细胞培养中的黑胶虫问题
黑胶虫作业
在细胞培养中常可见到一些大小不等、形态不同的黑色颗粒在细胞及培养液中做不规则运动。
镜下检查颗粒数目（100×），每视野计数在10个以上者就有可能使细胞生长受到影响。
若培养过程中，其数量继续增多则可能导致细胞停止增殖继而死亡。
人们常称这种颗粒为黑胶虫或中毒颗粒。
近年来，黑胶虫在现代细胞培养中被广泛讨论，但大多数文献未对其进行描述或仅一带而过。
从各个实验中发现，黑胶虫在不同条件或不同种类细胞的培养时对细胞培养的影响大小不一，但存在以下几个特点：（1）黑胶虫与细胞竞争生长，使细胞状态恶化甚至死亡，但不引起培养液浑浊；（2）多数情况下，抗生素对黑胶虫无效；（3）一般单用培养液及血清培养不会得到黑胶虫；（4）黑胶虫在培养体系中多做典型的布朗运动。
科学家们至今尚未对黑胶虫进行分类学上的归类，但对其身份有多种猜测。
一．非生物有部分科学家认为，任何一种外来生物在培养基中都会有生命活动的反应和表现，而不是简单的运动。
如果黑胶虫的运动状况已达到用显微镜可观察到的程度，其营养代谢和能量需求也可想而知，那么，培养液中营养的消耗将加大、酸碱含量都将发生明显变化。
比如出现迅速、大含量的沉淀，pH值的迅速下降，细胞大量破碎死亡，引发其他微生物侵染等。
但这些状况在黑胶虫感染中很难观察到。
因此，有科学家提出黑胶虫为非生物。
（1）细胞碎片说在从37℃环境中取出细胞进行观察时，由于液体培养基比热大，液内环境高于外界温度，造成冷热交换、小范围内形成液体流动加剧，即出现观察到的“虫体”游动。
同时随着细胞培养的继续，部分细胞开始衰亡，细胞膜结构破裂。
破裂之后的细胞内容物泄露到培养液中。
尤其是溶酶体的破坏，连续性地造成其他细胞和细胞器的损伤，如果换液不很勤，又会出现进一步破坏和更多的残渣，即表现为“虫体”增多，同时细胞状态恶化甚至死亡。
（2）无机物说在1990年发表于细胞生物学杂志上的《对细胞培养中一种黑色运动颗粒性质的研究》中，青岛医学院肿瘤研究室指出，细胞培养中的黑色运动颗粒为硅复合物。
黑胶虫污染
细胞培养中的黑胶虫污染及解决方案点击次数：2365 发布时间：2011-4-2细胞培养中的黑胶虫污染摘要：预防和避免污染是细胞培养成功的关键，黑胶虫(也称黑焦虫)是近几年来几乎出现在每个细胞培养实验室。
但是现在无法对黑胶虫的确认和鉴别，导致学术界说法不一，笔者收集了关于黑胶虫的资料，对黑胶虫进行类系统描述，对黑胶虫出现的情况对细胞培养的影响以及黑胶虫污染后的有效处理进行介绍。
关键词：黑胶虫污染处理细胞培养The pollution of black dots in cell culture(Grade 2005, Biotechnology, School of Life Science and Engineering)Abstract Pollution prevention is the key to success in cell culture, black dots (also called black particles) almost appeared in every cell culture laboratory in past few years .But now no one able to confirm and identify what the black dots is. This lead to appear different academic arguments.The author collected information about the black dots to make a description about black spots which similar to the systemic description,and Introduce when aand where the black dots come out. At the same time give some advice to deal with the black dots.Key words Pollution black dots cell culture前言污染是细胞培养的大敌。
13(1).细胞培养中出现小颗粒的原因1
细胞培养的过程中，经常见到黑色的颗粒或小黑点，已成为很多细胞培养初学者的困扰，这种情况是怎么引起的呢？该如何避免呢？产生原因：1.细胞状态：细胞自身具有分泌功能，或细胞营养不良，生长状态欠佳，细胞老化都有可能在培养过程中出现小黑点。
2.血清沉淀：通常经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多。
有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖。
一般而言，此小黑点应不会影响细胞的生长，但若经过平行试验怀疑此血清的品质，应立即停用，更换另一批号的血清。
