从土壤中分离分解纤维素的微生物
纤维素分解微生物的分离与鉴定
环境微生物技术实验总结报告一、国内外研究进展：①纤维素资源据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.8×1011 t，这些植物物质所含的能量相当于全球人类每年能量消耗量的20倍，食物中所含能量的200倍。
纤维素是构成植物细胞的基本成分，纤维素占全球植物总干重的30%一50%，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物，它存在于所有植物当中。
在生物界中，结合于有机体中的碳达27×1010t，在自然界有机体中构成纤维素的碳约占40%，据此估算，在植物界中纤维素的总量约达26.0×1010t，而且自然界中的植物原料是年复一年地不断生长和更新的，可以说，纤维素在自然界中是一种最丰富的可再生的有机资源。
纤维素是一种不能被大多数动植物直接利用的多糖物质。
但对人类来说只要能将其降解成小分子物质，纤维素就会成为一种有广阔应用前景的资源。
而且这种潜在的资源数量是惊人的，其中的大多数作为绿色植物的成分在维持生态平衡中起作用而不宜利用，但是仍有数量可观的纤维素由人类生活和生产产生，它们主要存在于农作物秸秆和城市垃圾之类的废弃物中。
灾荒或战乱造成的粮食危机依然是正存在的和潜在的威胁;随着全球经济的飞速发展，地球上石油、煤炭的储量正以惊人的速度减少，能源危机成了世界大多数国家所面临的一个严峻问题;由于对资源的破坏性开采和利用，人类赖以生存的环境正在不断地恶化，对可再生资源利用的研究与开发的可持续发展战略己在世界各国逐步展开。
如何处理和利用废弃纤维素将成为一个十分紧要的问题。
②农业废弃物资源的利用现状植物纤维素资源的开发利用对解决粮食和能源短缺以及环境污染问题有极其深远的意义。
我国的纤维素资源极为丰富，每年的农作物秸秆产量达5.7x107吨，约相当于北方草原年打草量的50倍。
但是，农作物秸秆产生数量多且产生时间集中(每年到收获季节农村就会有大量的秸秆产生)，而我国的农作物秸秆主要用于燃料、畜禽饲料与自然堆肥，不仅利用效率低，而且随着农村生活水平的提高，农作物秸秆成为农村固体废弃物的主要来源。
《课题3 分解纤维素的微生物的分离》导学案
《课题3 分解纤维素的微生物的分离》导学案【学习目标】1．简述纤维素酶的种类及作用；2．从土壤中分离出分解纤维素的微生物，了解这类微生物的应用；3．能掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术。
【学习重点】从土壤中分离分解纤维素的微生物。
【学习难点】从土壤中分离分解纤维素的微生物。
【预习指导】课前通过阅读教材、查阅教辅资料、交流，初步完成下列问题。
【学习过程】一、基础知识活动1：阅读P27“课题背景”和“纤维素与纤维素酶”，回答下列问题：1、纤维素是一种由 首尾相连而成的 化合物，是含量最丰富的多糖类物质。
纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生 。
2、 是自然界中纤维素含量最高的天然产物。
纤维素的分解需要在 酶的催化作用下完成，请完成下列过程：3、1个酶活力单位是指在温度为 ℃，其它反应条件最适宜情况下，在 min 内转化的底物所需要的酶量。
4、P27小实验：通过设置对照实验体会纤维素酶的作用。
分析课本是如何设置对照的？活动2：阅读P28“纤维素分解菌的筛选”，回答下列问题：1、筛选纤维素分解菌的方法是 。
该方法可以通过 反应直接筛选。
2、其原理是：刚果红可以与纤维素形成 ，当纤维素被 _分解后，红色复合物无法形成，出现以 为中心的 ，我们可以通过是否 来筛选纤维素分解菌。
二、实验设计实验方案流程图：活动3：阅读资料一 “土壤取样”，回答下列问题：土壤取样：纤维素分解菌大多分布在 的环境中。
若找不到合适环境，可将滤纸埋在土壤中一个月左右，也会有能分解纤维素的微生物生长。
〖思考1〗为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？〖思考2〗将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？活动4：阅读资料二“选择培养”，回答下列问题：1、目的：增加纤维素分解菌的，确保能够从样品中分离到所需要的微生物。
