冷冻切片技术 课件

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实验五-冰冻切片法ppt课件

实验五-冰冻切片法ppt课件
封片时要做到无气泡,无溢液、标签清楚端正,保证切片的整洁。
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四、实验结果
观察小鼠肝脏细胞的形态
.
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五、作业
实验完毕,每人交制好的玻片标本1片,在 标签纸写上玻片名称及自己的姓名和日期;
实验报告(姓名和日期)。
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8
三、实验步骤
取材:引颈致死法杀死小鼠,取其肝脏,将新鲜肝脏组织切成1~1.5cm×1~1.5cm X 0.3~0.5cm 大小。组织块可不加任何处理,直接进行冰冻切片。另一种方法是组织先经10%中性福马林或 钙福马林固定,再水洗后冰冻切片。若组织用酒精固定,则固定后须用流水彻底除去组织内的 酒精,否则因酒精冰点低,不易冰冻。
切取的组织不能过大,组织过大
快速,用时短。
不容易冻结或者组织冻结不均,
影响切片及染色效果。
组织变化不大。
能很好保存脂肪,类脂等成分。
不容易制作较薄的切片。
能够比较完好地保存各种抗原活性及 组织块在冻结过程中容易产生水
酶类,特别是对于那些对有机溶剂或
的结晶而影响细胞的形态结构及
热的温度耐受能力较差的细胞膜表面
.
5
半导体冰冻切片机构造
半导体制冷器 冷台 冷刀
制冷调节器 切片机
.
6
一、实验目的
了解半导体冰冻切片机的基本构造; 练习半导体冰冻切片法制片。
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二、实验材料及用品
实验材料:小鼠肝脏 实验用具:载、盖玻片;显微镜;毛笔;半导
体冰冻制冷器、切片机等。 实验药品:甘油明胶液。
.
抗原物质的定位,并且组织结构
抗原和水解酶保存较好。
也不如石蜡切片清晰。.Fra bibliotek3冰冻切片的适用范围

冷冻切片技术课件ppt

冷冻切片技术课件ppt
现状
现代的冷冻切片技术已经实现了自 动化、数字化和标准化,为医学研 究和诊断提供了强有力的支持。
应用领域
临床病理诊断
冷冻切片技术可用于手术中的快 速病理诊断,帮助医生确定病变 的性质和范围,为手术方案提供
重要依据。
教学
冷冻切片技术可用于制作教学标 本,为医学生和病理医生提供直
观的学习材料。
科学研究
二氧化碳冷冻喷射固定设备。
03
冷冻固定设备的特点
冷冻固定设备具有操作简便、冷冻速度快、温度低等特点,能够有效地
保持组织或细胞的结构和成分不变。
切片机与刀片
切片机
切片机是用于将冷冻固定的组织或细胞样品进行切片的仪器。其工作原理是通过将组织或 细胞样品放置在切片机的工作台上,利用机械或激光等方式将样品切成薄片。
生物科学研究
利用冷冻切片技术进行细胞结构和功能的深入研 究。
药物研发
利用冷冻切片技术评估药物对细胞的作用机制。
发展前景展望
自动化与智能化
01
通过自动化与智能化技术的引入,降低冷冻切片制备的难度和
操作成本。
高分辨成像
02
发展高分辨成像技术,以获得更清晰、更深入的细胞结构和功
能信息。
跨学科,如生物工程、神经科学
将切片贴在载玻片上
将切好的切片贴在预处理的载玻片上,使其平整、无气泡。
干燥与固定
使切片在室温下干燥,并进行必要的固定处理,如用醛类化合物 进行醛化处理,以增强切片的稳定性。
染色与观察
染色
根据研究或诊断需求,选择适当 的染色方法对切片进行染色,如 H&E染色、免疫染色等。
观察
用显微镜观察染色后的切片,根 据需要调整焦距和光源强度,观 察并记录组织结构和细胞成分等 细节信息。

