铜绿假单胞菌的耐药性与金属β-内酰胺酶检测
铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制研究

ʌ综述ɔ铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制研究∗徐雁峰1ꎬ王慧敏2ꎬ张㊀冬2(1.内蒙古科技大学包头医学院ꎬ内蒙古包头014000ꎻ2.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院呼吸科)㊀㊀DOI:10.16833/j.cnki.jbmc.2019.09.048㊀㊀铜绿假单胞菌(PseudomonasaeruginosaꎬPA)是目前临床上常见的革兰阴性杆菌ꎬ是最常见的引起严重院内获得性感染的条件致病菌之一ꎮ在机体抵抗力下降或免疫功能受损或是侵入性操作时(如留置尿管㊁呼吸机辅助通气)易引起各种感染ꎬ如泌尿系感染㊁呼吸道感染㊁脑膜炎㊁烧伤感染等ꎬ其中以下呼吸道感染最为常见ꎬ包括支气管扩张合并感染㊁慢性阻塞性肺疾病合并感染㊁呼吸机相关性肺炎等ꎬ且主要分布于重症监护病房ꎮ铜绿假单胞菌具有易定值ꎬ易变异ꎬ易耐药特点[1]ꎮ该菌可随着医护人员的手接触㊁医疗用水㊁机械通气等直接或间接性传播ꎻ在国外ꎬ慢性铜绿假单胞菌的定植是囊性纤维化(CF)肺病过程中的核心因素ꎬ是导致CF患者发病率和死亡率上升的主要原因ꎮZavascki等[2]进行的研究表明ꎬ抗生素的选择压力和长时间使用加快了细菌突变的速度ꎮ因此抗生素的滥用ꎬ使得铜绿假单胞菌基因发生突变ꎬ导致耐药性在细菌间进行水平转移ꎬ使得铜绿假单胞菌耐药现象逐渐突显ꎬ出现多重耐药铜绿假单胞菌(Multidrug-resist ̄antpseudomonasaeruginosaꎬMDRPA)ꎬ给人们的安全带来巨大的威胁ꎬ引起了感染相关专家对公共卫生的关注ꎮ由其所引起的疾病具有难治愈㊁高致死率及迁延不愈性等特点ꎬ给临床治疗带来巨大困难ꎬ严重威胁人类的健康ꎮ㊀㊀碳青霉烯类抗生素(Carbapenemantibiotic)是抗菌谱最广㊁抗菌活性最强的一类β-内酰胺类抗生素ꎬ曾一度是治疗铜绿假单胞菌感染的首选药物ꎮ20世纪70年代末期ꎬ默克公司研究人员从牲畜链霉菌中发现一类新的β-内酰胺类抗生素-硫霉素ꎬ这是历史上第一个碳青霉烯类抗生素ꎮ1987年ꎬ该公司通过对硫霉素的半合成结构修饰ꎬ成功开发出第一个用于临床的碳青霉烯类抗生素-亚胺培南ꎬ之后碳青霉烯类药物开始被陆续开发并广泛应用于临床各科室ꎬ目前以亚胺培南和美罗培南为代表的碳青霉烯类抗生素被临床广泛用于治疗铜绿假单胞菌感染ꎬ尤其在重症感染患者治疗上发挥了重要作用ꎮ然而近年来ꎬ世界各地逐渐出现了耐碳青霉烯类抗生素铜绿假单胞菌(Car ̄bapenem-resistantpseudomonasaeruginosaꎬCRPA)ꎬ2017年世界卫生组织(WHO)制定了一份关于全球耐药菌的排列名单ꎬ耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌与耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌ꎬ耐碳青霉烯类㊁第三代头孢菌素的肠杆菌科细菌排在最前ꎮ耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的出现使得临床上对感染性疾病的治疗变得愈加困难ꎮHong等[3]通过对50个国家临床CRPA分离株的耐药情况进行分析ꎬ发现在巴西㊁秘鲁㊁哥斯达黎加㊁俄罗斯㊁希腊㊁波兰㊁伊朗和沙特阿拉伯等地铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物的耐药率均高于50%ꎮ美国IN ̄FORM(Internationalnetworkforoptimalresistancemoni ̄toring)监测了2012~2015年79个美国医疗中心铜绿假单胞菌对美罗培南的耐药率ꎬ结果显示耐药率从18.0%上升到19.1%[4]ꎮ2015年㊁2016年㊁2017年中国细菌耐药性监测CHINET结果显示ꎬPA对亚胺培南的耐药率为27.6%㊁28.7%㊁23.6%ꎬ对美罗培南耐药率为23.4%㊁25.3%㊁20.9%ꎮ一项对全球CR ̄PA的流行病学报道显示ꎬ南美洲㊁欧州和西南亚地区是CRPA的主要地区ꎬ对碳青霉烯类抗生素的耐药率最高可达75.3%ꎮ可见铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素具有很高的耐药性ꎮ㊀㊀CRPA的出现ꎬ给临床抗感染带来了严峻的考验ꎬ因此研究铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制具有重要意义ꎬ本文就其耐药机制做一综述ꎮ1 产生碳青霉烯酶㊀㊀铜绿假单胞菌可产生β-内酰胺酶㊁氨基糖苷类钝化酶等多种酶ꎬ其中产β-内酰胺酶是PA耐药的主要机制ꎬ此酶可以通过水解或非水解方式破坏β-内酰胺酶的β-内酰胺环使抗菌药物失活而无法发挥抗菌作用ꎮ目前对于β-内酰胺酶的分类法主要有两类ꎬAmbler分子结构法是1980年Ambler提出的ꎬ根据β-内酰胺酶氨基酸序列分为A-D类ꎬ其中A类㊁C类和D类β-内酰胺酶是依赖丝氨酸发挥作用ꎬ而B类β内酰胺酶是依赖金属离子发挥作用ꎬ是引起铜绿假单胞菌获得性耐药的主要酶ꎮ另一种分类方法是∗基金项目:内蒙古自治区自然科学基金项目[2017MS(LH)0803]通讯作者:张㊀冬Bush分类法ꎬ是Bush于1995年提出ꎬ他以酶作用的底物㊁抑制剂谱的不同将β-内酰胺酶分为四个大类(1-4)及六个亚类(a-f)ꎬ主要包括超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)㊁金属酶(MBLs)㊁头孢菌素酶(AmpC)ꎬOXA型内酰胺酶等ꎮ碳青霉烯酶是一类能水解碳青霉烯类抗生素的β内酰胺酶ꎬ主要是指Ambler法的A㊁B㊁D类ꎮ1.1㊀A类碳青霉烯酶㊀A类碳青霉烯酶包括KPC型㊁GES型㊁SME型㊁IMI型㊁SFC型等ꎬ其中以KPC型和GES型最为常见ꎬ以质粒形式存在ꎬ造成大范围耐药铜绿假单胞菌的传播ꎮ近年来对KPC型碳青霉烯酶报道较多ꎬKPC多见于肺炎克雷伯杆菌ꎬ1996年首次在美国的一种肺炎克雷伯菌中检测到ꎮ2006年ꎬ哥伦比亚国际医学研究和教育中心首次报道KPC-2在假单胞菌中的存在情况ꎬ2011年浙江大学医学院附属第一医院报道了首例产blaKPC-2型碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌ꎬ之后KPC在铜绿假单胞菌的报道逐渐增多[5]ꎮKPC酶属于Ambler-A类ꎬBush-2f类ꎬ位于质粒或染色体上ꎬ染色体编码的KPC可能有利于产KPC铜绿假单胞菌高风险克隆的扩散ꎮGarcia等[6]通过比较产生KPC酶的肺炎克雷伯菌感染爆发之前和之后铜绿假单胞菌分离株的耐药性ꎬ发现爆发后铜绿假单胞菌获得了KPC基因ꎬ从而表明了KPC基因可在细菌间传播导致铜绿假单胞菌获得对碳青霉烯类抗生素高水平的耐药性ꎮ目前已经鉴定出至少23种KPC蛋白变体ꎮ1.2㊀产金属β-内酰胺酶(metal-β-actamasesꎬMBLs)㊀金属β-内酰胺酶(metal-β-actamasesꎬMBLs)是以金属离子为活性中心的酶ꎬ可以水解大部分β-内酰胺类抗生素ꎬ且需要依赖金属离子Zn2+发挥作用ꎮ首次发现是因蜡样芽胞杆菌产生能被ED ̄TA抑制的β-内酰胺酶ꎬ之后世界各地相继报道了能产生MBLs的各种细菌ꎮ编码MBLs的基因位点存在于铜绿假单胞菌的质粒㊁转座子或染色体上ꎬ以基因盒存在于整合子之中ꎬ大部分位于Ⅰ类整合子ꎬ通过整合子传递作用ꎬ使耐药性在革兰阴性细菌间水平传播扩散ꎬ引起铜绿假单胞菌的多重耐药(MDR)甚至泛耐药(XDR)ꎬ进而导致感染的爆发ꎬ使得临床治疗变得复杂化ꎮMBLs可分为天然和获得性金属酶ꎬ获得性MBLs主要为质粒介导的ꎬ随着质粒的移动将耐药基因播散在各个菌株ꎬ是临床上最多见的ꎮ天然MBLs为染色体编码的ꎬ存在于一些临床非重要致病菌中ꎬ不具有传导性ꎬ没有致病性ꎬ是细菌为适应生存环境而产生的酶ꎮ获得性MBLs是铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素产生获得性耐药的