2、操作方法：将土样加入装有30ml 的锥形瓶中，将锥形瓶固定在上，在一定温度下 1～2d，直至培养液变浑浊，也可重复选择培养。
实验设计1：从土壤中分离纤维素分解菌
《从土壤中分离纤维素分解菌》实验设计一、器材250 mL锥形瓶、无菌称量瓶、1 mL和10 mL的移液管、天平、摇床、温度计、纱布、摇床、试管、移液枪、无菌培养皿（15个）、涂布器、1 mL移液管，装有9mL无菌水的20 mL大试管（3个），温箱二、操作步骤1.土样采集及制备土壤悬液土样的采集要选择富含纤维素的环境（铲去表层土距地表约3-8cm的土壤层），这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。
如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。
称取土样5 g，迅速倒入45 mL无菌水瓶中，振荡20 min，使土样充分打散，即成为土壤悬液2.选择培养选择培养需要的仪器有：250 mL锥形瓶、无菌称量瓶、1 mL和10 mL的移液管、天平、摇床、温度计、纱布、摇床、试管、移液枪等。
选择培养基的制备比例见下：在250 mL锥形瓶中装入50 mL培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸（或报纸），用线绳扎紧，在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。
选择培养的操作：取10mL土壤悬液放于盛有50mL培养基的锥形瓶中，将锥形瓶置于摇床上，在30 ℃下振荡培养1～2 d，至培养基变混浊。
此时可以吸取mL培养液进行梯度稀释和涂布平板。
梯度稀释：用量程为1000µL的移液管从富集培养土壤液中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀。
然后换枪头从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml 无菌水的试管中混合均匀，以此类推制成10-1,10-2,10-3,10-4, 10-5,10-6,10-7不同稀释度的土壤溶液。
3.刚果红染色法分离纤维素分解菌这一步所需要的仪器有：无菌培养皿（15个）、涂布器、1 mL 移液管，装有9mL无菌水的20 mL大试管（3个），温箱等。
鉴别培养基成分如下：在500 mL三角瓶中装入200 mL培养基，在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。
2019学年第二学期高二生物专题2《分解纤维素的微生物的分离》学案含答案
分解纤维素的微生物的分离学习目标1.掌握纤维素酶的种类和作用及纤维素分解菌的筛选方法。
2.理解并掌握纤维素分解菌的筛选过程及刚果红染色法的原理。
3.掌握纤维素酶的测定方法。
一、纤维素分解菌的筛选1．纤维素与纤维素酶(1)纤维素①基本组成单位：葡萄糖。
②分布：主要分布在植物根、茎、叶等器官中。
特别提醒纤维素的分布、主要性质和作用(2)纤维素酶 ①组成：是一种复合酶，至少包括三种组分，即C 1酶、C X 酶、葡萄糖苷酶。
②作用：纤维素―――――――→C 1酶和C X 酶纤维二糖―――――――→葡萄糖苷酶葡萄糖特别提醒除自然环境中存在的分解纤维素的微生物外，在草食性动物牛、马、羊等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其可产生纤维素酶分解纤维素，而人体没有分解纤维素的能力。
2．纤维素分解菌的筛选(1)方法：刚果红染色法。
①方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。
②方法二：在倒平板时就加入刚果红。
特别提醒方法一需要用NaCl溶液洗去培养基表面浮色后，再进行观察，方法二不需要。
(2)原理纤维素＋刚果红→红色复合物↓纤维素酶纤维二糖和葡萄糖，不能和刚果红形成红色复合物↓以纤维素分解菌为中心的透明圈1．如何设计实验证明纤维素酶能分解纤维素？提示设计对照实验。
