种特殊电势的电流来将分子分离的。
由于双向电泳技术，可以利用液相层析原理，将不同的分子聚集到不同的集簇中，从而把其它的不需要的或者有害的分子挤出去。
二、双向电泳的原理双向电泳的原理是利用电流来将分子进行分离，因此在实践过程中，首先需要构建一个体系，在该体系中，利用某种特殊的电流，生成一种能够将分子分解的条件。
首先，将样品加入到某种带有类似电流的环境中，当样品中的分子接触到了这种带有电流的环境，就会形成一种吸引力，从而使分子受到电流的作用，接着分子中的活性组分也会朝着电流的方向而移动。
而由于这种电流的作用，活性组分会被吸引到这种电流的反方向，使得活性组分能够从样品中分离出来，这就是双向电泳的原理。
三、双向电泳的应用双向电泳技术在生物和化学实验中都有广泛的应用，在蛋白质纯化实验、肽段分离实验等实验中，都可以利用双向电泳技术实现分子的精确分离。
此外，双向电泳技术在疾病的早期筛查中也可以发挥着重要的作用，比如癌症的筛查，可以利用双向电泳技术来检测出肿瘤细胞中的活性组分，为早期筛查提供重要的依据。
四、双向电泳的优势双向电泳技术有着诸多优势，首先，双向电泳技术具有准确性高的优势，可以把不同组分的分子成功地分离出来；其次，双向电泳技术操作简单，可以节省大量的实验时间；最后，双向电泳技术可以把活性分子完美的纯净，大大提高了实验的效率。
总之，双向电泳是一种广泛应用的分子技术，它能够把完整的分子进行分离，从而实现提取特定的分子组份。
双向电泳技术实用性强，可以应用在生物和化学试验中，为后续实验提供重要的依据和有效的结果。
双向电泳的概念和原理
双向电泳的概念和原理双向电泳是一种采用两个方向的电场同时作用于凝胶电泳系统的技术，用于分离复杂样品中的蛋白质或核酸。
首先，将样品溶解于含有凝胶的电泳缓冲液中。
凝胶是一种聚合物网状结构，可以限制分子的运动，将其分离。
常见的凝胶材料包括聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。
第一步是水平电泳。
在水平电泳阶段，一个方向的电场施加在凝胶中，使得带电分子向着相应的电极方向移动。
这个方向通常被称为水平方向，因为它从一个电极移动到另一个电极。
在水平电泳过程中，由于分子的大小和电荷不同，它们将以不同的速度在凝胶中运动。
大分子移动缓慢，小分子移动快速。
这样，分子根据大小按照一定的顺序移动，导致它们在凝胶中排列成一条通常是呈斜角的直线。
这个方向通常被称为水平电泳通道。
第二步是垂直电泳。
在水平电泳结束后，垂直电场被施加在凝胶中，使分子以另一个方向移动。
这个方向通常被称为垂直电泳通道。
在垂直电泳过程中，分子将根据它们的电荷大小被拖曳向上（正电流）或向下（负电流）。
正电流将使分子向上移动，而负电流将使分子向下移动。
这样，分子将根据其电荷被分离并在凝胶中形成一条平行于水平电泳通道的直线。
最终，两个方向的电泳都完成后，在凝胶上会形成一个类似网格的结构，其中分子被分离成不同的带状。
这些带状物可以被染料或放射性示踪剂探测出来，从而确定分离出的分子的位置。
总结起来，双向电泳是一种利用两个方向的电场移动分子的方法。
通过水平电泳和垂直电泳，分子根据其大小和电荷被分离成不同的带状，从而实现复杂样品中蛋白质或核酸的分离和分析。
双向电泳技术手册之四胶蛋白质点的检测(考染和银染)
双向电泳技术手册之四:胶蛋白质点的检测(考染和银染)第四章2-DE 胶蛋白质点的检测2-DE 胶蛋白质点的检测方法大致有：1）考马斯亮兰染色法；2)银染法；3）负染法；4）荧光染色法；5 ）放射性同位素标记法等。
这几种检测方法的灵敏度各不相同。
目前最常用的是银染法和考染法。
由于银染的灵敏度是考染的50 倍，故一般用银染法进行分析处理，再用考染法来进行样品微量制备。
4.1考马斯亮兰染色:4.1.1经典的考马斯亮兰染色程序：1 固定20 % TCA 1h2 染色0.1% CBB in 40% EtOH/10% acetic acid 2h3 脱色40% EtOH&10% acetic acid 2x 30 min4 强化1% acetic acid overnight5 清洗deionized H2O 30 min局限：灵敏度低（≈1μg protein/spot）4.1.2 Neuhoff 胶体考染法：1 固定：12％（w/v）三氯醋酸（TCA）2h2 染色：200ml 染色液混合50ml 甲醇16-24h染色液：在490ml 含2％（w/v）的H3PO4中加50g (NH4)2SO4 直至完全溶解，再加0.5g CBB G-250（已溶于10mlH2O中），搅拌混合。
