Sourthern blot和Northern blot原理
Southern&northern&western杂交原理
Southern杂交Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。
一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。
Northern 印记杂交Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot 的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
Western杂交原理：是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。
其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。
先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。
Northern blot技术
核酸杂交技术(Southern Blot、Northern Blot ）（一）Southern Blot 原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二…（一）Southern Blot原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
（二）Northern Blot原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
（三）探针标记技术1 标记物：放射性和非放射性两种放射性：非放射性：生物素、地高辛素、荧光素2、标记方法（1）切口平移法（2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法northern blot简介Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
“Northern blot”这一术语实际指的是RNA分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现在通指整个实验的过程。
Sourthern blot和Northern blot原理
Sourthern blot和Northern blot原理（一）Southern Blot原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
DNA => 琼脂糖电泳 => 印迹转移 => 预杂交 => 杂交（变性探针） => 洗膜 => 放射自显影或显色（二）Northern Blot原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
mRNA提取 => 甲醛变性电泳 => 印迹转移 => 预杂交 => 杂交（变性探针） =>洗膜 => 放射自显影或化学发光（三）二者异同Southern blot 是分析DNA的杂交技术，Northern blot是分析RNA的，而Western blot是分析蛋白质的Southern 和Northerin原理基本相同，都是利用DNA或RNA的复性过程，但过程上也有区别，主要是Southern是先电泳后变性，而Northern是先变性后电泳；Southern是碱变性，而Northern采用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜等变性，因为采用碱变性会导致RNA水解（四）探针标记技术1 标记物：放射性和非放射性两种放射性：非放射性：生物素、地高辛素、荧光素2、标记方法（1）切口平移法（2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法。
northern blot
目录
简介 流程
材料电泳胶 探针
应用 优缺点
展开
编辑本段简介
Northern blot 是一种通过检测 RNA 的表达水平来检测基因表达的方法，通过
northern blot 的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特
定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的 RNA 分子依据
编辑本段优缺点
分析基因的表达可以有很多种不同的方法，除 northern blot 外还有 RT-PC
R、基因芯片、RNA 酶保护实验等。基因芯片常和 northern blot 一起使用，但通
常情况下，northernblot 的灵敏度要好于基因芯片实验，而基因芯片优势在于它可
在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化。与定量 PCR 的高灵敏度相
比，northern blot 显然要逊色不少，但 northern blot 较高的特异性可以有效的减
少实验结果的假阳性。Northern blot 实验中一个主要的问题是存在 RNA 的降解，
所以 northern blot 中所有的实验用品都需要经过除去 RNA 酶的过程，如高温烘
烤、DEPC 处理等。同时，norther blot 中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫
其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
“Northern blot”这一术语实际指的是 RNA 分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现 在通指整个实验的过程。Northern blot 在1977年由斯坦福大学 James Alwine，David Kemp 和 George Stark 发明。Northern blotting 实际上依照比它更早发明的一项杂交 技术 Southern blot（依据生物学家 EdwinSouthern 名字来命名）来命名，Southern blot 主要用来对 DNA 进行分析。
Southern northern western杂交应用
分子杂交分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在，以及其分子量大小。
根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交、Northern 杂交和 Western 杂交，以及由此而简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交等。
一、 Southern blotting1．转膜当目标 DNA 经过限制性酶切并通过琼脂糖凝胶电泳以后，在 0.4N NaOH 碱性条件下变性，再在 1.5M NaCl/1M Tris（pH7.4）条件下中和使 DNA 仍保持单链状态。
然后通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝胶上的 DNA 转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。
最后通过80℃ 处理或紫外线照射将 DNA 固定在滤膜上。
图4-2是通过毛细管渗吸法进行 Southern blotting 的经典装置图。
2．分子杂交2.1 预杂交将结合了 DNA 分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 DNA 或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。
2.2 杂交在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA 分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。
2.3 洗膜经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。
3．检测3.1 放射性标记、检测在分子克隆操作中用于标记核酸分子的标记物主要是放射性同位素，如32P，33P和35S 。
在掺入核苷酸的标记过程中，只有三磷酸核苷酸的α位磷酸整合到核酸链中，因此使用α位磷酸被标记的三磷酸核苷酸，如 [ α- 32 P]dATP 。
而在标记 5' 末端磷酸基团的反应中一般使用γ位磷酸被标记的ATP 。
放射性的信号通过X- 光片放射自显影或磷屏扫描获取。
3.2 非放射性标记、检测。
其中应用最成功的是原德国宝灵曼公司开发的地高辛（digoxygenin, DIG）标记核酸探针。
Southern Blot原理及实验方法
Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。
中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。
20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。
以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。
6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。
二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。
取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。
2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA 转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。
防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。
5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。