取两支试管，分别加入等量的滤纸条和缓冲液，在一支试管中加入纤维素酶，另一支试管中加入等量蒸馏水，振荡反应一段时间后，可观察到加入纤维素酶的试管中滤纸条被水解，而加入蒸馏水的试管中滤纸条没有变化。
2．两种刚果红染色法中哪种染色法更容易区分纤维素分解菌和其他杂菌？提示方法一更容易区分纤维素分解菌和其他杂菌。
即先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，所显示的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。
方法二中有些微生物具有降解色素的能力，它们在生长过程中会降解刚果红，也会使培养基上形成透明圈，与纤维素分解菌不易区分。
1．下列关于纤维素酶的叙述中，错误的是()A．纤维素酶只有一种，只能将纤维素分解为葡萄糖B．纤维素酶是一种复合酶，至少包括C1酶、C X酶和葡萄糖苷酶三种组分C．纤维素可被纤维素酶水解成葡萄糖，为微生物提供营养物质D．分解纤维素的细菌、真菌和放线菌，都是通过产生纤维素酶来分解纤维素的答案 A解析纤维素酶是一种复合酶，一般认为至少包括三种组分——C1酶、C X酶和葡萄糖苷酶，其中C1酶和C X酶将纤维素分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解为葡萄糖。
人教版 高中生物 选修一 专题二 课题3 分解纤维素的微生物的分离
【情景创设】纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，大量存在于植物的根茎叶等器官中。
地球上40%-60%的纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。
人们要想利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等，就需要对这些微生物进行研究与应用，而要研究这些微生物，首先要将它们从土壤中种类众多的微生物中分离出来。
本课题中，我们就将探讨如何分离土壤中能够分解纤维素的微生物。
【问题设计】1、回顾纤维素的相关知识，说说纤维素酶的组成及作用。
2、筛选纤维素分解菌的原理是什么？3、说说分离分解纤维素的微生物的实验流程，回答P28旁栏思考1.4、简述采集土样的要求，回答P28旁栏思考2、3。
5、如何进行选择培养？结合P29“操作提示（二）”回答楷体字“资料二”相关问题及右栏思考2.6、常用的刚果红染色法有哪些？回答右栏思考1。
【达标检测】（必做）1. 纤维素酶能够分解（ ）A ．纤维素的微生物B ．淀粉的微生物C ．纤维素D ．淀粉2. 刚果红能与哪项物质形成红色复合物( )A ．纤维二糖B ．纤维素C ．葡萄糖D ．麦芽糖3. 寻找纤维素分解菌应到…（ ）A ．湿润的环境中B ．富含纤维素的环境中C ．富含无机盐的环境中D ．池塘中4. 纤维素分解菌的选择培养基有选择作用，原因在于其含有…( )A ． NaNO3B ．KClC ．酵母膏D ．纤维素粉5. 下列哪种生物能产生纤维素酶( )A.纤维素分解菌 B ．牛 C ．羊 D ．兔【使用时间】 第 3 周 第 2 课时 【编辑】李玲珍 刘萍萍 【审核】刘萍萍 【主题】 专题二 课题3 分解纤维素的微生物的分离 2012.02.256.刚果红染色时，加入刚果红可在……( )①制备培养基时②梯度稀释时③倒平板时④涂布时⑤培养基上长出菌落时A．①③ B．②⑤ C．③⑤ D．④⑤7.两种刚果红染色法的结果是（）A．均会出现透明圈 B均不会出现透明圈C方法一出现方法二不出现 D方法一不出现方法二出(选做)有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些微生物的研究，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。
专题2课题3分解纤维素的微生物的分离