《切片技术》PPT课件

《切片技术》PPT课件

•micrometer (µm )= 10-6 meter
•nanometer (nm) = 10-9 meter
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4
组织学的研究技术
• 显微镜技术: 光镜:light microscopic, LM 电镜:electronic microscopic, EM
–透射电镜(transmission electron microscope, TEM):观察细胞内部结构
– 勿挤压组织块
– 保持组织原有形态、保持组织清洁
精选ppt
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• 固定
为了阻止组织细胞的死亡后变化,防止自溶与腐败,保持组 织内细胞原有的形态结构,切取组织块后应立即进入固定液, 常用的固定方法有:
– 小块组织固定法:标本:固定液为1:4~20;最常用的方法,但组织 块不易过大过厚,最好置入冰箱冷藏室内固定,冷藏固定时间适当延 长,特别是组织化学实验用的材料,冷藏固定效果会更好。
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Embedding 包埋
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23
切片机
石蜡切片机
精选ppt
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冰冻切片机
How does a microtome work?
Microtome Arm
Tissue Block
Tissue
Section
Knife
精选ppt
Microscope Slide
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切片
…on Cryostat (frozen)
Organisms
Organs
Cells (20u) Nucleus (2 u) Bacteria (0.5 u) Organelles Viruses Macromolecules A... toms

切片ppt课件

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B、石蜡切片
• 其优点是组织结构保存良好,在病理和回顾性研究 中有较大的实用价值,能切连续薄片,组织结构清 晰,抗原定位准确。 • 用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有 不同:
• ①脱水、透明等过程应在4℃下进行,以尽 量减少组织抗原的损失;或常温条件下缩短时 间。
组织学技术及免疫组化课程
山东农业大学
• ②液氮法:
• 将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内(直 径约2cm),如组织块小可适量加OCT包埋 剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛 有液氮的小杯内,当盒底部接触液氮时即开 始气化沸腾,此时小盒保持原位切勿浸入液 氮中,大约10-20s组织即迅速冰结成块。
• 取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用, 或置入恒冷箱切片机冰冻切片。
• 其基本结构是将切片机置于-30℃C低温密闭 室内,故切片时不受外界温度和环境影响, 可连续切薄片至2-4μ m,完全能满足免疫组 织化学标记要求。一般以10-30μ m为佳。
• 切片时,低温室内温度以-15℃~18℃为宜, 温度过低组织易破碎 • 抗卷板的位置及角度要适当,载玻片附贴组 织切片,切勿上下移动。
• 其方法有二:
①.干冰-丙酮(酒精)法: ②.液氮法
山东农业大学

①干冰-丙酮(酒精)法:
• 将150-200ml丙酮(酒精)装入小保温杯内,
逐渐加入干冰,直至饱和呈粘稠状,再加干 冰不再冒泡时,温度可达-70℃,用一小烧杯 (50-100ml)内装异戊烷约50ml,再将烧 杯缓慢置入干冰丙酮(纯酒精)饱和液内, 至异戊烷温度达-70℃时即可使用。 • 将组织(大小为1cm×0.8cm×0.5cm)投入 异戊烷内速冻30-60s后取出,或置恒冷箱内 以备切片, • 或置-80℃低温冰箱内贮存。

冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理精品PPT课件

冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理精品PPT课件
• 选择不同的冷冻度 • 根据不同的组织而定
– 未经固定的脑组织、肝组织:-10- -15℃左右 – 甲状腺、脾、肾、肌肉等组织:-15~20℃ – 含脂肪组织,-25℃左右 – 含大量的脂肪 -30℃
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保持切片的完整性
• 切片破碎不全、有缺损的常见原因
– 固定不完全 – 温度设置不当 – 组织块过冷、过硬,则切片就容易破碎 – 组织块冷冻不够,硬度和韧度达不到,切片也同
样易粘、易碎 – 组织块带有皮肤、包膜、过大或冰晶过多 – 切片刀钝或较脏,切片出现刮痕,使切片不完整 – 操作手法不当,如速度不适宜
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防止切片卷缩
• 常见原因
– 切片刀钝或粘有组织碎屑 – 防卷板位置不正确或防卷板较脏 – 静电或者气流作用 – 防卷板温度高、室温高
• 采取对策:
– 保持防卷板干净、平整、无缺损、无刮伤 – 戴口罩,以避免呼出的气流直接吹到防卷板 – 切片时间过长时,应注意间隔一会儿,盖上冷冻室
3
Con. TNBS
LY
ZD7288
2014.4.20 TRPV1+CGRP
同一载玻片上 • 包括各个所有组 • 染色齐性
TNBS
ZD7288
Con. LY
L1 DRG
4
Con. TNBS
LY
ZD7288
2014.4.20 TRPV1+CGRP
TNBS
ZD7288
Con. LY
为防止冰晶的形成 • 采取如下方法
– 速冻法:将组织置入低温环境,使组织骤然降 温
– 利用高渗溶液吸收组织水分子:将组织置于 20% —30%的蔗糖溶液中,置4摄氏度冰箱足够 时间(多长时间? 判定?)
9

