青霉菌的原生质体制备技术研究
青霉素及其发酵生产工艺
青霉素及其发酵生产工艺引言青霉素是一种广泛应用于临床的抗生素，被广泛用于治疗多种细菌感染。
它具有杀菌作用，对多种革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌都有抑制作用。
青霉素是由真菌属于青霉菌制造的，具体的发酵工艺可以实现其大规模生产。
青霉素的来源青霉素最早是由苏格兰科学家亚历山大·弗莱明于1928年发现的。
弗莱明在实验中发现，一种称为青霉菌的真菌能够抑制细菌的生长。
经过进一步研究，他发现这种真菌产生的抑菌物质就是青霉素。
青霉素的结构和作用机制青霉素的化学结构非常复杂，由一个由螺旋形的β-内酰胺环和一个侧链组成。
这个结构决定了青霉素具有抗菌活性。
青霉素能够与细菌的细胞壁合成酶结合，抑制酶的活性，从而破坏细菌细胞壁的合成，导致细菌死亡。
青霉素的发酵生产工艺青霉素的发酵生产工艺是指通过培养和发酵青霉菌来产生大量的青霉素。
以下是一般的青霉素发酵生产工艺的步骤：1.接种培养基：将青霉菌接种到培养基中，培养基中包含有利于青霉菌生长和产生青霉素的营养物质。
2.培养和发酵：将接种后的培养基放入发酵罐中，并控制合适的温度和pH值。
同时，对培养物进行搅拌和通气，以促进青霉菌的生长和代谢产物的产生。
3.青霉素提取：经过一定时间的发酵后，青霉素会在培养物中积累。
将培养物经过离心等方法分离，然后使用适当的溶剂进行提取。
4.杂质去除：从培养物中提取的青霉素溶液中会含有一些杂质，需要通过过滤、萃取和洗涤等步骤进行去除。
5.结晶和纯化：经过杂质去除后的青霉素溶液会进行结晶，通过进一步的洗涤和纯化步骤，最终得到纯度较高的青霉素产品。
青霉素发酵工艺的优化为了提高青霉素的产量和质量，科研人员对青霉素发酵工艺进行了不断的优化。
以下是一些常用的优化方法：1.营养物质优化：根据青霉菌的营养需求，优化发酵培养基中的碳源、氮源和矿物质等成分，以提高青霉素的产量。
2.发酵条件控制：优化发酵罐的温度、pH值和氧气供给等条件，使青霉菌处于最适宜的生长状态，从而增加青霉素的产量。
青霉素生产工艺流程
青霉素生产工艺流程
《青霉素生产工艺流程》
青霉素是一种广泛应用于临床和兽医领域的抗生素，其生产工艺流程经历了长期的改进和优化。
以下是青霉素生产的主要工艺流程：
1. 霉菌培养：青霉素是由青霉菌属的真菌产生的，因此首先需要在合适的培养基上培养青霉菌。
通常采用的培养基是以葡萄糖、氮源、磷酸盐和微量元素为基础，辅以适当的pH和温度
条件。
2. 发酵：培养好的青霉菌会被转移到大型发酵罐中进行发酵。
发酵条件是青霉菌生长和合成青霉素的关键环节，包括适宜的温度、pH值、氧气供应和搅拌速度等参数。
3. 青霉素提取：在发酵结束后，青霉素会积累在发酵液中，此时需要对发酵液进行提取。
提取通常采用有机溶剂萃取的方法，将青霉素从发酵液中分离出来。
4. 青霉素精制：通过结晶、析出、溶解等步骤，将提取得到的青霉素进行精制，得到纯度较高的成品青霉素。
5. 青霉素制剂生产：最后，经过精制的青霉素会被用于制备各种类型的青霉素制剂，如青霉素粉剂、注射剂、口服液等。
青霉素生产工艺的每一个环节都需要严格控制，以确保青霉素
的纯度和质量。
随着生物工程和工艺技术的不断进步，青霉素生产工艺也在不断优化和改进，为临床和兽医用药提供更加可靠的青霉素制剂。
一种青霉菌及制备方法和应用[发明专利]
![一种青霉菌及制备方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/75109f0fb8f67c1cfbd6b8e6.png)
专利名称：一种青霉菌及制备方法和应用专利类型：发明专利
发明人：高梅影,柴波,刘朋明,吴艳
申请号：CN200810236900.0
申请日：20081219