(3)某些商品纤维素 ①水溶性的羧甲基纤维素钠(CMCNa)； ②不溶于水的微晶纤维素(Avicel)。 2．纤维素酶 复合酶 ，包括三种组 (1) 组成：纤维素酶是一种 _________ 葡萄糖苷酶 分，即C1酶、Cx酶、________________ 。 (2)作用：C1酶和Cx酶使纤维素分解成_________ 纤维二糖 ； 葡萄糖苷酶 将纤维二糖分解为葡萄糖。 _____________ 二、纤维素分解菌的筛选 1．方法：刚果红染色法，常用的有两种：一种是 微生物，再加入刚果红进行___________ 颜色反应 ， 先培养______ 另一种是在倒平板时就加入刚果红。
关于分解纤维素的细菌的分离和纯
)
化操作的叙述中，下列正确的是(多选)(
A．在地表下面10米深处的土壤中取样
B．要用只含有纤维素有机营养的选择液体培养
基进行选择培养
C．要用酚红培养基进行进一步鉴定
D．要进行稀释涂布平板法进行接种
解析：选 BD。从土壤中分离纤维素分解菌时， 取的土样要在枯枝败叶比较多的地方，并且要 取土壤 3 ～ 8 厘米深的表层土，太深的土壤中纤 维素很少，细菌数量也很少；而用含有纤维素 的液体培养基培养的目的是使得纤维素分解菌 被选择出来并加以“浓缩”；为了进一步分离 纯化细菌，就要进行稀释涂布接种，以得到单 个细菌长出来的菌落；最后纤维素分解菌的进 一步鉴定用的是发酵产纤维素酶的实验，酚红 培养基是用来进行尿素分解菌的鉴定。
成分
含量
纤维素粉
NaNO3
5g
1g
Na2HPO4· 7H2O
KH2PO4
1.2g
0.9g
MgSO4· 7H2O
KCl
0.5g
0.5g
高中生物 第二章 分解纤维素的微生物的分离 2.3 分解纤维素的微生物的分离(测)(基础版,含解析)
2.3 分解纤维素的微生物的分离（测）（满分60分，40分钟完成）一、单选题（30分，每题3分）1. 下列关于纤维素酶的说法，错误的是（）A．纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种组分B．葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖C．纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D．纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖【答案】B2. 在将样品稀释液涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上之前，先进行选择培养的目的是（）A．完全除去其他微生物B．证明纤维素分解菌的存在C．增加纤维素分解菌的浓度D．使纤维素分解菌充分长大【答案】C【解析】通过选择培养可以增加纤维素分解菌的浓度,以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。
故C正确。
3.下列关于纤维素分解菌分离实验的说法不正确的是（）A．通常采用刚果红染色法筛选纤维素分解菌B．当纤维素被纤维素分解菌释放的纤维素酶分解后，培养基中会出现透明圈C．该实验用的培养基为选择培养基D．在用刚果红染色时只能先培养微生物再加入刚果红，不能在倒平板时加入【答案】D【解析】刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，所以可采用刚果红染色法筛选纤维素分解菌，A项正确；当纤维素被纤维素分解菌分泌的纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的红色复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，B项正确；用选择培养基筛选纤维素分解菌，C项正确；常用的刚果红染色法有两种：一是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，二是在倒平板时就加入刚果红，D项错误。