冰冻切片技术原理ppt课件

冰冻切片技术原理ppt课件
• 4.标本冷冻完成后将标本托固定在切片机的机头上,调整 机头的位置使其恰好位于切片刀的后方。
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6
四、冷冻切片的制作方法
• 5.以粗切削的方式进行标本的粗切削至暴露标本的最大平 面,用毛笔清除机头、标本托及刀片上的组织碎屑。
• 6.确认切片的厚度,一般6~10um不等,根据组织的不同 可适当调整切片的厚薄。
• 1.切片前,厚度应预先调制好,刀具提前安放好。 • 2.刀的角度调好位置,并多备几个冷冻托,以供速冻组织
块使用。 • 3.切片时,观察窗不可打开过大,以防温度升高影响切片。 • 4.每一例冷冻切片完成后都应及时清理冷冻组织碎屑,以
防造成污染。 • 5.切片污染是病理组织制片的大忌,在冷冻切片粗削后必
• 二、冷冻切片染色的注意事项
• 1.提倡使用新鲜苏木精染液,每天过滤,防止沉渣及结晶 的形成,保证高质量的冷冻切片以利诊断。
• 2.室温过低时,影响着色,可适当加温促进染色。 • 3.盐酸酒精分化应适度,显微镜下控制,否则易造成核着色
不佳,染色质不清晰,影响诊断。
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12
七、冷冻切片机的使用注意事项及日常维护
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二、恒温冷冻切片机的结构与功能
• 1.结构:恒温冷冻切片机主要由冷箱体及切片机构成,具 有快速双重制冷、自动除霜、自动消毒、负压等功能。
• 2.功能:利用物理降温的方法将新鲜组织标本冷冻使其产 生一定的硬度进行切片,与石蜡切片相比,冷冻切片不需 要脱水处理,因此制片速度快,是为术中提供快速病理诊 断的良好方法。
冷冻切片制作技术
最新课件
1
• 一、冷冻切片的意义 • 二、恒温冷冻切片机的结构与功能 • 三、冷冻切片组织的取材 • 四、冷冻切片的制作方法 • 五、冷冻切片的固定和染色 • 六、冷冻切片的标准及染色的注意事项 • 七、冷冻切片机的使用注意事项及日常维

