PCR扩增检测乙肝病毒
检验科乙肝病毒核酸扩增荧光检测
乙肝病毒核酸扩增荧光检测1．目的：保证HBV DNA检测结果准确、可靠。
2．适用范围：HBV DNA的TaqMan荧光定量检测，标本类型为血清。
3．负责人：操作人：4．原理：本试剂盒用一对乙型肝炎病毒特异引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，PCR反应液，耐热DNA聚合酶（Taq酶），四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，再用PCR体外扩增法检测丙型肝炎病毒cDNA。
5．性能参数：检出低值＜1×103基因拷贝/ml。
6．标本要求：（1）标本类型：血清。
（2）标本采集：见标本采集手册。
（3）标本储存和运输：室温放置不超过8小时，4-8℃不超过72小时，-20℃保存期6个月，应避免反复冻融。
室温运输。
（4）标本拒收状态：细菌污染、严重溶血或脂血标本不能作测定。
7．容器和添加剂类型：无菌离心管和无菌真空管8．所需设备：ABI GeneAmp 5700、台式高速离心机、混匀器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外灯9．试剂：DNA提取液（500μl/管）2管；HBV-PCR反应液（未贴标签管）20管；阳性定量质控标准品（1×108基因拷贝/ml）（50μl/管）1管；阴性质控品（250μl/管）1管。
10．校准程序（计量学溯源性）：送深圳市计量检测所校准。
11．程序步骤:：11.1标本处理：取血清标本40μl，加等量DNA提取液打匀。
（提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。
如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截。
）沸水浴10分钟（误差不超过1分钟），（为保证病毒颗粒充分裂解可转至4℃静置8~12小时）。
10000rpm离心5分钟，取上清2μl做PCR反应。
11.2标准品稀释和处理：将阳性定量质控标准品（1×108基因拷贝/ml）6000rpm离心数秒标示为108，另取4支灭菌新0.5ml离心管，分别加入45μl阴性质控品，依次标示为107~104。
应用全自动医用PCR分析系统进行肝病基因检测的新发现
应用全自动医用PCR分析系统进行肝病基因检测的新发现最新的研究发现，应用全自动医用PCR分析系统进行肝病基因检测，取得了令人振奋的新突破。
PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，它能够快速、准确地扩增特定基因片段，为疾病的诊断和治疗提供重要的信息。
而肝病基因检测则是利用PCR技术来检测肝脏相关基因的突变，以了解肝病的风险和潜在治疗方法。
在过去的几十年里，PCR技术已经发展为一项成熟而广泛应用的生物技术。
然而，传统的PCR方法仍然存在一些问题，例如手动操作的复杂性、时间消耗和结果的不确定性等。
为了解决这些问题，科研人员开发了全自动医用PCR分析系统，以提高基因检测的效率和准确性。
新发现中采用的全自动医用PCR分析系统为肝病基因检测带来了三个重要的突破。
首先，该系统具有高度的自动化程度，减少了操作者的人为误差。
与传统的手动PCR方法相比，全自动系统能够自动化地完成样本处理、试剂配置、液体传递和数据分析等步骤，为实验结果提供了更高的可靠性和一致性。
其次，全自动医用PCR分析系统缩短了检测时间。
传统PCR方法通常需要几个小时甚至几天的时间才能得到结果，而全自动系统可以在短短几十分钟内完成PCR扩增和结果分析。
这种高效的检测方法使得肝病患者能够更快地获取到确诊结果，为早期治疗和干预提供了更好的机会。
第三个突破在于全自动医用PCR分析系统的高灵敏性和高特异性。
对于肝病基因突变的检测，准确性至关重要。
新发现显示，该系统能够检测到非常低浓度的基因片段，并具备良好的特异性，可区分不同的突变类型。
这为准确判断患者病情提供了有力的支持。
全自动医用PCR分析系统的新发现对肝病的研究和临床应用具有重要意义。
首先，基于该系统的肝病基因检测可以提供关于患者肝脏状况和风险的更准确信息，有助于医生制定更个体化的治疗方案。
其次，该系统可用于筛查潜在的肝病风险群体，早期发现并干预病情的发展。