无需过滤，使用前摇匀。
3 漂洗：1）0.1mol/L Tris-H3PO4缓冲液（pH 6.5）漂洗两分钟；2）25％（v/v）甲醇漂洗不超过1min4 稳定：在20％的(NH4)2SO4中稳定蛋白质－染料复合物。
优点：背景低，灵敏度高，可达到200ng protein/spot.4.1.3 热考马斯亮兰染色及二次染色法：1 染色（0.025%(w/v) 考马斯亮兰R350）：将1 片Phast Gel Blue 药片溶入1.6L 10%醋酸，将染色液加热到90℃倒入凝胶染色盘，振荡10min；2 脱色：10%醋酸室温振荡脱色2h ，期间需多次更换脱色液，脱色液可通过铺有活性炭的滤纸层过滤回收；脱色液和染色液可重复使用。
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1.当你在首次对未知样品进实验时，建议你使用以下的样品溶液：将蛋白溶解在：·8M尿素，4%CHAPS, 60 mM DTT, 2% Pharmalyte 3-10, 0.002%溴酚蓝。
溶解大蛋白或疏水蛋白量更难溶的蛋白可以使用以下方法：·7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS, 60M DTT, 2% Pharmalyte pH 3-10, 0.002%溴酚蓝。
2.为了从蛋白含量很低并且含有大量干扰物质的组织（如植物组织）中制备样品，你可以使用以下推荐方法。
该方法产生的蛋白溶液中不包含盐，核酸及其它污染物。
·将组织在研钵中用液氮研碎。
将粉末悬浮在含有10%TCA，0.3%DTT的丙酮中。
在-18˚C 条件下过夜并离心。
用丙酮清洗沉淀，干燥沉淀并将沉淀溶于9M尿素，2%CHAPS,1%DTT,2% Pharmalyte 3-10(52,63)中。
3.等电聚焦在变性条件下进行，能产生高分辩率和高清晰度的结果。
利用尿素和去污剂的混合液，能达到完全的变性和溶解，确保各种蛋白质以单一形态存在，并且减少凝集和分子间的相互作用。
尿素（Urea）:使蛋白质溶解和变性，通常使用浓度为8mol/L，但为了使蛋白质完全溶解的需要，尿素的浓度往往增加到9或9.8mol/L。
CHAPS :促使疏水蛋白质溶解并减少蛋白质间的结合还原剂：打断二硫键使蛋白质完全展开，往往使用DTT或DTE载体两性电解质混合物：载体两性电解质的混合物在等电聚焦过程中不影响梯度，还能促进样品的溶解度，并且等电聚焦过程中在整个梯度范围内能产生更一致性的导电性。
经典的再水化液组成：8 M urea, 0.5% (w/v)CHAPS, 0.2%(w/v)DTT, 0.5% IPG缓冲液或Pharmalyte, 0.002%溴酚蓝。
***不要让干燥的IPG胶条在室温下存留时间超过10分钟，胶条会从空气中吸收水分，将IPG 胶条密封好在-20℃以下温度保存。
再水化至少需要十个小时。
矿物油加入：利用微量移液器从槽的一端逐滴加入，直至一半条胶被覆盖，然后从另一端逐滴加入，直至整条胶被覆盖。
****聚焦时间过长会发生过聚焦，导致产生水平的条纹,可以在双向电泳的最后结果中见到。
4.可选操作：加入分子量标准蛋白。
分子量标准蛋白溶液与等体积的1%琼脂糖溶液混合后，然后加入到等电聚焦上样滤纸片上能得到很好的效果。
终浓度为0.5%的琼脂糖会凝聚，在施加电压前可以防止标准蛋白的扩散。
其它可选的方法是，将标准蛋白以15-20 μl的体积加入到等电聚焦上样滤纸片上。
如要少加样量，将上样滤纸片切成更小的面积。
将上样滤纸片放在玻璃板上，将一定量的蛋白标准溶液加到上样滤纸片上。
然后用镊子将上样滤纸片放置在IPG胶条末端一侧的凝胶表面。
进行考马斯亮蓝染色标准溶液的各种蛋白成分必须含有200-1000 ng；而进行银染色必须在10-50 ng之间。
5.****上下电泳槽大概需要加多少电极缓冲液使上下电极与缓冲液相接触？问题可能原因解决方法开始电泳时无电流。