主要原因ꎮ脉冲场凝胶电泳实验(PFGE)发现ꎬ产MBLs铜绿假单胞菌在遗传学上紧密相关ꎬ表明MBLs基因的扩散是由耐药菌株的克隆传播或耐药基因在不同菌株间传递引起的[7]ꎮMBLs属于Ambler-B类ꎬBush-3类ꎬ目前发现的获得性金属酶包括IMP㊁VIM㊁GIM㊁SPM㊁SIM㊁NDM-1㊁FIM-1ꎬ临床最常见的是IMP和VIMꎮ近年来发现了MBLs的亚类ꎬ进一步说明了MBLs的持续多样化以及这些酶在革兰氏阴性菌种中的持续全球传播ꎮ㊀㊀IMP-1是1991年日本研究者在粘质沙雷菌体内发现了第一个获得MBLsꎬ之后不断发现新的获得MBLsꎬ这些金属酶的宿主也从粘质沙雷菌扩大到了铜绿假单胞菌等肠杆菌科细菌ꎬ而铜绿假单胞菌是主要宿主ꎮ目前已发现了IMP五十几种亚型ꎬ分别由相应编码基因的不同位点发生突变产生ꎮ1999年意大利在铜绿假单胞菌中发现首个VIM-1型酶ꎬ随后在美国㊁法国㊁英国㊁意大利等国家相继发现铜绿假单胞菌产不同亚型VIM基因ꎮ目前已发现了VIM四十几种ꎬVIM-2是铜绿假单胞菌中分布最广的MBLꎬ并且是多次爆发的来源ꎮ㊀㊀NDM-1是一种新型金属酶ꎬ最初在2009年从一位感染肺炎克雷伯杆菌的瑞典患者分离发现ꎬ之后在铜绿假单胞菌㊁鲍曼不动杆菌和大肠杆菌中均有发现ꎮ2011年ꎬ首次在塞尔维亚患者中记录了铜绿假单胞菌中NDM-1的存在ꎬ之后在世界各地耐药铜绿假单胞菌均有发现ꎬNDM-1可以水解大部分β内酰胺类抗生素包括碳青霉烯类抗生素ꎬ是最广谱耐药的金属酶ꎮNDM-1位于质粒上ꎬ不仅可以在细菌间转移ꎬ而且能使所在宿主菌成为超级细菌ꎬ严重威胁着人类健康ꎮFIM-1是2012年从佛罗伦萨血管移植物感染患者培养的多重耐药铜绿假单胞菌中分离出一种新型金属酶ꎬ位于染色体上ꎬ与NDM表现出最高的相似性(约40%氨基酸同一性)ꎬFIM-1具有广泛的底物特异性ꎬ优选青霉素和碳青霉烯类[8]ꎮ㊀㊀KHM-1是1997年在日本的多重耐药柠檬酸杆菌分离物中鉴定出来的ꎬ之后再未报道过ꎮPfennigw ̄erth等[9]在铜绿假单胞菌分离物发现了新的金属酶HMB-1ꎬ与KHM-1在核苷酸水平上的同一性为73.6%ꎬ在氨基酸水平上的同一性为74.3%ꎬ但在碳青霉烯酶水解方面表现出明显差异ꎬ通过测定最低抑菌浓度(MIC)发现HMB-1对亚胺培南的水解高于KHM-1的2倍ꎬ而对美罗培南㊁厄他培南的水解效率非常相似ꎮ1.3㊀产OXA型酶㊀OXA型酶属于AmblerD类ꎬBush2d类ꎬ因对苯唑西林或是氯唑西林等有很强的水解能力而得名ꎮOXA型超广谱β-内酰胺酶ꎬ是从20世纪80年代后期随着DNA测序技术的发展才从丝氨酸β-内酰胺酶中分离出来ꎬ并单独成为一类ꎮ之后该酶在世界范围内陆续被检测到ꎬ如法国㊁西班牙㊁英国等许多国家均检出ꎬ近日秘鲁发现了同时表达OXA-1的铜绿假单胞菌[10]ꎮ国内在安徽㊁湖南㊁郑州㊁苏州㊁贵州等地也曾报道过OXA型酶ꎮOXA型酶主要分布在鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌ꎮBert等[11]阐述了OXA型酶分5组ꎬ其中OXA-5㊁OXA-10㊁OXA-11㊁OXA-14㊁OXA-16㊁OXA-17㊁OXA-31等见于铜绿假单胞菌内[12]ꎮOXA-198是2011年El等[13]新发现的D类β内酰胺酶ꎬOXA-198基因位于IncP-11型质粒携带的Ⅰ类整合子上ꎬ易于在铜绿假单胞菌或大肠杆菌中转化ꎮ最近ꎬBonnin等[14]描述了产生OXA-198的铜绿假单胞菌与医院相关的丛集事件ꎬ揭示OXA-198的产生使碳青霉烯类药物敏感性降低ꎮ2㊀膜通透性下降㊀㊀细胞膜是药物进入细菌内发挥作用的第一道屏障ꎬ铜绿假单胞菌的细胞内膜由具有流动性的脂质双分子层组成ꎬ外膜包括脂蛋白㊁外膜蛋白和脂多糖等ꎬ脂多糖为6~7条链相互共价连接而成的脂肪酸链组成ꎬ这可降低外膜的流动性ꎬ阻碍脂溶性药物通过细菌外膜ꎮ碳青霉烯类抗生素进入体内发挥作用的靶位是位于内膜上的青霉素结合蛋白(PBPs)ꎬ需先通过外膜才能到达靶点ꎬ所以任何导致铜绿假单胞菌外膜通透性降低的因素都会导致抗菌药物无法到达作用位点ꎬ从而使细菌对该种抗生素耐药ꎮ2.1㊀膜孔蛋白的丢失㊀