常规冰冻制片常见问题分析 ppt课件

常规冰冻制片常见问题分析  ppt课件

脱蜡试剂的问题
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怎样使 切片染色更漂亮
1、正确选择染色试剂苏木素、伊红的配方 2、注意染色过程中的细节问题
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1、苏木素、伊红配方的选择
(1)改良Gill苏木素液: 苏木2.5克溶于乙二醇250ml中。硫酸铝铵17.6克溶于蒸馏水
730ml,以上二液充分溶调后混合,加碘酸钠0.2克,使用前加 冰醋酸20ml. (2)酸化沉淀伊红液 贮 备 液 : 伊 红 20 克 , 蒸 馏 水 500ml, 经 充 分 溶 解 后 加 浓 盐 酸
废液倒掉后,试剂瓶要清洗干净并且擦干。 更换试剂后要预先试染一批切片。 更换试剂时要注意不要弄错试剂摆放的顺序。 由于天气的原因,试剂容易挥发,要及时添加或更换。
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细节决定成败
在常规和冰冻切片制片过程中,切片染 色也是 比较重要的一个环节,如果这个环节没做好,也一 样地影响病理诊断,所以,我们在实际工作中除了 注重常规的组织标本的前期处理、冰冻切片的速冻 方法外,我们还要正确选择染色液的配方,并且在 染色过程中把每一个细节都做得很好,我们的切片 质量肯定会好的。
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2、 取材不能太大、太厚
组织块的大小、厚 薄决定了冷冻的速度, 太大、太厚的组织由 于冷冻时间长,难免 有冰晶的产生。所以, 取材组织块小于 1.5*1.5*0.3cm。
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取材3mm 厚
取材4mm厚
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3、使用吸水纸 可以吸干组织表面的水分
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4、样本托和打底胶预冷
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打底胶预冷
常规及冰冻切片制片中常见的 问题分析及解决方法
1
常规、冰冻制片常见问题及对策
冰晶的问题----冰冻切片制片时如何减少冰晶 染色的问题----怎样使切片染色更漂亮 标本切开与固定----如何做好标本的切开与固

《冰冻切片法》课件

《冰冻切片法》课件
发展
近年来,冰冻切片技术不断改进,如冷冻保护剂的选择、制冷剂的种类和切片刀 的材质等方面都有所突破,提高了制片质量和效率。同时,冰冻切片法与其他技 术如免疫荧光、原位杂交等结合使用,为科学研究提供了更多手段。
02
冰冻切片法的技术原理
冰冻切片的制作过程
01
02
03
样本准备
将待检测组织固定在冷冻 台上,用冷丙酮或包埋剂 进行冷冻。
细胞结构和超微结构。
冰冻切片法的缺点
技术要求高
冰冻切片技术要求高,需要熟练的操 作技巧和经验,才能获得高质量的切 片。
设备昂贵
冰冻切片机等设备较为昂贵,增加了 制片成本。
容易产生冰晶
在冷冻过程中,组织内部容易形成冰 晶,影响切片的清晰度。
制片质量不稳定
由于制片过程中涉及多个步骤,且每 个步骤都可能影响制片质量,因此制 片质量有时不太稳定。
切片制作
使用冷冻切片机将冷冻的 组织切成5-10微米厚的切 片。
贴片与固定
将切片贴在载玻片上,并 用丙酮固定。
冰冻切片的质量控制
切片厚度
确保切片厚度均匀,一般 在5-10微米之间。
组织完整性
确保组织结构完整,无破 碎或裂痕。
染色效果
染色效果应均匀,无沉淀 或悬浮物。
冰冻切片的染色方法
苏木精-伊红染色法
基因表达研究
03
通过冰冻切片技术,可以对组织中的基因表达进行快速检测和
分析,有助于研究基因功能和疾病机制。
在其他领域的应用
食品安全检测
冰冻切片技术可用于快速检测食品中的有害物质和微生物, 保障食品安全。