公开号：CN101434909A
公开日：
20090520
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种青霉菌及制备方法和应用，青霉菌属真菌PSM11－5从钒矿样品中分离、以不溶性磷酸三钙和偏钒酸钠、氢氧化钴、碱式碳酸镍为指示化合物，经过测试分解磷酸三钙和偏钒酸钠、氢氧化钴、碱式碳酸镍的能力筛选出真菌菌株。
青霉菌PSM11－5，Penicillium
sp.PSM11－5 CCTCCM208207。
利用该菌株进行生物浸磷和生物冶金，从贫矿、废矿、表外矿及难采、难选、难冶矿中将磷和钒、镍、钴等金属浸出，达到充分利用矿产资源、降低冶金成本、保护生态环境。
利用PSM11－5从低品位磷矿粉中浸出磷，制成生物肥料施入土壤中，使土壤中含有较高的被农作物利用的可溶性磷，该菌株还浸出土壤中以前沉积下来的不可溶性磷，减少了磷肥，降低了磷肥所带来的气体污染和使用磷肥带来的水体污染。
申请人：中国科学院武汉病毒研究所
地址：430071 湖北省武汉市武昌小洪山
国籍：CN
代理机构：武汉宇晨专利事务所
代理人：王敏锋
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青霉素工艺流程
青霉素工艺流程青霉素是一种广谱抗菌药物，在医疗领域被广泛应用于治疗细菌感染。
下面将介绍青霉素的工艺流程。
首先，制备青霉素的原材料是青霉菌。
青霉菌是一种真菌，可以在适宜条件下发酵生长。
通过培养青霉菌菌株，可以得到大量的青霉菌菌体。
其次，将培养好的青霉菌进行培养液的制备。
将青霉菌菌株转移到培养容器中，添加适宜的培养基，包括碳源、氮源、无机盐等，同时进行搅拌和通气，并控制培养温度、pH值等条件，使青霉菌在培养液中进行生长和代谢。
然后，青霉菌经过一段时间的培养后，会产生青霉菌素。
青霉菌素是青霉菌在特定条件下产生的一种二次代谢产物，具有抗菌活性。
青霉菌素在培养液中以青霉菌菌体和代谢产物的形式存在。
接下来，需要对培养液进行分离提取。
将培养液进行离心，分离出青霉菌菌体和培养基。
然后，将青霉菌菌体经过均质处理，并加入一定比例的溶剂，将青霉菌素溶解出来，形成提取液。
提取液中的青霉菌素有许多杂质，需要进行纯化处理。
首先，可以采用化学方法，如酸碱沉淀、溶剂结晶等，分离出青霉菌素。
然后，使用各种色谱技术，如凝胶色谱、高效液相色谱等，进一步纯化青霉菌素，使其纯度更高。
经过纯化的青霉素溶液可以进行浓缩和干燥处理。
利用蒸发、结晶等工艺，将青霉素溶液中的溶剂去除，使其浓缩成固体。
最后，经过干燥处理，将青霉素固体转化为粉末或颗粒，以便于包装和储存。
整个青霉素的工艺流程包括青霉菌培养、培养液分离提取、青霉菌素纯化、浓缩和干燥等步骤。
每个步骤都需要严格控制各种参数，如温度、pH值、溶剂浓度等，以保证产品的质量和产量。
青霉素的工艺流程是复杂的，需要在严格的条件下进行操作，但是通过合理的工艺设计和严格的质量控制，可以得到高纯度的青霉素产品，为临床治疗提供了有力的工具。
青霉素的生产工艺及设备
青霉素的生产工艺及设备引言青霉素是一种重要的抗生素，被广泛应用于医疗领域。
在青霉素的生产过程中，合理的工艺和先进的设备是确保高质量产品的关键因素。
本文将介绍青霉素的生产工艺及常用的生产设备。
青霉素的生产工艺青霉素的生产工艺主要包括以下几个步骤：1.青霉菌的培养：选用高产菌株进行培养，通常使用青霉菌的液体培养基，如玉米粉培养基、磷酸二氢钾培养基等。
2.发酵：将培养好的青霉菌菌种接种到发酵罐中，通过控制温度、pH值、搅拌速度等条件，使菌株能够在较短的时间内大量繁殖。
3.青霉素的提取：经过一定时间的发酵后，菌体中产生的青霉素需要进行提取。
常用的提取方法有有机溶剂法、浸提法等。