此外，该系统还有望成为基因治疗研究和精准医学发展中不可或缺的工具。
乙肝病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程
乙肝病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程一、引言乙肝病毒核酸检测是一种重要的手段，用于乙肝病毒感染的早期诊断和监测治疗效果。
本文档旨在描述乙肝病毒核酸检测的标本采集、送检和处理流程，以确保流程规范和结果准确性。
二、标本采集1. 标本选择：乙肝病毒核酸检测的标本可使用血清、血浆或乙肝病毒DNA提取物。
根据实验室提供的要求和使用的方法，正确选择合适的标本进行采集。
2. 采集器具：使用无菌器具进行标本采集，如无菌收集管、无菌采血针等。
3. 采集流程：- 患者应事先了解采集流程与注意事项，并保持合作配合。
- 消毒部位：消毒患者采血部位，通常选择肘弯处的静脉。
- 采血：按照相应的方法采集合适数量的血液样本。
注意血液采集的整洁和标本不得受到污染。
4. 采集注意事项：- 采血前需要对采血设备进行消毒处理。
- 采血时要避免对血液标本造成不必要的污染，防止样本交叉感染。
- 采血后进行适当的处理，确保采血点不出现血肿或其他并发症。
三、标本送检1. 样本存放：采集的标本应放入防漏、密封良好的中。
若需要长期保存，应在-80℃低温条件下保存，以防止DNA的降解。
2. 标本信息：在标本上标注清楚患者信息，如姓名、年龄、性别等。
确保标本信息准确，以避免混淆和误诊。
3. 快递选择：选择快递公司进行标本运输，确保安全、快捷的送达实验室。
在包装标记时，应注明标本的特殊性质，以提醒运输人员注意。
四、标本处理1. 样本分装：实验室收到标本后，根据实验要求进行样本分装。
如分装到提取试剂盒、酶解管中，标注清楚样本编号，确保实验过程的可追溯性。
2. 提取和纯化：根据实验方法进行标本的提取和纯化操作。
确保提取和纯化过程的洁净，避免外源性核酸污染。
3. PCR扩增：将提取纯化后的样本进行PCR扩增反应。
注意PCR操作条件的准确性，避免扩增过程中的交叉污染。
4. 结果分析：根据PCR扩增结果，通过相关分析方法，如凝胶电泳、定量PCR等，对乙肝病毒核酸进行检测和分析。
PCR法测乙肝病毒 (2)
PCR法检测乙肝病毒原理：多聚酶链反应(polymerase chainreaction，PCR)是一种模拟天然DNA复制过程，在体外扩增特异性DNA（或RNA）片段的新技术。
本实验是将待检双链DNA经94℃高温变性成单链作模板，然后加入一对人工合成的寡核苷酸引物，引物分别与待扩增DNA片段的两端互补，经55℃低温退火，引物与模板互补结合。
在72℃条件下，结合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下，利用反应体系中的4种dNTP为原料，按碱基互补配对的方式延伸合成两条新的DNA链。
所扩增的DNA可作为下一轮扩增反应的模板。
重复上述循环过程，经过20～30个周期后，特异的目的DNA可扩增百万倍以上。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后即可观察到特异的扩增条带。
PCR方法操作简便，灵敏度高，可检测出少至0.1pg的目的DNA。
目前已广泛应用于多种病原微生物的检测。
乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，在我国发病率很高，而且HBV与肝硬化、原发性肝癌关系密切，因此，HBV的诊断极为重要。
PCR检测HBV-DNA敏感性明显高于传统的血清学方法，且能显示HBV在体内复制情况，直接反映患者血液的感染性，并对模棱两可的或与临床表现不符的血清学结果，PCR技术有助于明确诊断。
【材料】待检血清、HBV-PCR反应液20管（20μl/ 管）、HBV-DNA裂解液、阳性模板、溴化乙锭、PCR扩增仪、电泳仪、紫外线分析仪。
【方法】1、标本处理：取混匀的血清20μl加20μl裂解液，搅匀后100℃沸水浴10分钟，最后15000rpm/分钟离心3分钟，取4μl上清待检。
2、加样及PCR：取反应液一管（使用前稍加离心），加4μl待检上清或阳性对照于底层反应液中，混匀后高速离心片刻，然后置94℃预变性2分钟，再按94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/60秒扩增35个循环。