铜绿假单胞菌外膜上有许多微孔通道蛋白ꎬ如OprC㊁OprD2㊁OprEꎬ其中外膜孔通道OprD2是以亚胺培南为代表的碳青霉烯类抗菌药物进入PA唯一通道ꎮOprD2的基因突变或者缺失致使OprD2功能缺失或表达下调造成细胞外膜对抗菌药物通透性下降ꎬ是铜绿假单胞菌对亚胺培南等碳青霉烯类抗生素耐药的重要机制ꎮOprD2的缺失突变体现在编码区的一段片段缺失导致移码突变ꎬ形成新的密码子从而引起肽链异常ꎬ导致铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药ꎮLiu等[15]通过对17株耐亚胺培南㊁美罗培南的铜绿假单胞菌分析显示其中14株OprD2蛋白的基因由于移码ꎬ无义突变或大缺失㊁或是缺少终止密码子而导致密码子编码提前终止ꎬ进一步表明OprD2的丢失使铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素产生耐药性ꎮ因此认为Oprd2是造成PA对亚胺培南耐药的重要因素ꎮOprD2的基因突变体现在OprD2结构基因㊁调控基因㊁调控因子等突变ꎬ进而影响OprD2蛋白水平或空间构象的改变ꎮ此外插入OprD2的序列(IS)元件也可导致OprD2基因失活ꎬ世界范围内均有报告不同的插入元件ISꎬ南非(ISPa26)㊁克罗地亚(ISRP10)㊁伊朗(ISPa1328)㊁西班牙(ISPa133)㊁中国(ISPa1328㊁ISPre2)等ꎮShariati等[16]在OprD2蛋白基因中发现了一个新的插入序列ISPpu21与铜绿假单胞菌的碳青霉烯耐药性密切相关ꎮ2.2㊀主动外排系统过度表达㊀铜绿假单胞菌细胞膜上存在着将抗菌药物排出体外的外排泵系统ꎮ根据染色体的不同同源性ꎬ可将外排泵系统分为易化子超家族(MFS)㊁耐药结节化细胞分化家族(RND)㊁ATP结合盒超家族(ABC)㊁多重药物和毒性化合物外排家族(MATE)和小多重性耐药家族(SMR)五个超家族ꎬ其中RND外排家族与碳青霉烯抗菌药物的耐药有关也是最早发现的外排泵系统ꎬ主要分布在革兰阴性菌ꎬ参与多种抗菌药物的排出ꎮ1993年Poole等在铜绿假单胞菌中发现了第一个多药外排泵MexAB-OprMꎬ之后陆续发现多个外排泵系统如:MexAB-oprM㊁MexXY-oprM㊁MexCD-oprJ㊁MexEF-OprN等ꎮ外排泵系统由膜融合蛋白如MexA㊁MexCꎬ转运蛋白如MexB㊁MexD和外膜蛋白如OprD㊁OprJ三部分组成ꎬ三种蛋白协同作用将进入菌体内的碳青霉烯类药物排除体外ꎬ任一环节出现问题即可导致多重耐药甚至泛耐药ꎮBabak等[17]研究显示62%的个体外排泵MexAB-OprM基因过度表达ꎬ与先前报道的这些基因的过度表达超过50%相符ꎮMexXY-OprM系统和MexAB-OprM系统共用OprM作为其外膜通道蛋白ꎬ因此MexAB-OprM低表达也降低MexXY活性ꎬ此外MexCD-OprJ过表达可明显使MexAB-OprM产生不足ꎮ外排泵系统具有可诱导性ꎬ抗生素的不规范使用可诱导其表达增加ꎬ曾章悦等[18-19]通过体外碳青霉素诱导实验对敏感铜绿假单胞菌进行诱导ꎬ发现铜绿假单胞菌经其诱导后对美罗培南的最低抑菌浓度升高ꎬ考虑铜绿假单胞菌对美罗培南的耐药与外排泵表达量增加有关ꎮ3㊀细菌生物被膜(bacterialbiofilmꎬBF)形成㊀㊀1978年Costerton首先提出生物被膜这一概念ꎬ细菌生物被膜(bacterialbiofilmꎬBF)是指细菌附着于惰性物体或生物物体表面如医疗设备ꎬ留置导管或坏死的组织上ꎬ繁殖并分泌一些多糖基质和纤维蛋白等细胞外聚合物ꎬ将细菌粘连包裹其中而形成的膜样物ꎮBF结构坚韧稳固ꎬ长期存在可作为细菌的保护伞使其逃避宿主免疫应答㊁抵挡抗菌药物的杀菌作用而难以根除ꎬ对抗生素产生耐药ꎬ进而导致难治性感染和慢性㊁持续性感染ꎮ铜绿假单胞菌生物被膜细胞外聚合物(EPS)可延缓包括抗生素的扩散ꎬ导致细菌对抗生素耐受ꎮEPS是由胞外多糖㊁蛋白质㊁核酸组成ꎬ其中主要成分胞外多糖包括polysaccharidesynthesislocus(Psl)ꎬpellicleFormation(Pel)和藻酸盐(Alginate)ꎬ尤其是