建立改良型人NK细胞体外扩增技术_李亚芬

免疫学杂志 2015 年 3 月 第 31 卷 第 3 期 IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol. 31 No. 3 Mar. 20成熟[8]，所以 本 研究在稳 定表达 IL-15 和 CD137L 的 pAPC 细胞上 同时表达了 IL-21 分子（图 1），经 γ 射线照射后作为 刺激细胞，对其在 NK 细胞扩增中的作用进行了研究。
率高达 85.2%。 结论 pAPC-mbIL-21 工程细胞联合 IL-2 能够在体外高效的扩增出具有较高杀伤活性的 NK 细胞， 可以为 NK 细
胞免疫治疗奠定基础。
[关键词] NK 细胞；体外扩增；pAPC-mbIL-21；免疫治疗
[中图分类号] R392.12
[文献标识码] A
Construction of an improved method for human NK cell expansion in vitro
[Abstract] This study is to establish an improved approach of human NK cell ex vivo expansion. The peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 4 healthy donors were isolated and stimulated with pAPC-mbIL21 (PersonGen artificial antigen presenting cells-mbIL-21) and IL-2 simultaneously. Proliferated cells were counted and the NK cell phenotype was determined by flow cytometry analysis. Then the cytotoxicity of expanded NK cells to K562 and RPMI -8226 was examined by CFSE/7 -AAD assay. After culturing for 3 weeks, NK cells were significantly amplified and the average multiples were 409.4. The purity of CD3 -CD56 + cells was 95.86% , meanwhile the cytotoxic activity to K562 was 85.2% . Therefore, we conclude that the established method is an efficient approach for NK cell expansion ex vivo; the NK cells expanded show high cytotoxicity and could lay foundation for NK cell immunotherapy.
[Key words] NK cell; Expansion in vitro; pAPC-mbIL-21; Immunotherapy
NK 细胞又称为自然杀伤细胞，属于大颗粒淋巴 细胞，来源于骨髓，占外周血淋巴细胞的 5%~15%，是 重要的免疫细胞。 科学家在 1975 年首次 鉴定到了 NK 细胞，这类细胞能够在缺少 T、B 细胞的情况下直 接杀伤肿瘤细胞[1-4]。 与具有细胞毒性的 CD8+T 细胞 不同，NK 细胞杀伤肿瘤细胞时不需要预先致敏就可 以直接杀伤 MHC 阴性的肿瘤细胞[5]，这使得 NK 细胞
排除死细胞影响。每一样本重复计数 3 次，取其平均 值。 用流式检测 NK 细胞纯度，进而计算 NK 细胞绝 对数目。 1.6 细 胞 免 疫 表 型 分 析 在 第 0 天 分 离 PBMC， 第 7、14、21 天扩增 NK 细胞后以流式细胞仪检测 NK 细 胞 亚 群 比 例 ，每 个 流 式 管 收 集 1×106 个 细 胞 ，应 用 CD3-FITC、CD56-APC 对所取的 NK 细胞进行染色。 用 Cellquest 软件对 CD3-CD56+细胞表型比例进行分 析，每 份样本检测 均设定获取 10 000 个细胞，检 测 NK 细胞纯度。 1.7 NK 细 胞 对 K562 细 胞 杀 伤 活 性 测 定 将 用 CFSE 染色过的肿瘤细胞按照 4×105/孔接种至 24 孔 板中，按照效靶比 5∶2 和 5∶1 接种扩增后获得的 NK 细 胞 ， 加 入 常 规 细 胞 培 养 液 （RPMI1640+10%FBS） 至 2 ml 后，于 37 ℃、5％ CO2 培养箱孵育 4 h 后收集细 胞，用 7-AAD 荧光染色死细胞，用流式细胞仪分 析 CFSE/7-AAD 荧光强度，计算扩增得到的 NK 细胞对 肿瘤细胞的杀伤效率。 特异性细胞毒百分率=[实验组 靶细胞死亡率-靶细胞自然死亡率]/[100-靶细胞自然 死亡率]×100%。 1.8 统计学分析 采用 GraphPad Prism 5 统计分析软 件对数据进行统计分析。
2 结果
2.1 pAPC-mbIL-21 细 胞 pAPC 细 胞 是 1 种 经 过 设计将 CD137L 和 IL-15 基因导入细胞，使其在细胞 膜上稳定表达 CD137L 和 IL-15 分子的工程细胞，由 博 生 吉 公 司 构 建 和 提 供 。 pAPC - mbIL - 21 （ pAPC - membrane binding IL-21） 是利用慢病毒将 IL-21 分子表达在 pAPC 细胞膜上（图 2），左图为同 型对照。 γ射线照射过的 pAPC-mbIL-21 细胞用于刺 激 NK 细胞扩增。 辐照过的细胞在 3～6 d 保持细胞原 有形状，与 PBMC 混合培养后，照射细胞会在 6～7 d 破碎并被吞噬干净。