4.分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误的是（）A．经选择培养后即可将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上B．选择培养这一步可省略，但纤维素分解菌少C．经稀释培养后，用刚果红染色D．此实验中需设置对照组【答案】A5.为了解土壤微生物是否能分解农药，并尽快得出实验结论，有人用“敌草隆”（一种除草剂）进行了实验，取等量砂土分装于相同的两容器中，a组高压灭菌，b组不灭菌，下列有关事项肯定错误的是（）A.a组为实验组，b组为对照组B.向a、b中喷入等量敌草隆，再置于同一温箱中培养相同时间C.检测敌草隆消失的情况，预计a组敌草隆含量不变，b组敌草隆全部分解D.只用砂土，实验效果不如几种典型土壤混合后的好【答案】C【解析】A、由题意可知，a组高压灭菌，没有微生物，b组不灭菌，存在土壤微生物，所以a组为实验组，b组为对照组，A正确；B、由题意可知，实验的自变量的有无土壤微生物，敌草隆的使用量、培养条件是无关变量，应保持一致且适宜，所以向a、b中喷入等量敌草隆，再置于同一温箱中培养相同时间，B正确；C、b组的敌草隆不可能全部分解，C错误；D、不同的土壤微生物的种类不同，只用砂土，实验效果不如几种典型土壤混合后的好，D正确．6.欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌，下列实验操作中不正确的是（）A.将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释B.同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板C.可将未接种的培养基在相同条件下培养作为对照D.用加入刚果红指示剂的培养基可筛选出分解尿素的细菌【答案】D【解析】A、为防止土壤浸出液浓度过高，不能获得单菌落，要将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释，A正确；B、同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板，防止偶然因素对实验结果的影响，B正确；C、可以将未接种的培养基在相同条件下培养作为对照，以判断培养基灭菌是否彻底，C正确；D、可筛选出分解尿素的细菌的培养基是以尿素为唯一氮源的选择培养基，D错误．7.下列关于纤维素分解菌分离实验的说法不正确的是( )A．通常采用刚果红染色法筛选纤维素分解菌B．从土壤中分离含量较多的微生物时，选择培养可以省略C．该实验用到选择和鉴别培养基D．在用刚果红染色法中，若将微生物培养在事先加入刚果红的培养基上，出现透明圈的菌落即所需菌种【答案】D8.利用农作物秸秆等纤维质原料生产的乙醇，经加工可制成燃料乙醇，从而减少了对石油资源的依赖，下图为生产燃料乙醇的简要流程，据图分析错误的一项是( )A．要得到微生物A，最好选择富含纤维素的土壤采集土样B．图中②过程常用的微生物B是酵母菌C．微生物A和微生物B可利用的碳源相同D．可用纤维素酶制剂代替微生物A起作用【答案】C【解析】根据图解可知，微生物A的碳源是纤维素，故要想获得微生物A最好选择富含纤维素的土壤采集，A项正确；图中②过程表示生产乙醇的过程，常用微生物是酵母菌，B项正确；微生物A所用碳源为纤维素，微生物B所用碳源为纤维素降解物，C项错误；微生物A之所以能利用纤维质原料是因为其含有纤维素酶，故可用纤维素酶制剂代替微生物A起作用，D项正确。
纤维素分解微生物的分离和筛选方法
纤维素分解微生物的分离和筛选方法纤维素是植物细胞壁的主要成分之一，具有广泛的应用前景。
然而，纤维素的分解一直是科学家们面临的难题之一。
为了解决这一难题，研究人员们积极寻找能够高效分解纤维素的微生物，以进一步开发出高效纤维素降解酶，促进生物能源和生物材料的开发利用。
本文将介绍纤维素分解微生物的分离和筛选方法。
一、样品来源和处理为了获得纤维素分解微生物，首先需要合理选择样品来源。
常见的样品来源包括土壤、沉积物、动物肠道、植物中等。
样品应进行一系列处理，如样品的收集与保存、溶液的筛选和分离、菌液的扩培等。
样品的收集和保存要注意避免样品受到污染和降解。
溶液的筛选和分离可以通过稀释液、过滤和分离培养等方法进行。
二、培养基的选择正确选择适宜的培养基对于纤维素分解微生物的分离和筛选至关重要。
纤维素分解微生物主要是厌氧和好氧微生物，因此可以根据纤维素的性质选择合适的培养基。
常用的培养基有液态和固态培养基，可以根据具体实验需求选择合适的培养基成分，如添加纤维素、蛋白质、矿物质等。