Ps1对铜绿假单胞菌中BF形成具有重要作用ꎮPsl多糖的过量产生导致铜绿假单胞菌的细胞表面和细胞间粘附增强ꎬ形成微菌落ꎬ稳固生物被膜结构的同时对抗生素产生耐药ꎮ研究发现形成生物被膜的多糖物质Psl可作为一种信号分子通过调节鸟苷酸的产生形成一种正反馈ꎬ进一步促进细菌产生细胞外基质形成生物被膜ꎬ这对于研究铜绿假单胞菌的耐药具有重要作用[20]ꎮc-di-GMP信号通路被发现是导致生物膜形成的主要机制ꎮ藻酸盐(Alginate)是EPS主要成分ꎬ可以形成稳固的保护屏障阻碍抗生素穿透生物被膜ꎬ难以对包裹其中的细菌产生抗菌作用ꎬ导致感染反复发作ꎮ小RNA(sRNA)是铜绿假单胞菌生物被膜形成的重要机制ꎮTaylor等[21]描述了一个新的非编码小RNA(sRNA)转录物srbA对生物膜的形成和毒力有重要影响ꎮ4㊀整合子(integron)的形成㊀㊀整合子是存在于细菌质粒㊁染色体或转座子上的一种具有识别和捕获各种耐药基因并通过移动ꎬ将耐药基因传播在同种和不同种细菌间ꎬ最终导致临床上耐药现象的泛滥ꎮ整合子是Stokes和Hall于1989年首次提出的ꎬ由两端的保守区和中间的可变区构成ꎬ可变区中含有多种基因盒ꎬ大部分为耐药基因盒ꎬ在5ᶄ端保守段包含有编码整合酶的intI基因和负责基因转录的启动子ꎬ当整合子捕获到耐药基因盒后ꎬ在启动子的作用下发生转录从而使细菌获得耐药性ꎮ整合子根据其整合酶编码基因序列的不同可分为6类ꎬ其中Ⅰ类整合子最为常见且与铜绿假单胞菌耐药密切相关ꎮ目前在Ⅰ类整合子可变区中发现多种耐药基因盒ꎬ如VIM㊁IMP㊁SHV等ꎬ这些耐药基因使铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素产生高耐药水平ꎮKhosravi等[22]通过研究发现铜绿假单胞菌耐药性与整合子密切相关ꎬ发现大多数(95.7%)分离株包含Ⅰ类整合子且对美罗培南耐药性可达到(90.32%)ꎬ对亚胺培南的耐药率达(83.87%)ꎮ㊀㊀总之ꎬ铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药现象是多种耐药机制协同作用的结果ꎬ并不单纯是由一种因素造成ꎮCRPA的出现ꎬ给临床治疗造成了巨大的压力ꎬ这需要我们进一步深入研究其耐药及流行机制ꎬ为指导抗生素的合理使用及开发新的有效抗菌药物提供理论依据ꎮ近年来ꎬ多位点序列分型(Multi ̄locussequencetypingꎬMLST)被广泛用于记录细菌基因的变异ꎬ进而实现耐药菌株的追踪ꎬ对研究铜绿假单胞菌的耐药机制具有重要意义ꎮ多位点序列分型是Maiden等人在1998年提出的用于分析基因的核苷酸序列ꎬ进而发现细菌基因的变异ꎮMLST通过使用管家基因中的序列变异来定义类型ꎬ以ST编号为基本分析单位ꎬ每一个ST标号代表一种核苷酸序列信息ꎬ目前应用于耐药菌株的追踪ꎮ通过对铜绿假单胞菌的7个管家基因(acsA㊁aroE㊁guaA㊁mutL㊁nuoD㊁ppsA和trpE)进行PCR扩增纯化ꎬ产物测序后与BLAST对比得出七个管家基因等位基因谱编号ꎬ依据编号的组合即能够得到ST型ꎬ进而实现对全球铜绿假单胞菌的流行趋势及毒力进化变异的追踪调查ꎮ在铜绿假单胞菌中ꎬMBLs的产生通常与序列类型(STs)111㊁175㊁357和235的多耐药高风险克隆相关ꎬ表明高风险克隆在成功传播临床重要抗药性决定因素中的重要作用ꎮPapagiannitsis等[23]发现捷克医院中携带IMP-7的铜绿假单胞菌中ST357克隆编码整合子In-p110ꎬ证明大多数ST357分离株与IMP型MBLs的产生相关ꎮVanegas等[24]研究表明高抗生素选择压力有利于多克隆的出现ꎬ这些克隆能够分别含有KPC和VIM碳青霉烯酶ꎬ主要是ST235和ST111ꎬ但同时出现其他克隆如ST1755㊁ST463ꎮ序列类型235(ST235)是重要的铜绿假单胞菌克隆ꎬ铜绿假单胞菌ST235可以通过突变和获得当地耐药基因ꎬ对碳青霉烯类抗生素产生耐药性[25]ꎮ在ST235中已经描述了多种碳青霉烯酶ꎬ最常见的是VIMꎬ其次是IMPꎬOXAꎬGESꎬKPC和NDMꎮ目前发现质粒编码的产NDM-1的铜绿假单胞菌MLST分型有ST235ꎬ染色体编码的KPC基因可能有利于产生KPC的铜绿假单胞菌ST235扩增时的传播ꎮHu等[26]首次报道了产生KPC-2的ST463铜绿假单胞菌分离株的克隆ꎬ该克隆在浙江省快速出现和传播ꎮ参考文献[1]㊀中华医学会呼吸病学分会感染学组.铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊治专家共识[J].中华结核和呼吸杂志ꎬ2014ꎬ37(1):9-16.[2]㊀ZavasckiAPꎬCarvalhaesCGꎬPicãoRCꎬetal.Multidrug-re 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耐亚胺培南铜绿假单胞菌的鉴定和药敏分析

鉴定步骤
样本采集与处理
从感染部位采集样本,进行适当处理,如匀浆、 离心等。
初步鉴定
通过观察菌落形态、革兰氏染色等初步判断是否 为铜绿假单胞菌。
细菌分离与培养
将处理后的样本接种于选择性培养基上,进行细 菌分离与培养。
生化鉴定与分子生物学鉴定
利用生化鉴定方法和分子生物学方法进行进一步 确认。
鉴定结果
80%
确定菌种
通过综合传统微生物学方法、生 化鉴定方法和分子生物学方法的 鉴定结果,确定菌种为铜绿假单 胞菌。
100%
明确耐药性
通过药敏试验等方法明确铜绿假 单胞菌对亚胺培南等药物的耐药 性。
80%
提供治疗建议
根据鉴定结果和药敏试验结果, 为临床医生提供合理的治疗建议 。
03
药敏分析方法
药敏试验原理
表示待检菌不能被常规剂量的 抗生素所抑制,MIC值远高于 参考范围。
04
耐亚胺培南铜绿假单胞菌的药敏特性
药物敏感性
敏感药物
耐亚胺培南铜绿假单胞菌对部分抗生素仍表现出敏感性,如氨基糖苷类、喹诺 酮类等。这些药物在体外试验中显示出较好的抗菌活性,可用于治疗该菌引起 的感染。
敏感程度差异
不同菌株对同一药物的敏感程度可能存在差异,这可能与菌株的遗传特性和药 物作用机制有关。因此,在治疗过程中需要根据药敏试验结果选用合适的抗生 素。
提高患者免疫力
加强营养支持、积极治疗原发 病等,提高患者抵抗力。
加强环境监测和消毒
定期对医院环境进行监测和消 毒,消除污染源。
06
总结与展望
研究成果总结
耐亚胺培南铜绿假单胞菌的鉴定方法
通过生化试验、分子生物学方法和药敏试验等多种手段,成功鉴定出耐亚胺培南铜绿假 单胞菌。
ICU患者下呼吸道感染铜绿假单胞菌耐药分析及临床对策

ICU患者下呼吸道感染铜绿假单胞菌耐药分析及临床对策摘要目的:了解医院icu下呼吸道感染患者铜绿假单胞菌耐药性。
方法:回顾性调查医院icu下呼吸道感染患者痰标本培养情况,对分离的171株铜绿假单胞菌药敏试验结果进行统计分析。
结果: icu下呼吸道感染患者痰标本培养所分离的171株铜绿假单胞菌对碳青霉烯类的美罗培南耐药率31.6%;哌拉西林耐药率49.7%;庆大霉素耐药率46.8%;3代头孢菌素类头孢哌酮耐药率31.6%,头孢吡肟耐药率34.5%,头孢他定耐药率44.4%,头孢曲松耐药率75.4%,头孢噻肟耐药率85.4%。
结论:治疗铜绿假单胞菌引起的下呼吸道感染,在结合药物敏感试验结果的同时应考虑该菌的耐药机制;同时应加强抗菌药物的管理。
关键词 icu 下呼吸道铜绿假单胞菌耐药分析随着感染菌的变迁,铜绿假单胞菌引起的下呼吸道感染呈上升趋势,icu患者更易造成铜绿假单胞菌引起的下呼吸道感染。
对171例来自icu的下呼吸道感染铜绿假单胞菌者的耐药状况及临床采取的对策进行了综合分析。
资料与方法2010~2011年icu下呼吸道感染者171例铜绿假单胞菌,不包括重送检的菌株。
质控菌株:铜绿假单胞菌atcc27853。
药敏纸片:头孢噻肟、头孢曲松、替卡西林/棒酸、哌拉西林、庆大霉素、头孢他定、头孢吡肟、左旋氧氟沙星、环丙沙星、头孢哌酮、美罗培南、亚胺培南、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、头孢哌酮/舒巴坦。
培养基:血琼脂平皿、巧克力、mh和麦康凯平皿,琼脂为哥伦比亚琼脂,羊血。
仪器:全自动细菌鉴定及药敏测试仪vitek2 compact 60和配套鉴定卡。