3、电泳与结果判断：取15μl 反应液，经2%琼脂糖凝胶电泳（5V/cm）30分钟后，在紫外灯下观察结果，若410bp 处出现橙黄色带，则HBV为阳性。
PCR检测HBV DNA - 滁州中心血站
一、检测对象
本院住院、门诊及外院送来的HBV-M检 测阳性血清标本
二、HBV PCR杂交酶联定量检测
• 试剂： 由上海浩源生物科技有限公司提供，按 说明书进行标本预处理、核酸扩增、杂交 检测和实验结果判断等步骤进行，每步操 作都必须严格按说明书操作，否则都可导 致结果无法判断。
二、HBV PCR杂交酶联定量检测
PCR检测HBV DNA
滁州市第二人民医院 谢瑞玉
摘 要
通过乙型肝炎病毒（HBV）核酸扩增 （PCR）酶联免疫吸附试验（ELISA）定量 检测HBV-M阳性标本中的HBV DNA数量， 可以反映HBV真实感染和复制状态，结合 HBV DNA含量测定判断HBV病毒复制状态， 对乙型肝炎的辅助诊断、治疗及判断预后具 有重要的指导意义。
四、讨Байду номын сангаас
论
谢 谢！
• 仪器和实验条件 伯乐公司生产的基因扩增仪和芬兰生产的 酶标仪，实验室必须严格区分三个区域， 即前PCR室，样品制备室和后PCR室。
三、结 果
我们分别对“大三阳”、“小三阳”及 “一五阳”组进行了统计，结果显示“大 三阳”组阳性率为100％且拷贝数范围在 105~109/ml，“小三阳”组阳性率为52％， “一五阳”组阳性率为66％
乙肝hbv-dna病毒数量标准
乙肝hbv-dna病毒数量标准乙肝(HBV)是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的一种肝炎疾病。
HBV-DNA是HBV病毒所含的一种核酸，HBV-DNA病毒数量标准是可以评估乙肝患者病情严重程度的指标之一。
本篇文章将重点阐述乙肝HBV-DNA病毒数量标准、治疗方法以及注意事项。
一、乙肝HBV-DNA病毒数量标准HBV-DNA病毒数量可以通过PCR扩增技术测定，计量单位为“国际单位/ml”(IU/ml)，也可以用“拷贝数/ml”(cp/ml)表示。
目前，国内外对于HBV-DNA病毒数量的划分标准不尽相同。
根据中国抗病毒治疗指南2019年版，“HBV-DNA<500IU/ml”被认为是阴性，”HBV-DNA≥500IU/ml“被认为是阳性。
根据美国国立卫生研究院(NIH)建议标准，“HBV-DNA≥2000IU/ml”属于阳性。
HBV病毒的复制速度与其病毒数量呈正比关系。
一般来说，患者血清中HBV-DNA病毒数量越高，说明患者的乙肝病情越严重，肝细胞受损的程度也就越明显。
因此，通过测定HBV-DNA病毒数量的高低，可以评估乙肝的病程严重程度，以指导下一步的治疗方案。
二、乙肝HBV-DNA阳性的治疗方法1. 治疗目标乙肝的治疗旨在抑制HBV病毒复制，降低肝炎的病情恶化，减少肝损伤，同时通过肝功能的改善，提高患者的生活质量，降低肝癌的发生率。
2. 抗病毒治疗目前临床应用的抗病毒药物有拉米夫定、恩替卡韦、阿德福韦等，这些药物都可以有效地抑制HBV病毒的复制。
因此，高病毒载量的乙肝患者，可以选用抗病毒药物进行治疗，以取得抑制病毒复制的效果。
拉米夫定: 口服适用，不良反应小，临床应用最广泛，能有效控制HBV病毒复制，是治疗乙肝的一线药物。
恩替卡韦: 口服适用，单次日剂量可减轻。
一般耐药率较低。
适用于HBV 基因突变的患者以及对拉米夫定耐药的患者。
阿德福韦: 是治疗慢性乙肝的一线药物，纯量形式为口服胶囊，也可以采用注射方式应用。
乙肝病毒核酸扩增荧光检测操作规程
乙肝病毒核酸扩增荧光检测操作规程1. 目的：规范乙肝病毒核酸扩增荧光检测，保证HBV -DNA检测结果准确、可靠。
2. 范围：适用于HBV -DNA的TaqMan荧光定量检测，标本类型为血清。
3. 职责：操作人负责按照本操作规程进行乙肝病毒核酸扩增检测。
4. 程序：4.1检验方法：4.1.1 DNA 提取（样本制备区）将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV 强阳性质控品、HBV 临界阳性质控品进行同步处理。
4.1.1.1 取200μl 样品，加入450μlDNA 提取液I 和4μl 的内标溶液，用振荡器剧烈振荡混匀15 秒，瞬时离心数秒。