3：黑胶虫污染黑胶虫概况：在细胞培养的时候,有时会在400倍显微镜下看到小黑点在动,小黑点有时呈点状,有时呈小的片状,运动形式为在原地振动（类似布朗运动）,这种小黑点既不是细菌、霉菌,也不是支原体（我们曾经请周守长用血平板培养过,没有菌落出现）,目前业内人士称其为“黑胶虫”.黑胶虫到底是否为生物?这个一直是业内人士的疑惑.黑胶虫一般是存在血清里的,而血清通常是经过0.1μm 滤膜过滤的,所以血清里不可能存在细菌、霉菌及支原体等微生物.如果说黑胶虫不是生物,它会不断增多,达到一定数量时会与细胞竞争性生长,与细胞竞争培养基中的营养,从而使得细胞营养不足而死亡.不管对于黑胶虫的争论如何,但有几个是目前大家公认的：①与细胞竞争性生长,对细胞生长有不利影响.②“黑胶虫”会增殖,增殖多时,视野下一大片都为“黑胶虫”.③“黑胶虫”与血清有关,与血清质量有一定关系.4：支原体污染：如果细胞表面出现许多小黑点，细胞生长缓慢，培养液很黄，那么支原体污染的可能性就很大。
5：细胞受各种霉菌、细菌等生物污染。
此种原因大多为环境原因造成。
解决办法：1.如果小黑点有增殖趋势，那么就有可能是污染了，需要处理；如果确定是支原体解决办法很多：a 抗生素(antibiotic)除菌法：用抗生素抑制支原体。
细胞培养中常见污染
最近看到不少问有关细胞培养污染的事，正好我看到了一个有关这方面的总结，很全很好很强大，跟大家分享下细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。
孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。
，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
细胞污染及处理方法
（常见为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）
若细胞状态极差，尽早处理掉细胞，并找出污染源，对培养箱，生物安全柜，细胞房进行消毒处理。
2、真菌污染
培养基：有的培养液清亮，不变色；
成像：
处理方法：
在操作的过程中，一定要小心操作动作，轻柔缓慢，切忌大动作鲁莽。防止细胞脱落。这个拯救细胞还是主要针对无路可退的时候。污染还是重在预防！！！！！
细胞房
培养箱每两周更换一次水（高压过的双蒸水），条件允许的每两周可以用酒精擦洗一遍培养箱；
地面每两到三天用新洁尔灭拖洗一遍，桌面等同样用新洁尔灭擦洗一遍；
细胞污染及处理方法总结
洁净区，并不是没有细菌，而是细菌的数量非常少，国家标准100级的洁净标准是浮游菌数不得超过5个每立方米，沉降菌数不得超过1个每培养皿.而国外的标准比我国的还要高一点，要求的数量更少。
所以在我们的洁净操作台里，并不是真正一个细菌都没有的，所以在操作的时候还是要尽量利索迅速地完成操作。尽量减少进入培养体系细菌的数量。
霉菌污染多来自空气,所以做实验时说话聊天,或瓶口敞开时间太长,还有培养箱开关频繁是主要原因,还是多找自身原因.
4、支原体污染
支原体污染后，不会立即使细胞死亡，可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞收到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑Байду номын сангаас细胞生长等。
9）.加入10ml培养液，加入2ml双抗，放置培养箱培养，5小时之后，倒掉培养基，加入PBS洗瓶两次，然后加入胰酶消化，吹打后置于离心机800-1000r/min离心，然后洗一次。置于新的培养瓶里培养，培养体系加入2ml双抗。
细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法
细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。
孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。
，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
细胞培养污染图片及甲醛熏蒸
4.将容器放入空调送风口，快速倒入全量的甲醛溶液，关上空调机组门；
5.启动空调，关闭新风口，循环运行1－2小时，（视甲醛的反应速度）； 6.关闭空调，取出容器，空调及房间密闭8小时以上； 7.生产前4小时，打开空调，关闭回风阀进行空调全排风运行，直至空 调无甲醛气味后，空调按常规操作运行。（除甲醛时，可在空调送风口加 入适量的氨水，以快速中和残留甲醛） 操作中注意事项：甲醛加入高锰酸钾中，会迅速产生高温至溶液沸腾， 因此容器应大并应做好防护工作，以免混合的棕红色溶液溅出而污染机组。
培养液中可见一类黑色 小虫，生长迅速，镜下
快速运动，单个不成串
支原体污染
阳性
阴性
培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变 慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变 化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。
疑似黑胶虫？霉菌污染
甲醛高锰酸钾熏蒸灭菌
高锰酸钾具有强氧化性，但和福尔马林常温下反应较
用量计算： 细胞房空间=35m3 甲醛用量=10ml×35=350ml=0.35L 高锰酸钾用量=350/2=175g 温水用量=175ml
慢，但是反应放热，反应加快促进甲醛的挥发,产生甲醛 气体，甲醛能使菌体蛋白质变性凝固和溶解菌体类脂，可 以杀灭物体表面和空气中的细菌繁殖体、芽胞下真菌和病 毒,所以经一定时间后可杀死病原微生物.