在上下电泳槽中缓冲液体积不够。
确保两个缓冲液储液槽盛有足够的SDS电泳缓冲液，使上下电极与缓冲液相接触。
第二向电泳分离速度太慢。
SDS电泳缓冲液制备不正确或溶解凝胶缓冲液制备不正确。
重新配制新鲜的溶液。
丙烯酰胺溶液储存时间太久。
配制新鲜的单体储存液。
染料前沿边缘向上弯曲（微笑样）凝胶没有正确降温。
在电泳过程中，用恒温循环水浴对凝胶进行冷却降温。
在底部储存槽中尽可能多地使用缓冲液。
电流强度或功率过大。
按表20推荐值限定电流或功率染料前沿向下弯（皱眉样）凝胶在垫片附近聚合不完全。
除去凝胶溶液中的气体或增加过硫酸铵和TEMED量的50%。
仪器安装不正确（SE600）。
确保密封管条没有收缩。
上部储液槽渗漏。
在上部储液槽中确保有足量的缓冲液。
第二向分离电流高、速度慢密封装置的槽未被胶模具或空白插板由于阴极或阳极缓冲液过量导致两种缓冲液混合确认12个插槽都被占满下槽不要超过建议体积(7.5 L)。
电泳单元完全装好后确认阳极液面没有超过密封装置。
如果多余的阳极缓冲液在上槽，需要排出。
确认阴极缓冲液的液面没有超过上槽角落的通气孔。
可通过在装胶前向下槽加入溴酚蓝染料来加入来检查上下槽的混合。
几滴1%溴酚蓝足够染阴极液染料前沿不规则。
凝胶聚合不均匀。
第二向上表面不平在放置IPG胶条时破坏了凝胶上表面凝胶与玻璃板之间存在气泡凝胶和玻璃板之间存在液体除去凝胶溶液中的气体或增加过硫酸铵和TEMED量的50%。
灌胶后立即用水饱和丁醇来覆盖凝胶表面在放置IPG胶条时小心不要损坏凝胶用滚子除去凝胶和玻璃板之间的气泡和多余的液体确认无可见的气泡，凝胶紧贴着玻璃板，不可移动凝胶一侧染料前沿明显向下弯曲凝胶与垫片之间的缝隙未被填充预制凝胶模具未正确合住在封IPG胶条时，确认密封液也封住凝胶与垫片之间的缝隙确认模具合闭正确，重新电泳2-D图像扭曲凝胶与玻璃板之间存在气泡凝胶与玻璃板之间存在液体第一向存在干扰性物质用滚子除去凝胶和玻璃板之间的气泡和多余的液体确认无可见的气泡，凝胶紧贴着玻璃板，不可移动样品中的干扰性物质会导致扭曲或IPG胶条局部肿胀，这些变化又会影响第二向。
改变样品制备方法限制污染物2-D图像垂直缺失IPG胶条和第二向凝胶上表面之间存在气泡确认IPG胶条和第二向凝胶上表面之间没有气泡垂直拖尾平衡液配制不正确蛋白从IPG胶条向第二向转移不充分平衡不够根据说明准备平衡液在转移步骤中采用低功率和低电流。
如果需要延长转移步骤时间延长平衡时间垂直出现双点或“重点”IPG胶条放置不正确确认IPG胶条的塑料支持膜紧贴着第二向胶的玻璃板高分子量蛋白损失平衡液准备不正确蛋白从IPG胶条向第二向转移不充分根据说明准备平衡液在转移步骤中采用低功率和低电流。
如果需要延长转移步骤时间干胶条的尖端是酸性端，应当正对着正极（+）。
6. 12.5%凝胶制备：丙烯酰胺16.7ml；分离胶缓冲液10ml ；10×SDS 400μl；无菌水12.8ml；10％过硫酸胺200μl；TEMED*13.3μl*在灌胶之前加入，药品配制：丙烯酰胺单体储液：丙烯酰胺60g甲叉双丙烯酰胺1.6g溶于无菌水中总体积200ml分离胶缓冲液：Trisbase181.5g 溶于750ml 无菌水中调PH8.8总体积1000ml10％SDS：SDS5g溶于无菌水中总体积50ml10％的过硫酸胺：0.1g溶于无菌水中总体积1mlSDS 电泳缓冲液：Trisbase15.1g甘胺酸72.1gSDS5g溶于无菌水中总体积5000ml封胶溶液：SDS电泳缓冲液100ml 琼脂糖0.5g溴酚蓝少许附：蛋白质含量测定的方法（Bradford 方法）7.植物组织蛋白质提取方法(summer)三氯醋酸—丙酮沉淀法（1）在液氮中研磨叶片（2）加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1 小时）弃上清。
（3）加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。
（4）上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。
（5）用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。