100℃恒温处理10±1 分钟；4.1.1.2 12000g 离心5 分钟，备用。
4.1.2 PCR 试剂准备（试剂准备区）直接使用HBV-PCR 反应管。
4.1.3 加样（样本制备区）往上述HBV 反应管中用带滤芯吸嘴分别加入提取后的待测样本核酸、HBV 阴性质控品、HBV 强阳性质控品、HBV 临界阳性质控品和阳性定量参考品的上清各20μl。
盖紧管盖，8,000rpm 离心数秒后转移至扩增检测区。
4.1.4 PCR 扩增（扩增和产物分析区）4.1.4.1打开“Setup”窗口，按样本对应顺序设置阴性质控（NTC）、阳性质控以及未知样本（Unknow）、阳性定量参考品（Standard），并在“Sample Name”一栏中设置样本名称；探针检测模式设置为：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：none；Reporter Dye2：VIC ，Quencher Dye2：none；Passive Reference：Rox。
4.1.4.2 打开instrument窗口，设置循环条件如下：93℃2 分钟，93℃45 秒→55℃60 秒→10 个循环，93℃30 秒→55℃45 秒→30 个循环。
保存文件，运行。
4.2 结果分析反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline 的Start 值、End 值以及Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可以在3～15、End 值可设在5～20，在Log 图谱窗口设置Threshold 的Value 值，使基线位于扩增曲线指数期,调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击Analysis 自动获得分析结果，在Report 界面察看结果，记录未知样本数值（C）。
医院PCR乙型肝炎HBV核酸扩增PCR荧光检测程序
医院PCR乙型肝炎(HBV)核酸扩增（PCR）荧光检测程序（SOP-HBV）【试剂盒组成】DNA浓缩液（1.4ml/管） 1 管裂解缓冲液560ul 1管参比品(3×105~ 3×108copies/ml)10ul 各1管HBV-PCR反应液704ul 1管阳性标准品 20ul 1管临界阳性标准品 20ul 1管阴性标准品 20ul 1管酶溶液32ul 1管【操作步骤】1. 标本采集、保存和运送用无菌注射器抽取受检者静脉血1毫升，注入灭菌1.5ml Eppendoff管，于室温静置2小时,8000rpm离心5分钟，吸取200µl血清(注意勿带入红细胞)转入另一灭菌 1.5ml Eppendoff管，即为血清标本。
标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为6个月。
标本运送应保持在4℃以下。
2.试剂准备：按标本的数量和所需的对照数量配置反应液。
配置：按每个反应取HBV-PCR反应液22ul，酶1ul计算加于一总的无菌离心管中，震荡混匀。
分装：用微量加样器在每个PCR反应管内加入23ul上述混匀的反应液，转移到样品处理区，4℃保存。
3. 标本及对照标准品的处理取50ulDNA浓缩液加入到确定数量的0.5ml离心管中(浓缩液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取), 再分别加入血清标本50µl及20 ul阴性、临界、阳性对照品，混匀，室温静置2分钟，8000rpm离心5分钟，弃上清。
加入10ul裂解缓冲液，剧烈振荡后短暂离心，沸水浴10分钟(误差不超过1分钟), 13,000 rpm离心10分钟, 取上清液2µl做PCR反应。
4. PCR反应在Roche LightCycler热循环仪上设定如下程序；“SINGLE”。
仪器检测通道选择F1通道；其他为默认值。
5.结果判定a、基线设定用荧光显示模式F1/F2读取结果。
基线设定原则以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，且CT值不出现任何数值为准（根据仪器实际情况，一般在0.001-0.1范围内调整）。
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