SOD和POD酶活性的变化

（四）果肉硬度：用硬度计测量 水果硬度计（又称果实硬度计或果品硬度计），用来测量苹 果、梨、西瓜、香蕉等多种水果的硬度，用以判定水果的成 熟程度，对培育良种，采摘时间，加工时间，收获储存，出 口运输等采摘的合理掌握。 设计原理：果实硬度是指水果单位面积（S）承受测力弹簧 的压力（N），它们的比值定义为果实硬度（P）。 使用方法：测量前转动表盘，使驱动指针与表盘的第一条刻 度线对齐（GY-1型的为刻度线2，GY-2和GY-3型的为刻度线 0.5）；将待测水果削去1平方厘米左右的皮。用手握硬度计， 使硬度计垂直于被测水果表面，压头均匀压入水果内，此时 驱动指针开始驱动指示指针旋转，当压头压到刻度线（10毫 米）处停止，指示指针指示的读数即为水果的硬度，取三次 平均值。测量后旋转回零旋钮，使指针复位到初始刻度线。
仁果类 --
二、测定方法 氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）
【实验原理】 SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和 Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应：
由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为 间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能 产生超氧自由基负离子O2.－ ，当加入氮蓝四唑(NBT) 后，在光照条件下，与 超氧自由基反应生成单甲月替 （ 黄 色 ） ，继而还原生成二甲月替 ，它 是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧 自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二 甲月替 生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定 时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活 性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。
【注意事项】 1. 酶液提取须在4℃下进行，提取后立即进行测定， 冰箱中放几小时活性也会下降； 2. NBT反应液配好后过滤除去不溶物立即使用，若 置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。 3. 加反应液时最好在暗光下进行；
4. 核黄素产生O2.－ ，NBT还原为篮甲潛都与光照密切相关， 照光强度和时间要严格控制。光照培养箱内壁裱糊锡箔纸， 使箱内均匀光照约达40μmolm-2s-1，同时使照光时间一样，选 择试管尽量一致，照光结束后测一个拿一个（最好晚上做） （温度高时照光时间缩短，温度低时延长）； 5. 测定活性时加入的酶量，以能抑制反应的50％为佳。（一 个酶单位相当于引起反应液达到半抑制时酶的用量，即以能 抑制反应50％的酶量为一个SOD酶活性单位。） （反应液中加酶液与PBS调零差异不大，反应液调零与其它 两个则有一定差异。李合生方法：2支CK管均以缓冲液代替 酶液。） 6. 测定数值应在0.3—0.8之间。
三、试剂
1. 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：
A母液:0.2mol/LNa2HPO4溶液（mL）；
B母液:0.2mol/LNaH2PO4溶液（mL）； 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：91.5A: 8.5B，稀释
2. 14.5mM甲硫氨酸溶液：称取0.217g Met用磷酸缓 冲液（pH7.8）定容至100ml。 3. 3mM EDTA-Na2溶液：称取0.1117g EDTA-Na2用 磷酸缓冲液定容至100ml。 4. 60μM核黄素溶液：称取0.0023g 核黄素用磷酸缓 冲液定容至100ml，避光保存。 5. 2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：称取0.055g NBT 用PBS定容至3ml（直接用5 ml枪加，不用定容）， 避光保存。
2. 酶活性测定 （1）反应混合液配制(以30个样为准)：分别取配好的Met溶 液81ml，EDTA-Na2溶液3ml， NBT溶液3ml，核黄素溶液 3ml，混合后充分摇匀，放入棕色瓶中，存于冰箱中备用。 （2）分别取3ml反应混合液和100μl（可视情况调整）酶液于 指形管中此即反应管；同时做两支对照管，其中1支试管加 3ml反应混合液和100μl PBS（不加酶液）作为最大光还原管， 另1支加3ml反应混合液和100μl PBS同时用锡箔纸包好遮光用 于测定时调零。 （3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照25℃下反应 20min； （4）反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在 560nm下的吸光度（OD560）
（五）果形指数 是指果实纵径与横径的比值。以苹果为例，通常果形指数是 0．8－0．9为圆形或近圆形，0．8－0．6为扁圆形，0．9－ 1．0为椭圆形或圆锥形，1．0以上为长圆形。 表1产品器官基本特征
种类 苹果 产品器 果实构 官类别 造类型 果实 可溶性 果肉 果实重 固形物 量(g) 硬度 含量 --果形 指数 -风味 特点 外观 颜色
愈创木酚过氧化物酶（POD）活性的测定 ----愈创木酚法
【实验原理】
在过氧化物酶催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产
物。此产物在470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm 下吸光值变化测定过氧化物酶活性。
【试剂】 0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)的配制： A母液:0.2mol/LNa2HPO4溶液250mL； B母液:0.2mol/LNaH2PO4溶液250mL；