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免疫学杂志 2015 年 3 月 第 31 卷 第 3 期 IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol. 31 No. 3 Mar. 2015
·论 著·
[文章编号]1000-8861（2015）03-0250-05； [DOI]10.13431/ki.immunol.j.20150053
在过继细胞免疫治疗中被广泛应用。 但 NK 细胞在外 周血淋巴细胞中所占的比例较低，所以有必要建立一 种 NK 细胞体外扩增技术，用于研究 NK 细胞的功能 并为肿瘤的细胞免疫治疗奠定基础。
传统的 NK 细胞扩增技术是在 NK 细胞培养体 系中添加 IL-2、IL-15 等细胞因子以促进 NK 细胞增 殖[6]，但 由 于 扩 增 效 率 不 高 且 纯 度 不 够 未 能 得 到 广 泛 应用。 近年来，有人采用基因工程的方法在 K562 细 胞上同时表达 IL-15、CD137L 等分子，并以此细胞来 刺激 NK 细胞的增殖[7]。 IL-15 和 CD137L 联合刺激是 PBMC 中 NK 细胞特异性扩增的基础：作为膜蛋白， 通 过 细 胞 间 的 接 触 刺 激 ，用 以 诱 导 NK 细 胞 扩 增 。 IL-15 能够促进 NK 细胞的分化成熟， 而 IL-21 能够
扩增倍数和 NK 细胞纯度，并采用 CFSE/7-AAD 法对肿瘤细胞 K562 和 RPMI-8226 进行细胞毒性实验检测杀伤效率。 结果 经过
21 d 的刺激培养，NK 细胞平均扩增至 409.4 倍，细胞纯度最高可达 95.86%。 杀伤实验结果显示，扩增的 NK 细胞对 K562 细胞杀伤
LI Yafen1, ZHOU Ruyuan1, MENG Huimin1, AN Gangli1, ZONG Yunhui2, 3, YOU Fengtao2, 3, ZHANG Bozhen2, 3, YANG Lin1, 2, * 1. Cyrus Tang Hematology Center & Innovation Center of Hematology, Soochow University, Suzhou 215123, China; 2. Suzhou Cancer Immunotherapy -Diagnosis and Nanomedicine Engineering Technology Center, Suzhou 215123, China; 3. Persongen Biomedicine (Suzhou) Co., Ltd., Suzhou 215123, China *Corresponding Author: YANG Lin, E-mail: yanglin@
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31471283） 作者单位：215123， 苏州大学唐仲英血液学研究中心 苏州大学血液学 协同创新中心 （李亚芬，周 如苑，孟会敏，安钢力，杨 林）；215123，苏 州市肿瘤免疫诊疗及 纳 米 医 药 工 程 技 术 研 究 中 心 （云 辉 ，游 凤 涛 ， 张 波 桢 ， 杨 林）；215123，博生吉医 药科技（苏州）有限公司（宗云 辉， 游凤涛，张波桢） * 通信作者：杨 林， Tel：0512-65880877；E-mail：yanglin@
图 1 NK 细胞扩增原理 Fig 1 Mechanism of NK cell expansion
1 材料与方法
1.1 实验材料 K562 (人白血病细胞)和 RPMI-8226 (人骨髓瘤细胞)为本实验室保留株；稳定表达 IL-15 和 CD137L 的 pAPC 细胞由博生吉医药科技（苏州） 有限公司提供；细胞因子 IL-2 购自 Roche 公司；抗体 CD3 -FITC、CD56 -APC、IL21 -Alexa Fluor 647、7 AAD 均购自 美 国 BD 公 司 ；CFSE 购 自 Invitrogen 公 司；血细胞计数板购自 Reichert 公司；台盼蓝染色液 购自 Beyotime 公司；Ficoll 淋巴细胞分离液购自 GE Healthcare 公司。 1.2 外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC) 制备 取健康志愿者外周血 4 例， 采用 Ficoll 密度梯度离心法分离 PBMC，计数备用。 1.3 慢病毒包装及感染 使用慢病毒 4 质粒包装系 统 对 目 的 质 粒 IL-21 进 行 包 装 ， 辅 助 质 粒 分 别 为 △R、VSV-G、REV，包装细胞为 293T。病毒包装 48 和 72 h 后分别收集病毒上清。 上清液于 1 500 r/min 离 心 10 min 去细胞碎片，收集上清，用 0.22 μm 滤器过 滤。 感染时取 600 μl 病毒上清液感染 1×106 个 pAPC 细胞，48 h 后流式检测目的蛋白表达。 1.4 外 周 血 来 源 NK 细 胞 的 刺 激 培 养 分 离 PBMC 细 胞 后 ，PBS 洗 3 次 ， 以 1×106/孔 （2 ml） 接 种 于 24 孔板中，每孔添加辐照过的工程细胞 pAPC-mbIL-21 (2×106 个)、IL-2（终浓度 60 IU/ml），并补加常规细胞 培养液（RPMI1640+10%FBS）至 2 ml。 将 24 孔板置于 37 ℃、5％ CO2 培养箱中培养。 每 2 天补加 IL-2（终浓 度 60 IU/ml）， 每 7 天补加 pAPC-mbIL-21 工程细胞。 每 7 天对扩增细胞进行计数及流式细胞分析。 1.5 NK 细胞扩增倍数测定 用细胞计数板分别于第 0、7、14 和 21 天对实验组细胞进行计数，台盼蓝染色