6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。
医学分子生物学第九章印迹杂交技术
cDNA。 将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交。 激光扫描芯片杂交结果，计算机处理。 分析杂交数据。
基因芯片
芯片杂交操作流程：
基因芯片
经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段
人工制作芯片
商业化芯片
分别用cy3(绿色)和cy5红色两种荧光燃料标记两 种cDNA
23 ICK
4 IL-3
22 MIP-3 alpha
25 MMP-8
原始值
model
normal
30386
12625 14732 14606 11547.5 9262.5 20601 16912 16590.5 22787 28232.5
12482.5
7836.5 8059.5 8564.5 6742.5
辣根过氧化物酶源自底物产物， 并发出光辣根过氧化物酶：HRPO 底片曝光
③ Blotting过程
1）牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜 2）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与
膜上的蛋白结合。 3）洗去未结合的一抗。 4）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 5）清洗掉未结合的二抗。 6）显影，检测
④结果 单抗blotting 结果
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测 胶上的蛋白质泳带。
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）：
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线 性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） （Polyacrylamide gel electrophoresis）
（一）核酸的变性与复性
复性
RNA
DNA
NorthernBlot原理及实验方法
Norther n Blot原理及实验方法原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的RN A探针进行反应。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
实验方法：[仪器、试剂、材料]（一）仪器恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶等。
（二）材料总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜（三）试剂：Norther nMax Kit（Cat. # 1940，Ambion,Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，RandomPrimer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free KlenowFragmen t和10 X Buffer, Sephade x G-50,SDS，双氧水,灭菌水等。
[方法与步骤]1.用具的准备：180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。
电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。
处理DEPC水(2 L)备用。
2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RN AZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZa p。
3．制胶：1．称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。
60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分)2．在通风厨中加入3.6ml的10＊Denatur ing Gel buffer，轻轻振荡混匀。
Northern Blot原理及实验方法
Northern Blot原理及实验方法原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的RNA探针进行反应。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
实验方法：[仪器、试剂、材料]（一）仪器恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶等。
（二）材料总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜（三）试剂：NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer，dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水,灭菌水等。
[方法与步骤]1.用具的准备：180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。
电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。
处理DEPC水(2 L)备用。
2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。
3．制胶：1．称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。
60℃空气浴平衡溶液(需加DEPC水补充蒸发的水分)2．在通风厨中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。
注意尽量避免产生气泡。
3．将熔胶倒入制胶板中，插上梳子如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。
southern杂交和northern杂交的原理和应用
southern杂交和northern杂交的原理和应用杂交是指由不同基因型的个体交配而产生的后代。
南方杂交和北方杂交是两种不同的杂交方式，它们有着不同的原理和应用。
南方杂交是指将两个具有显著不同的基因型的个体进行交配。
这两个个体通常分别来自不同的地理区域，其中一个个体来自南方而另一个来自北方。
这种杂交的目的是将两个个体的有益特性结合在一起，以产生更适应广泛环境的后代。
南方杂交的原理是，南方个体常常具有较高的抗病性和更好的适应性，而北方个体则通常具有较高的生产力和耐寒性。
通过将这两种特性结合在一起，可以得到既具有高产性、适应广泛环境又具有较强抗病性的后代。
这种杂交可以在农业、畜牧业和林业等领域中应用，以提高作物、动物和树木的产量和耐受性。
北方杂交是指将两个具有显著不同的基因型的个体进行交配，其中一个个体来自北方而另一个来自南方。
这种杂交的目的是将两个个体的有益特性结合在一起，以产生适应北方环境的后代。
北方杂交的原理是，北方个体常常具有更好的耐冷性和更高的适应性，而南方个体则通常具有较高的生产力和更好的抗病性。
通过将这两种特性结合在一起，可以得到既具有适应北方环境又具有较高产量和较强抗病性的后代。
这种杂交可以在农业、畜牧业和林业等领域中应用，以提高作物、动物和树木在寒冷地区的适应性和产量。
南方杂交和北方杂交的应用在农业方面具有重要意义。
通过这些杂交方式，人们可以选择具有不同特性的个体进行交配，以产生具有更好适应性和生产力的后代。
这可以提高农作物的产量和耐受性，并减少对农药和化肥的需求。
此外，这些杂交还可以提高作物的抗病性，减少病害对农作物的危害。
在畜牧业方面，南方杂交和北方杂交可以提高家畜的适应性和产量，改善肉质和乳质，并减少疾病的传播。
在林业方面，这些杂交可以提高树木的生长速度和适应性，增加木材的产量和质量。
总之，南方杂交和北方杂交是两种重要的杂交方式，它们利用不同地理区域的个体的有益特性，通过交配将这些特性结合在一起，产生更适应广泛环境的后代。
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Sourthern blot和Northern blot原理
（一）Southern Blot
原理：
将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大
小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
DNA => 琼脂糖电泳 => 印迹转移 => 预杂交 => 杂交（变性探针） => 洗膜 => 放射自显影或显色
（二）Northern Blot
原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
mRNA提取 => 甲醛变性电泳 => 印迹转移 => 预杂交 => 杂交（变性探针） =>
洗膜 => 放射自显影或化学发光
（三）二者异同
Southern blot 是分析DNA的杂交技术，Northern blot是分析RNA的，而Western blot是分析蛋白质的
Southern 和Northerin原理基本相同，都是利用DNA或RNA的复性过程，但过程上也有区别，主要是
Southern是先电泳后变性，而Northern是先变性后电泳；
Southern是碱变性，而Northern采用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜等变性，因为采用碱变性会导致RNA水解
（四）探针标记技术
1 标记物：放射性和非放射性两种
放射性：
非放射性：生物素、地高辛素、荧光素
2、标记方法
（1）切口平移法
（2）随机引物法
（3）末端标记法
（4）单链DNA探针标记
（5）寡核苷酸探针标记法。