甲醛加高锰酸钾熏蒸操作法：
1.准备、计算、称取甲醛与高锰酸钾量：10ml甲醛溶液中加入高锰酸钾
3－5g；
细胞培养污染图片
2010.12.6
中间长梭形是正在分裂的念珠菌
细胞污染及处理方法
细胞污染及处理方法总结洁净区，并不是没有细菌，而是细菌的数量非常少，国家标准100级的洁净标准是浮游菌数不得超过5个每立方米，沉降菌数不得超过1个每培养皿.而国外的标准比我国的还要高一点，要求的数量更少。
所以在我们的洁净操作台里，并不是真正一个细菌都没有的，所以在操作的时候还是要尽量利索迅速地完成操作。
尽量减少进入培养体系细菌的数量。
所以处理细菌污染的重要原则就是：无限地稀释细菌的浓度，无限地减少细菌的数量！一、细菌污染培养基：颜色发红，液体清亮或浑浊；显微镜下：有黑点或杆状物在到处游走，细胞部分脱落，出现细胞碎片；成像：图一：杆菌污染图二：白色链球菌以下是摘自丁香园的处理方法：1）.将污染的培养液倒掉，转烧瓶口，加入10mlPBS，适当晃动清洗培养瓶，然后倒掉。
转烧瓶口。
2）.继续加入10mlPBS，同样方法晃动，清洗培养瓶，然后倒掉。
3）.继续加入5mlPBS，同样方法洗瓶，主要是培养面，然后倒掉。
4）.重复步骤3再洗。
5）.重复步骤3再洗。
6）.加入3-5ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。
7）.加入3ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。
8）.再加入5mlPBS洗瓶，然后吸出。
9）.加入10ml培养液，加入2ml双抗，放置培养箱培养，5小时之后，倒掉培养基，加入PBS洗瓶两次，然后加入胰酶消化，吹打后置于离心机800-1000r/min 离心，然后洗一次。
置于新的培养瓶里培养，培养体系加入2ml双抗。
10）.24h之后，视情况换液，若仍然污染严重，培养基浑浊，重复以上步骤，若看不到污染物，则继续步骤1)、3）、4）、6）、8），然后加入培养液培养，培养体系加入2ml双抗.11）.24h之后，若仍污染严重，可再重复一次，若还污染只能弃之（不过一般没有出现这种情况），若镜下不见污染物，则换液PBS洗瓶，正常培养。
（常见为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）若细胞状态极差，尽早处理掉细胞，并找出污染源，对培养箱，生物安全柜，细胞房进行消毒处理。
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细胞培养中的黑胶虫问题
1.我们实验室最近一次的情况:
我们前后从上海细胞中心买了三批细胞，细胞刚到的时候，观察均生长良好，密度适中，培养液清亮，也没有见小黑点，但是对细胞传代以后就陆续出现多少不等的小黑点，有时候在一夜之间暴长，给培养液加庆大霉素，也无济于事，对贴壁细胞用生理盐水及D-hanks液冲洗七遍后见减少，但是随后几天又出现，刚开始怀疑操作有问题，但是由有经验的老师操作也出现这种问题，陆续对培养液，血清及胰酶进行培养也没发现问题。
同时培养箱也有本实验室保存的3t3细胞进行培养，生长快，很快铺满，仔细观察也可以见到少量的黑点。
后来还有从军科院过来的Hela细胞，没有使用我们的血清，直接吸出多余的培养液后，进行培养，传代后用原来吸出的培养液进行培养，同样发现了问题。
可以发现如下的特点：
（1）与细胞共生，细胞长的好或密度大的话，小黑点就少，反之则多；
（2）对抗生素无效；
（3）可能通过培养箱空气进行污染；
（4）单用培养液及血清培养没发现问题。
（5）换掖冲洗后也无效。
以下是论坛里我找来的相关帖子内容
“黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物，“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。
“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。
“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候，细胞生长就会受到影响直至死亡，严重影响了科研活动的开展和进行。