药品：提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。
这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！8.蛋白质样品制备秧苗蛋白质样品的提取按Davermal 等（1986）的方法进行。
100mg 材料剪碎后加入10mgPVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM 即0.07%β- 巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1 小时，4℃，15000 r/min 离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮（含10 mMβ-巯基乙醇），再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80%丙酮（含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
按每mg干粉加入20μl（可调）UKS液[9.5 M尿素，5mM 碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT（二硫苏糖醇），2% Ampholine （Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10），6% Triton X-100]，37℃育30min，（含有尿素的溶液加热温度不能超过30°）期间搅动几次，16000 r/min离心15 min28度（温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰），离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。
或者-70度保存9.双向电泳操作步骤及相关溶液配置一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二、实验步骤：1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液（1mg蛋白：100ul裂解液）振荡器上振荡10min 左右，共处理一个小时。
其中每隔10~15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，-80℃保存。
2. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解，测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul，5ul，10ul，15ul，20ul 的BSA 溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液（10μl上述用UKS液制得的蛋白质样品中加入40μl 水及50μl 20%三氯乙酸，冰浴30min后，4℃，4000 r/min离心15min，弃上清，再加入100μl冷丙酮，同上离心5min，弃上清，冻干沉淀，用100μl PBS溶液（磷酸盐缓冲液）复溶），再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80ul），然后，各管中分别加入4ml 的Bradford液（原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
（测量过程要在一个小时内完成）。
3. 双向电泳第一向——IEF（双向电泳中一律使用超纯水）3.1 水化液的制备称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后，加入8ul 0.05% 的溴酚兰，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer （pH 3-10）振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。