4.纯化：提取得到的青霉素溶液中可能含有其他杂质，需要进行纯化。
纯化的方法主要包括结晶、蒸馏、析出等。
5.干燥：纯化后的青霉素需要进行干燥，以去除水分，确保产品的稳定性和质量。
6.包装：最后，将干燥后的青霉素进行包装，以便储存和运输。
青霉素的生产设备在青霉素的生产过程中，需要使用一系列的生产设备，以确保生产工艺的顺利进行。
以下是常用的设备：1.发酵罐：用于培养青霉菌菌种并进行发酵过程。
发酵罐通常由不锈钢制成，具有良好的耐腐蚀性和可调节的温度、pH值、搅拌速度等参数。
2.静态混合器：用于混合发酵罐中的培养基和青霉菌菌种，保证菌株能够均匀分布并获得充分营养。
3.分离设备：包括离心机、过滤器等，用于将发酵液中的青霉菌菌体和代谢产物分离。
离心机通过离心力将菌体和液体分离，而过滤器则通过微孔等作用将菌体滤出。
4.萃取设备：用于青霉素的提取，常用的设备有搅拌式萃取塔、液液萃取塔等。
这些设备利用溶剂对溶解青霉素，实现青霉素的分离。
5.真空干燥器：用于将纯化后的青霉素产品进行干燥，去除水分。
真空干燥器通过降低压力，加速水分的挥发，从而实现青霉素的干燥。
6.包装设备：用于将干燥后的青霉素产品进行包装。
常见的包装设备有自动包装机、药物包装机等，可以根据需要进行不同规格和容量的包装。
青霉素的发酵生产流程
青霉素的发酵生产流程一、菌种选育与保存青霉素的生产首先始于优良菌种的选育。
选育出的高产、稳定且遗传性能好的菌种是青霉素生产的基础。
一旦获得理想菌种，必须妥善保存以防退化。
常用的保存方法包括冷冻干燥、斜面低温保藏和砂土管保藏等。
二、生产菌活化在进行大规模发酵生产前，需要对保存的菌种进行活化。
活化过程通常在适宜的培养基和温度下进行，目的是使菌种从休眠状态复苏，恢复其生理活性。
三、孢子制备活化后的菌种进一步制备成孢子悬液。
孢子作为青霉素发酵的种子，其质量直接影响发酵效果。
孢子制备过程中要注意控制营养条件、温度和湿度等，以获得数量多、质量好的孢子。
四、种子制备种子制备是将孢子接入适宜的培养基中，进行一定时间的培养，使其繁殖成足够数量的菌丝体。
这一过程中要严格控制培养条件，如温度、pH值、通气量等，以确保菌丝体健康、生长迅速。
五、发酵培养发酵培养是青霉素生产的核心环节。
将种子接入发酵罐中，在严格控制的培养条件下进行大规模的培养。
通过调节培养基成分、温度、pH值、溶氧量等参数，促进青霉素的合成和积累。
六、发酵液预处理发酵结束后，发酵液需要进行预处理，以去除其中的杂质和固体颗粒，为后续的萃取与分离创造条件。
预处理通常包括离心、过滤、沉淀等步骤。
七、萃取与分离萃取与分离是将青霉素从发酵液中提取出来的关键步骤。
常用的萃取剂有醋酸丁酯、正丁醇等。
通过萃取，青霉素可以被转移到有机相中，再经过分离纯化得到较为纯净的青霉素。
八、脱色与结晶经过萃取与分离后得到的青霉素溶液需要进行脱色处理，以去除其中的有色杂质。
脱色后，再通过结晶操作，使青霉素以晶体的形式析出，便于后续的干燥和包装。
九、成品检验与包装最后，对结晶得到的青霉素进行质量检验，包括纯度、活性等指标。
合格的青霉素产品进行干燥、粉碎后，进行包装。
包装材料要求无菌、防潮、避光，以保证青霉素在存储和运输过程中的稳定性和有效性。
整个青霉素的发酵生产流程需要严格控制各个环节的条件和操作，以确保最终产品的质量和产量。
高产纤维素酶菌株原生质体制备及再生条件
２ Ｖ＿ ０ １ ． ３ ３ Ｎ ｏ．１
Ｄｅ ｃ． ２Ｏ１ ３
＿＿＿＿
Ｉ
Ｅｊ
同
产纤维素酶菌株原生质体制备及再 生条件
李 淼， 曾柏全 ， 冯金儒
（ 中南林 业科技 大学 生命科 学与技术 学院 ，湖 南 长 沙 ４ １ ０ ０ ０ ４ ）