所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断，尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。
目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物，增殖缓慢但对细胞有损害，数量达到一定程度可引起细胞死亡，其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的。
该污染在全世界细胞实验室中普遍存在，解决该问题是一个世界性难题
关于是什么的问题的讨论
A. 玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西（曾经有文献报道过）
B. 据说这是黑胶虫，又有人说是原生动物，好象也没个统一的说法
C. 据病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，然而由于课题经费不够而不能继续进行下去。
D. 有人说是纳米级的细菌
其他的特点
（1）形态上有些像细菌，直径约在0.5~1微米，
（2）在400X倒置显微镜小，有典型的布朗运动（不规则的原地小距离抖动）。
（3）细胞内好像也有存在，
（4）但并不引起培养液混浊
（5）时间稍长，细胞状态明显恶化，并最后死亡
大家的处理：
1.换好一点的血清（我觉着和血清的关系不大）。
2.如果是贴壁细胞的话，可用无菌的PBS洗几次，可一定程度上缓解。
若是悬浮的话，就不太好处理拉，可以向其中少加一点滋养细胞（从小鼠腹腔内取的巨噬细胞，这种细胞不分裂，过一阵就死掉了，做抗体杂交瘤融合的同志肯定知道）。
加滋养细胞对有黑胶虫的刚复苏的细胞很有效！还有就是实验环境要注意好，保持细胞间整个环境的洁净度。
3.换用进口的一次性塑料培养瓶。
4.建议清理无菌室所有物品，重新灭菌，用KMnO4熏蒸，按首次使用无菌室做，细胞重新复苏，。
5. 在换液前先加入生理盐水并轻轻拍打，冲洗干净后再加入培养液，坚持天天洗，传代时加生理盐水再离心一次，接种密度稍大一些，一段时间后，虫子就会大大减少，对细胞的生长也不会有大的影响。
6.有材料称minocycline具有一定的作用，可以和换液结合起来使用。
杀灭黑胶虫的一种方法
估计养细胞者，很多人遇到过所谓的“黑胶虫”。
最近养细胞，不幸的是，也中奖了，看到培养瓶里仿佛一夜之间冒出来的密密麻麻的小黑东西，真是有苦难言，因为曾在园子里看过有关“黑胶虫”的帖子，不好对付，没有有效的杀灭方法，据说有专杀培养基，但又有什么好的方法可以消除实验室和培养箱内的污染呢？紫外照射、甲醛高锰酸钾熏蒸------这些方法不知其对“黑胶虫”的确切效果，有些对人有毒害，有没有一种方法，即能杀死“黑胶虫”，对人的毒性又较小呢？我想到了试试新洁尔灭（苯扎溴铵）是否可以，新洁尔灭是外用皮肤消毒剂，我们实验室常规用来擦洗手及工作台面的。
首先说明这种东西在低倍下呈黑色点状，在高倍下呈杆状，确实是在不停地运动的，有些战友不相信它会动，也有人不相信有这种所谓的“黑胶虫”，只要静下心来仔细盯住一点，你就会能注意到它确实在运动，我也录了一段相，足以可以证明，太大，160多M。
题目：杀灭、处理黑胶虫的一种新方法
目的：找到一种高效且低或无毒的杀灭处理“黑胶虫”的方法。
方法：取有“黑胶虫”污染的六孔板，每孔内有2ml培养液，向有污染的孔内分别加入0.5ml、1ml、2ml、3ml的新洁尔灭原液，边加边在倒置显微镜下观察。
结果：加入新洁尔灭时，培养液内逐渐变得有些混浊，且会有絮状的东西形成（肉眼看是白色的），这实际上是由“黑胶虫”聚集而成（见下面的图），约2-3分钟后，“黑胶虫”慢慢停止了运动。
为了进一步观察其效果，把六孔板放入37度培养箱继续培养，第二天观察发现：有些仍成团絮状但不会动；有些贴在瓶壁上也不会动；有些已由杆状变成了圆球状，象是发生了水肿一样，更不会动了，估计“黑胶虫”已死亡。
这几种剂量的新洁尔灭效果是一样的。
结论：新洁尔灭与水或培养基的比例为1：4时即可杀死“黑胶虫”（更低的浓度没有试，当时杀虫心切，就想多用点，反正也不贵，一瓶新洁尔灭才7块多钱）。
可以喷洒或擦洗用于实验室或培养箱内消毒；若细胞不珍贵且不想要了，也可以用来杀灭其中的“黑胶虫”。
若细胞珍贵，不要轻易尝试，除非你不想要了；你试了，本人概不负责。