【实验步骤】 1. 酶液提取 称取0.1g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根 系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入 1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷 的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆， 转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清 液即为SOD粗提液。
分别取A母液(Na2HPO4 )12.3ml和B母液(NaH2PO4 )
87.7ml混匀即为100ml PBS(0.2M，pH6.0)； 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：91.5A母液: 8.5B母液， 稀释
【实验步骤】 1. 酶液提取 ：称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或 根系）洗净后置于预冷的研钵中，分两次加入1.6ml （0.8 ml、 0.8 ml）0.05mol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研 磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心15min，上清 液即为POD粗提液。 2. 酶活性测定 （1）反应混合液的配制：取100mlPBS（pH6.0，0.2M）缓 冲液于烧杯中，加入0.037ml愈创木酚（2-甲氧基酚）于磁力 搅拌器上加热搅拌，直至溶解愈创木酚溶解，待溶液冷却后 加入0.056ml30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。 （2）酶活性测定：取3ml反应液并加入40μl酶液后测定 OD470值在40秒的变化。以PBS代替酶液为对照调零，
3. 计算结果
已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活 单位（U），按下式计算活性 SOD总活性＝ [( Ack-AE )×V]/（1/2Ack×W×Vt） SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量 SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单 位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度； AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测 定时的酶液用量（ml）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含 量单位为mg/g。
实验一、超氧化物岐化酶（SOD）对逆境的响应
一、目的和要求
植物在生命过程中不断产生活性氧，但同时又形成了一个完 善的清除活性氧的防御系统，即酶促系统与非酶促系统，使植 物体内活性氧的产生与清除之间维持在一个动态平衡状态。当 植物受到胁迫时，这种平衡将可能被破坏，随着胁迫时间的延 长和胁迫程度的加重，活性氧清除系统的功能逐渐降低，活性 氧积累得越来越多，最终使细胞膜发生膜质过氧化并发生自由 基链式反应，形成丙二醛（MDA），使细胞膜流动性下降，膜 功能受到伤害。活性氧酶促清除系统主要有超氧化物歧化酶 （SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏 血酸过氧化物酶（AsAPOD）等，这些酶活性的高低可在不同 程度上反应植物抗性的强弱。本试验通过测定正常生长与逆境 下植株超氧化物歧化酶( SOD) 、过氧化物酶(POD)活性，了解 逆境下SOD和POD酶响应的机制。
3. 计算结果
以每min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。 按下式计算活性 POD活性=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g FW) ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)； t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测 定时取用酶液体积（ml）。
（二）产品器官特征观察 1．作物产品器官特征观察 根据作业中表1的内容要求，对产品器官特征进行观 察，并填写表1中内容。
（三）可溶性固型物含量：用糖度计测量 原理：光线从一种介质进入另一种介质时会产生折射现 象，且入射角正弦之比恒为定值，此比值称为折光率。 果蔬汁液中可溶性固形物含量与折光率在一定条件下 （同一温度、压力）成正比例，故测定果蔬汁液的折光 率，可求出果蔬汁液的浓度（含糖量的多少）。常用仪 器是手持式折光仪，也称糖镜、手持式糖度计，通过测 定果蔬可溶性固形物含量（含糖量），可了解果蔬的品 质，大约估计果实的成熟度。 使用方法：手持糖度计一般是圆柱形的，将待测的糖液 放入后面可打开的槽中，抹均匀，关上盖子，然后将糖 度计对着光，从前面的孔中看，就可以读数了。
【注意事项】 1. 反应液配制时由于愈创木酚难溶，应加热一段时间。加 入H2O2前注意溶液冷却，防止H2O2的挥发。 2. 由于该反应迅速，加入酶液要立即进行吸光值的测定。
三、作业 比较不同处理下叶片SOD和POD酶要果树和蔬菜作物产品器官的识别与 品质指标测定 一、目的和要求 园艺作物产品器官通常是指作为商品收获的植物器官。除了 特殊需求，对于果树作物，产品器官为可供食用的果实或种 子；对于蔬菜作物，产品器官可以是花、果实、种子等生殖 器官，也可以是根、茎、叶等营养器官及其变态类型；而花 卉的产品器官则是可供欣赏的花、茎、叶和果等。本实验通 过对主要果树和蔬菜作物产品的观察，了解主要蔬菜作物产 品器官的形态特征、内部构造和风味特点，能够通过产品器 官特征区分不同种类的果树和蔬菜作物。