方法:①细菌鉴定:采用常规培养分离及vitek2 compact 全自动细菌鉴定及药敏测试仪和配套鉴定卡进行分析鉴定。
②抗菌药物敏感性试验:采用世界卫生组织推荐的k-b(kirby-bauer)纸片法,严格按照美国临床实验室标准化委员会药敏试验规定的标准进行。
铜绿假单胞菌产金属β-内酰胺酶的临床调查研究

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国际检验 医学 杂志 20 07年 1 0月第 2 8卷 第 l O期
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铜 绿 假单 胞 菌 产金 属 ~ I内酰胺 酶 的临 床 调查 3 研 究
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铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的机制及临床研究

铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的机制及临床研究[关键词] 铜绿假单胞菌;耐药性;美罗培南;亚胺培南各种抗假单胞菌药物在治疗铜绿假单胞菌感染过程中或治疗后可出现不同程度的耐药导致治疗失败,但各种药物诱导耐药的相对危险性可有差异。
了解铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的机制,及时掌握新的耐药动向及其相关因素,有助于制定切合实际的控制耐药方案。
1铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的机制OprD为铜绿假单胞菌外膜孔道蛋白,可被动性摄取碱性氨基酸,亦可渗透碳青霉烯类药物。
对亚胺培南的渗透率为736nm/s,对美罗培南为73nm/s,表明亚胺培南透入铜绿假单胞菌比美罗培南快10倍。
OprD丢失后,两者的渗透率分别为6nm/s及5.5nm/s,对亚胺培南的MIC从1-2mg/L上升到8-32mg /L,对美罗培南的MIC从0.12~0.5mg/L上升到2~4mg/L。
铜绿假单胞菌OprD丢失或下降是介导对亚胺培南耐药的主要机制,对美罗培南的影响较少可能与通过尚未确定的通道进入菌体有关。
因单纯OprD丢失不影响对非碳青霉烯类药物的敏感性,属窄谱耐药机制。
亚胺培南为强力β-内酰胺酶诱导剂,诱导铜绿假单胞菌产生Bush IB-内酰胺酶,Bush I酶可快速水解抗假单胞菌头孢菌素类及青霉素类药物,但对亚胺培南只具缓慢水解作用。
铜绿假单胞菌外膜孔道蛋白(OprD)丢失可引起对亚胺培南耐药,但若单纯OprD丢失而无β一内酰胺酶参入,则对亚胺培南的MIC只由0.25mg /L增至0.5mg/L,若OprD丢失同时伴口一内酰胺酶的作用,则可使其MIC 增至16mg/L,表明β-内酰胺酶与渗透性改变介导对亚胺培南耐药具协同作用。
美罗培南比亚胺培南对β-内酰胺酶更稳定,OprD丢失伴β-内酰胺酶作用仅使铜绿假单胞菌对美罗培南的MIC增至2-4mg/L。
产金属β-内酰胺酶的菌株亦可能需要OprD丢失才对碳青霉烯类耐药,虽然产金属酶类药物仍属少见,但正在成为铜绿假单胞菌对亚胺培南及美罗培南高度耐药的原因,并可能成为今后严重的问题。
金属β-内酰胺酶综述

金属类β-内酰胺酶β-内酰胺酶是革兰阴性杆菌对内酰胺类抗生素耐药的主要机制,细菌产生的β-内酰胺酶大部分系活性部位带丝氨酸残基的酶类,也有一小部分是活性部位为金属离子的酶类,称为金属β-内酰胺酶(metallo-β-lactamase,MBL),简称为金属酶。
金属β-内酰胺酶,属Bush分类3群,Ambler分类B类,该群酶最大特点是可以水解碳青霉烯类等抗生素,而对哌拉西林和氨曲南影响较小。
酶活性中心需金属锌离子的参与而发挥催化活性,故称为金属β-内酰胺酶。
底物为包括碳青霉烯类在内的一大类β-内酰胺抗生素,其活性不被常见的β-内酰胺酶酶抑制剂如克拉维酸等所抑制,但可被离子鳌合剂乙二胺四乙酸(EDTA)、菲咯啉或硫基化合物抑制所抑制。