三、分离和筛选方法1. 纤维素分解菌的分离方法（1）稀释涂布法：将样品溶液稀释至适宜浓度，利用稀释液进行涂布培养，然后观察并选取纤维素分解环带较纯的菌落进行分离。
（2）筛选法：将样品溶液通过滤膜进行过滤，得到含有微生物的滤饼，然后将滤饼均匀涂布在含纤维素的固体培养基上进行培养。
（3）玻璃珠破碎法：将样品溶液与玻璃珠混合后进行振荡或超声破碎，使微生物从样品中释放出来，然后以相同的方式将混合液稀释后通过涂布的方式进行培养。
2. 微生物纤维素分解能力的筛选方法（1）纤维素降解活性测定：通过检测微生物降解纤维素后所产生的还原糖、酸、乙醇等物质的产量来评估微生物的纤维素降解能力。
（2）纤维素酶活性测定：利用酶学方法检测微生物分泌的纤维素酶的活性，包括纤维素酶活力、纤维素酶种类及其酶解产物等。
四、分离菌株的鉴定和特性分析通过形态学、生理生化特性以及分子生物学方法，对纤维素分解微生物进行进一步的鉴定和特性分析。
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从土壤中分离分解纤维素的微生物
实验目的
1、利用特定的选择培养基和鉴定培养基从土壤中分离分解纤维素的微生物；
2、掌握刚果红染色的机理和操作。
实验原理
1、以纤维素喂唯一碳源的选择培养基能选择分离分解纤维素的微生物；
2、刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，而不与水解后的纤维二塘和葡萄糖发生这种反应。
实验仪器与用具
除实验五中用到的外，还需要恒温振荡培养箱
实验材料和试剂
取自湿地或原生林地的土样（大于20g）
羧甲基纤维素钠，酵母粉，磷酸二氢钾，蛋白胨，琼脂粉，氯化钠，刚果红，硝酸钠，硫酸亚铁，硫酸镁，磷酸氢二钠，纤维素粉，蔗糖（也可以用廉价的秸秆磨成粉末代替纤维素粉）
实验步骤
将称量好的0.1g蔗糖，0.002g硫酸亚铁，0.1g硫酸镁，0.2g磷酸氢二钠，0.2g硝酸钠，2g纤维素粉（秸秆粉）倒入500ml锥形瓶内，再加入200ml蒸馏水，给锥形瓶封口，充分振荡摇匀，得选择培养基，备用。
讲称量好的1.5g羧甲基纤维素钠，0.2g蛋白胨，0.1g酵母粉，0.25g 氯化钠，0.2g磷酸二氢钾，0.1g硫酸镁，4g琼脂粉加入另一个500ml 锥形瓶内，再加入200ml蒸馏水，给锥形瓶封口，充分振荡摇匀，得鉴定培养基，备用。
用5ml微量可调移液器向编号为1--5号的试管内分别加入9ml蒸馏水，塞上棉塞，备用。
讲配制好的选择培养基，鉴定培养基，5支装有蒸馏水的试管，包好的培养皿（最少9个），枪头放入灭菌锅内在121度下灭菌20min。
灭菌后，取出灭菌锅内物品，放入超净台内，用酒精棉球擦拭超净台面和实验者的双手，点燃酒精灯，在酒精灯火焰附近将称量好的20g 土样加入到选择培养基中，给锥形瓶封口，充分振荡摇匀。
将选择培养基放入恒温振荡培养箱内培养48h（震动培养箱转速为200r/min，控制温度为30度）。
等鉴定培养基冷却到不烫手时，在超净台内酒精灯火焰附近往每个培养皿内倒入20ml左右鉴定培养基，在超净台面轻轻摇匀，熄灭酒精灯，等培养基凝固后，将培养基平板倒置于超净台上。
48h后从恒温振荡培养箱中取出选择培养基，置于超净台上点燃酒精灯，再用1ml微量可调移液器移取1ml选择培养基的菌液到1号试管内，得到稀释10-1的稀释液，并用此方法依次稀释10倍，在5号试管内得到10-5的菌液稀释液，再用1ml微量可调移液器移取3号试管中的菌液，滴加2滴到平板上，用涂布器在平板上均匀涂布（注意
涂布器要灼烧一下），依照此方法同样将4号5号试管内的菌液涂布到培养皿中，不同菌液每个涂2--3个平板，将涂布好的平板倒置放入恒温培养箱内，30度培养1--2d,1-2d后取出恒温培养箱内的平板。
用100ml容量瓶配制1mol/L氯化钠溶液和1mg/ml的刚果红溶液，（注意刚果红溶液要现配现用）。
解开培养好的培养皿的上盖，滴入2滴管左右的刚果红溶液，轻轻摇晃平板，使溶液均匀涂在培养基上，盖上平板盖染色10min，染色后倒去刚果红溶液，向平板中加入2滴管左右氯化钠溶液，轻轻摇晃平板，使溶液均匀涂在培养基上，盖上平板盖，浸泡15min，15min后倒去氯化钠溶液，这时可以从培养基上长了菌落的周围看到明显的透明菌圈。