摘 要：研究青霉菌 Ｐ ｅ ｎ ｉ ｃ ｉ ｌ ｌ ｉ ｕ ｍ Ｑ５ 和枯草 芽孢 杆菌 Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｓ ｕ ｂ ｔ ｉ ｌ ｉ ｓ Ｋ ３原生质体制备与再 生的最佳条件 。采用 酶解法制备 了青 霉菌和枯草芽孢杆菌 的高质量 的原 生质 体。试验对亲本菌株 的菌丝生长，酶浓度 ，酶解 时间和 灭活时 间进行 了优化 。亲 本菌 株 Ｏ ５ ，培养液 中加入浓度 ０ ． ５ ％ 甘氨酸和含量 １ ０ ％ 的蔗糖 处理后 ，在质量 浓度 均
Ｐ ｒ ｏ ｔ ｏ ｐ ｌ ａ ｓ ｔ ｐ ｒ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｒ ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｏ ｆ Ｐ ｅ ｎ ｉ ｃ ｉ ｌ ｌ ｉ ｕ ｍ Ｑ５ ａ ｎ ｄ
Ｂａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｓ ｕ ｂ ｔ ｉ ｌ ｉ ｓ ｋ ３
桧状青霉原生质体制备和再生的研究_张粲
用于制药、食品制造、环境工程等众多领域的菌种 different times
改良研究中(朱欣杰和程瑶, 2006)。为了进一步鉴定、 培养时间(h)
PDA SDYS 菌丝生长培养基
研究纤维素酶的基因及其功能，需研究该菌株的产 酶机理，并对其进行分子遗传学和分子生物学方面 的相关研究，从而对该纤维素酶的产生及其抑制机 理有较为深入的了解。建立丝状真菌高效遗传转化 体 系 ，将 更 有 利 于 菌 株 的 改 造 和 基 因 研 究 ，目 前 一 般通过 PEG (polyethylene glycol, 聚乙二醇)介导的
1 天津科技大学生物工程学院, 天津, 300457; 2 天津工业生物技术研究所, 天津市工业生物系统与过程工程重点实验室, 天津, 300308 * 通讯作者, wgh822@, zhang_dy@
摘 要 本文对桧状青霉 H16 的原生质体制备和再生的相关影响因子进行了初步的研究。结果表明：于 30℃，转速为 200 r/min 的 SDYS 培养基中培养了 16 h 的菌丝，经 S1 溶液洗涤后，在 1 mol/L 的 NaCl 为等渗 溶液，采用浓度为 10 mg/mL 的酶液，酶解温度为 35℃，转速为 100 r/min 的条件下处理 1.5 h 时原生质体量达 到最佳，本实验范围内最高达到 6×106 个 /mL；同时，选取含有 25 mmol/L Ca2＋的改良的察氏培养基培养经 S2 洗涤的原生质体时，原生质体可以达到较佳的再生率，本实验范围内最高达到 24.3%。该研究为桧状青霉后期 的菌株改造和遗传转化体系的建立奠定了基础。 关键词 桧状青霉, 原生质体制备, 原生质体再生
Incubation time (h) 12 16 20 24 28
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青霉菌的原生质体制备技术研究薛康平任富亮邢建广王越甲摘要：实验证明青霉菌原生质体形成最佳条件是用马铃薯液体培养基，液体震荡培养温度28℃, 培养42h，蜗牛酶的浓度为5mg/ml，酶解3.5h ，酶解温度33℃ ,稳定剂采用0.7mol/LNacl，此条件下能够制备最大量的青霉菌原生质体。
关键词：青霉菌原生质体蜗牛酶1原生质体简介细胞壁被酶水解剥离，剩下有原生质膜包围着的原生质部分称为原生质体Weibull 等于1953年首次用溶菌酶处理巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)细胞获得原生质体。
其形状随不同菌类而异，革兰氏阴性菌经酶水解后细胞壁尚有残余部分，细胞具刚性，保持球形，称为原生质球或球质体；革兰氏阳性菌细胞壁去除彻底，失去刚性，原生质体类似于球体。