金属β-内酰胺酶可由染色体和质粒介导,可在铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、粘质沙雷菌、肠杆菌属菌、肺炎克雷伯菌、嗜水气单胞菌和不动杆菌、脆弱类杆菌属、等细菌中检出此类酶。
一、发现和分布第一个报道的金属酶是从蜡样芽孢杆菌( Bacill us cereus) 中发现的,该酶为锌依赖酶。
20 世纪80 年代初期日本从嗜麦芽窄食单胞菌中鉴定出第二种锌依赖青霉素酶L1 型酶,随后又从嗜水气单胞菌和脆弱拟杆菌中鉴定出多种能水解亚胺培南的金属酶。
这些酶都由染色体基因编码。
该类金属酶分布在蜡样芽孢杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、脆弱拟杆菌、气单胞菌属和戈氏军团菌中,除嗜麦芽窄食单胞菌外,在临床上都极为罕见,而且都是单株散发的。
1991年日本学者在铜绿假单胞菌中发现了第一种质粒介导的金属酶( IMP21) ,不久又从脆弱拟杆菌中发现了一种可转移金属酶,这两个酶的发现意味着金属酶已经从单株散发向随机分布过渡。
现在已报道了10多种可转移金属酶: IMP21~8 和VIM21~3,分布在铜绿假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌科细菌中,地域分布上已经不再局限于日本,现已分布至亚洲、欧洲和美洲的多个国家(见表1)。
产金属β-内酰胺酶细菌的筛选及基因型鉴定

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现代 检 验 医 学 杂 志
第 2 6卷
第 6期
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铜绿假单胞菌的耐药

药物治疗
• 传统药物治疗
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新研发的抗假单胞菌药物
多利培南(Doripenem) 西他沙(sitafloxacin) 比阿培南(Biapenem)
PAE对氨基糖苷类抗菌药物耐药是因为产氨基糖苷类修饰酶(AME s)和作用靶位16SrRNA基因突变而致。 阿米卡星修饰酶aac(6′)和核苷转移酶ant(2′)较常见。aa c(6′)-Ⅰb引起对阿米卡星、妥布霉素耐药, aac(6′)-Ⅱ引起对庆大霉素、妥布霉素耐药,ant(2′)-Ⅰ 引起对庆大霉素、妥布霉素耐药。 普通组PAE aac(6′)-Ⅰb、aac(6′)-Ⅱ检出率为100%, ant(2′)-Ⅰ检出率为52.2%,但铜绿假单胞菌对阿米卡星、庆大 霉素、妥布霉素敏感。 泛耐药组基因检出率与耐药性成正比。产生AMEs不是细菌耐氨基糖 苷类抗菌药物的决定性因素。
铜绿假单胞菌对以下药物具有天然耐药性: 氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、第一、 二代头孢菌素、头孢噻肟、头孢曲松、萘啶酸和甲性减低
2.主动外排泵系统
3.抗菌药物作用的靶位的改变
4.产生灭活酶 5.生物膜(BF)的形成
1. 外膜通透性障碍
抗生素通过两种途径进入细菌外膜,亲水性抗生素的孔蛋 白通道和疏水性抗生素的脂质介导通道。如果这些通道改 变或缺失,抗生素将不能进入细菌到达作用靶位,从而使 细菌产生耐药性。 PA的外膜通透性极低,仅为大肠埃希菌的1%-8%,这是 PA对多种抗生素天然耐药的重要原因之一。β内酰胺类、 四环素、氯霉素、喹诺酮类只能通过孔蛋白提供的水通道 跨越外膜。
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● 潍 坊 医 学 院学 报
200 7
年
第 29 卷
第 6 期◆
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铜 绿 假 单 胞 菌 的 耐 药 性 与金 属 p 内酰 胺 酶 检测
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