不论原生质体或原生质球都基本保持原细胞结构，活性和功能，只是因为它们去掉了细胞壁，对渗透压特别敏感。
原生质体诱变是一种行之有效的育种新技术，它是以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落中筛选高产突变菌株。
Kim等于1983年首先采用该法诱变玫瑰色小单孢菌（Micromonospora rosaria）取得成功以来，应用逐渐广泛，已在抗生素，酶制剂，有机酸及维生素等高产突变株的选育中起到重要的作用。
丝状真菌原生质体的提取方法有三种：机械法，非酶分离法和酶法。
采用前二种方法制备的原生质体效果差，活性低，仅适用于一些特定菌株，因此并未得到推广。
在实际工作中，最有效和最常用的是酶法，该法时间短，效果好。
到目前为止，适合于原生质体分离的各种酶类已经得到开发和应用。
酶法分离原生质体的方法：首先选择原始亲株，经过遗传标记筛选，得到直接亲本，采用培养皿平板玻璃纸或摇瓶震荡法培养，取年轻的菌体转入到高渗溶液中，加入有关水解酶，在一定条件下（温度，pH值等）酶解细胞壁[7]。
酶解后释放的原生质体和残存菌丝片断的混合液经G-2和G-3砂芯漏斗过滤，除去大部分菌丝碎片。
滤液进一步低速离心10min,洗涤后弃去上清液，沉淀悬浮于同一种高渗溶液中，即可得到纯化的原生质体。
酶法分离原生质体的本质是以微生物细胞壁为底物的酶水解反应，作为底物的细胞壁，其组成与结构又与培养基成分，培养条件，菌齢和预处理等因素有关。
2 材料与方法2.1 材料2.1.1 菌株青霉菌，来自河北科技大学（生物科学与工程学院微生物实验室保藏菌株）2.1.2 培养基马铃薯低渗培养基马铃薯等渗培养基（即含0.7mol/l NaCl的上述培养基）2.1.3 试剂蜗牛酶，石炭酸复红染色液，蔗糖，KH2PO4.7H2O，MgSO4，酵母膏， NaCl。
2.1.4 仪器与设备（1）IA-1003电子天平,TGL-16C台式离心机，光学显微镜，超净台，恒温箱，电磁炉，4℃冰箱，高压灭菌锅。
（2）移液枪及枪头，1.5ml离心管，小医用注射瓶，100ml量筒，锥形瓶，培养皿，烧杯，镊子，酒精棉球，绳子，接种针，封口膜，报纸。
2.2 方法2.2.1配制马铃薯低渗培养基（1）称取土豆434.97g，切成小块，放入锅中煮。
用纱布过滤除去土豆泥，得到土豆汁500ml。
（2）称取2g蔗糖，0.5g KH2PO4.7H2O、0.5g MgSO4、1.5g酵母膏放入烧杯中，从原土豆汁中取出160ml一并放入烧杯，再加水至500ml。
（3）取100ml于锥形瓶中，加入2g琼脂，其余的分装入3个锥形瓶。
（4）做好标记，与培养皿一起放入高压锅中灭菌。
（5）灭完菌后，固体培养基倒平板，液体培养基放入4℃冰箱保存。
2.2.2配制马铃薯等渗培养基（1）称取0.4g蔗糖，0.1g KH2PO4.7H2O、0.1g MgSO4、0.3g酵母膏放入烧杯中，从原土豆汁中取出32ml一并放入烧杯，再加0.7mol/l的Nacl至100ml。
（2）称取2g琼脂放入烧杯中。
（3）混匀后分装入5个锥形瓶。
（4）做好标记，与培养皿一起放入高压锅中灭菌。
2.2.3 配制不同浓度的蜗牛酶液(1)称取20mg蜗牛酶于小医用注射瓶中，并加水至2ml，此即为浓度10mg/ml 的蜗牛酶液。
(2)从上述酶液中分别取80、240、400、560、720于小医用注射瓶中，并补水至800ul。
(3)此即为浓度分别为1、3、5、7、9mg/ml的蜗牛酶，用记号笔做上标签。
2.2.4 配制0.7mol/l Nacl溶液称取32.76gNacl固体溶于无菌水中，定容至800ml，灭菌并4℃保存。
2.2.4 青霉菌菌株的活化将保存在冰箱中的青霉菌接种在新配制的马铃薯固体培养基中。
28℃恒温箱中培养2-3d。
2.2.5 原生质体制备(1) 接种：培养好后，从平板培养基中，取一环菌接种于马铃薯液体培养基中，33。
C恒温摇床分别培养36h、42h、48h。
(2)离心：将培养好的青霉菌在12000r/min下离心5min.(3)洗涤: 弃上清液，将沉淀用0.7mol/L Nacl洗涤两次。
(4)酶解：将洗涤完后每个培养时间的青霉菌分装于5个小离心管中，每管60mg新鲜菌丝体，向这些离心管中分别加入0.6ml浓度为1mg/ml、、3mg/ml、5mg/ml、7mg/ml、9mg/ml的蜗牛酶。
33℃振荡培养3.5h.(5)过滤：酶解液用4层擦镜纸过滤，滤去未酶解的菌丝。
(6)离心：滤过液4000r/min离心10min,收集原生质体。
(7)洗涤：所得沉淀用0.7mol/L的Nacl洗涤离心三次，用等量的0.7mol/L的Nacl悬浮原生质体。
(8)观察并计数：在显微镜下观察原生质体的形态并计数。
3 结果与讨论3.1 不同浓度蜗牛酶酶解条件不同浓度蜗牛酶酶解条件下得到的原生质体如下：图1 1mg/ml蜗牛酶图2 3mg/ml蜗牛酶图3 5mg/ml蜗牛酶图4 7mg/ml蜗牛酶图5 8mg/ml蜗牛酶液体培养36h以上实验的结论是5mg/ml的蜗牛酶的效果最好3.2 菌龄对青霉菌原生质体形成的影响以5mg/ml蜗牛酶处理青霉菌，考察了培养时间对原生质体形成的影响结果如下：图6 液体培养36h图7 液体培养42h图8 液体培养48h 图9液体培养54h 液体振荡培养42h的青霉菌原生质体的得率最高。
这可能是因为菌体的不同生理状态，直接影响到细胞壁的结构、菌体的代谢水平及菌体的活力等。
青霉菌原生质体制备一般取对数生长期的细胞，此时细胞代谢活跃，生长率高，群体细胞的化学组成、形态及生理特征比较一致。
对数生长期以前的菌丝体细胞壁结构对降解酶不敏感，酶解过程中更多的是将细胞壁最外层葡聚糖部分降解，造成菌丝体断裂，内含物溢出。
到了对数生长后期，菌丝体原生质体释放量较高，但菌丝体体内有大量液泡产生，且原生质膜内皱较多，故释放的原生质体体积较大。
4 小结确定了丝状真菌——青霉菌原生质体形成最佳的部分条件是用马铃薯液体培养基，液体震荡培养温度28℃, 酶解3.5h ，酶解温度33℃ ,不用预处理，稳定剂采用0.7mol/lNacl。
本次实验分别从菌龄、蜗牛酶的浓度等方面研究了提取丝状真菌——青霉菌原生质体的最优条件。
所得结论如下：1.菌龄对青霉菌原生质体提取存在着比较大的影响。
在相同的培养条件下，通过比较液体摇床震荡培养36h、42h、48h的青霉菌，得出的结论是：培养42h的青霉菌释放原生质体的数量最大。
2. 蜗牛酶浓度对青霉菌原生质体提取也存在着比较大的影响。
在相同的培养条件下，通过比较1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、7mg/ml、9mg/ml的蜗牛酶浓度对原生质体形成的影响，得到的结论是：蜗牛酶的浓度为5mg/ml时，能制备最大量的原生质体。
参考文献1 诸葛健主编沈微副主编工业微生物育种学化学工业出版社 1999.2 张志光,李东屏,方芳,郭建春. 丝状真菌原生质体技术研究——培养条件对原生质体的影响(VII)[J]湖南师范大学自然科学学报, 1998,(01).3张志光,李东屏,邹寿长,方芳. 丝状真菌原生质体技术的研究(Ⅷ)——渗透压稳定剂对原生质体的影响[J]湖南师范大学自然科学学报, 1998,(02).4张志光，李东屏，方芳. 丝状真菌原生质体技术研究（V）──原生质体融合的形态学观察[J]湖南师范大学自然科学学报, 1994,(03).5农向群,吴正铠,包建中. 金龟子绿僵菌原生质体形成和再生的研究[J]微生物学通报, 1990,(02).6谭文辉,李燕萍,许杨. 微生物原生质体制备及再生的影响因素[J]现代食品科技, 2006,(03).7王燕. 双亲灭活米曲霉原生质体融合中原生质体制备的研究[J]中国酿造, 2007,(05).8谭文辉. 橙色红曲菌AS3.4384产孢及原生质体制备和再生条件的优化[D]南昌大学, 2006.熊姗薇,孙宇辉,涂国全. 链霉菌702原生质体的制备和再生条件研究[J]江西科学, 2007,(06).9宋爱环,李红叶,刘小红. 指状青霉(Penicillium digitatum)原生质体制备和再生条件[J]农业生物技术学报, 2004,(02).10郑重谊,谢达平,谭周进,肖克宇,李雨虹. 影响微生物原生质体融合技术的因素[J]湖南农业科学, 2006,(04).11孙传宝,朱春宝,许文思. 产黄青霉原生质体制备和再生影响因子分析[J]中国抗生素杂志, 2001,(04).12林学政,沈继红,李光友.海藻原生质体融合及杂交技术的研究进展.海洋科学,2000,24(8):1-3.13 彭帮柱, 岳田利, 袁亚宏等. 酵母菌原生质体融合技术.西北农业学报，2004，13 (1):101-10314孙传宝,朱春宝,许文思.产黄青霉原生质体制备和再生影响因子分析.中国抗生素杂志,2001, 26(4):241-244.15李元文. 姬菇原生质体技术的研究[D]湖南农业大学, 2006.16李蕤,马守能,刘群,吴克,刘斌,潘仁瑞. 香菇菌丝原生质体制备及融合条件的研究[J]安徽大学学报(自然科学版) , 2001,(03).17程东升，邹莉，潘学仁. 菌丝培养条件的改进对香菇原生质体释放的促进效果[J]东北林业大学学报, 1994,(02).18郑佐兴. 米曲霉和黑曲霉营养缺陷型的分离及原生质体的制备[J]工业微生物, 1994,(01) .19 Chang J Y. T he functional dom ain of hirudin,a th rom bin2specific inh ibito r. FEBS L ett, 1983, 164: 307～309 .20 L iang S P,L aursen R A. Covalent immobilization of p ro teins and pep tides fo r so lid2phase sequencing using prepacked cap illary co lum ns.A nalyt B iochem, 1990, 188: 366～ 373.21 W alsm ann P. Iso lation and characterization of h irudin fromH irud o M ed icina lis. Sem inars in T h rom bosis and Hom eo stasis, 1991, 17(2): 83～ 87.22 R. V. Muralidhar, T. Panda. Fungal protoplast fusion. Bio-process Engineering, 2000,22:429-431 .23 Challen MP, Bhattiprolu GR, Warner PJ. Cloning the Coprumus bilannatus TRP2 gene and it use as a selectable marker in transformation .Mycology Research, 1994, 98(2) :179~185 .24 Osamu Ishibashi, Kazuo Shishido. Nucleaotide sequence of a ras gene from the basidiomycete Coprinus cinereus .Gene, 1993, 125(2) :233~234。