05
冰冻切片法的优缺点及展望
冰冻切片法的优点
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2.1 CM 1900简介
• CM 1900是徕卡奉献给广大用户用于各种已知低温冷冻 切片的真正有效的仪器。 冷冻切片机用来将生物组织的 标本快速冷冻后,将标本在低温状态下进行微米级的超薄 切片,为生物组织的分析研究提供快速优良的组织切片。 • 特点: · 新型CM 1900的特色之一是具有大型冷冻室,可冷却到35°C。· 该仪器还提供一个独立的样品冷却系统,样品夹 温度的调节范围达到-10°C到-50°C,可进行不同类型 的样品切片,每一样品托有各自独立的温度,并可在很短 的时间内达到所需温度,快速冷冻台保持在-45°C,可同 时放多达10个样品,并和一个可持续冷却的吸热器相连, 可保证样品托上的样品快速冷却.高质量,无焊接缝的不 锈钢冷冻室表面光滑,利于清洁和防止污染。
2.2 操作
2.3 维护
2.4 故障排除
2.5. 冷冻切片的一点体会
• • 取材,未能固定的组织取材,不能太大太厚,厚者冰冻 费时,大者难以切完整,最好为正方或长方体: 1×1×0.5cm ;0.5 ×0.5×0.5cm 。 取出组织支承器,放平摆好组织,周边滴上包埋剂,速 放于冷冻台上,冰冻。小组织的应先取一支承器,滴上 包埋剂让其冷冻,形成一个小台后,再放上细小组织, 滴上包埋剂。 将冷冻好的组织块,夹紧于切片机持承器上,启动粗进 退键,转动旋钮,将组织修平。 调好欲切的厚度,根据不同的组织而定,原则上是细胞 密集的薄切,纤维多细胞稀的可稍为厚切,一般在5~ 10um间。
规格参数:
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 切片厚度:1至60um 最大样品:55 mm直径 样品臂前后移动:25 mm 样品臂上下移动:59 mm 样品臂前后移动速度:0.8mm/秒 冷冻箱温度:0至-35℃ 冷冻箱降温至:-35℃约4小时 除霜功能:以热气9分钟除霜,可自由于24小时内设置开始时间 可随时按制即时除霜. 快速冷冻台:至-45℃ 机身大小(长/深/高):890/730/1200mm 机身重量(连机切片):180kg 独特双压缩作样品快速冷冻及稳定冷冻切片温度 样品快速冷冻:-10℃至-50℃
• •
• 调好防卷板。制作冰冻切片,关键在于防卷板的 调节上,这就要求操作者要细心,准确地将其调 较好,调校至适当的位置。切片时,切出的切片 能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道,平 整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板, 取一载玻片,将其附贴上即可。 • 应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷 冻度的高低,主要根据不同的组织而定,不能一 概而论。如:切未经固定的脑组织,肝组织和淋 巴结时,冷冻箱中的温度不能调太低,在-10- 15℃左右,切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时, 可调在-15~20℃左右,切带脂肪的组织时,应 调至-25℃左右,切含大量的脂肪时,应调至30℃。
• 放置组织冰冻前,应视组织的形状及走势来放置, 所谓“砍柴看柴势”,切片也是如此,如果胡乱 放置,就不能收到很好的效果。 • 组织块不须经各种固定液固定,尤其是含水的固 定液,在未达到固定前,更不能使用。临床快速 冰冻切片,不须要预先固定,一是为了争取时间, 二是固定了的组织,反而增加了切片的难度。如 果使用未完全固定的组织做冰冻切片,就会出现 冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前, 其中的水份也可渗入到组织中去,当冰冻发生时, 这些水份就存留于组织中,形成了冰晶。
• 当切片时,如果发现冰冻过度时,可将冰冻的组 织连同支承器取出来,在室温停留片刻,再行切 片,或者用口中哈气,或者用大拇指按压组织块, 以此来软化组织,再行切片。另者,调高冰冻点。 • 用于附贴切片的载玻片,不能存放于冷冻处,于 室温存放即可。因为当附贴切片时,从室温中取 出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差,当 温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时,由 于两种物质间温度的差别,当它们碰撞在一起时, 分子彼此间发生转移ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ产生了一种吸附力,使切 片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的 载玻片来附贴切片,由于温度相同,没有发生上 述的现象。
2.7 HE染色介绍
• 苏木精 — 伊红染色法 ( hematoxylineosin staining ) ,简称HE染色法 ,石蜡 切片技术里常用的染色法之一 。苏木精染 液为碱性 ,主要使细胞核内的染色质与胞 质内的核糖体着紫蓝色 ;伊红为酸性染料 , 主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红 色 。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学 教学与科研中最基本、使用最广泛的技术 方法。
第二章 生物组织冷冻切片技术
冷冻切片技术
• 冷冻切片(frozen section)是一种在低温 条件下,将动物、植物组织快速冷却到一定 硬度,然后进行切片的方法。因其制作过程 较石蜡切片快捷、简便,而应用广泛。冷冻 切片的种类较多,有低温恒冷箱冷冻切片法, 二氧化碳冷冻切片法,甲醇循环制冷冷冻切 片法等。
2.6 冰冻切片时的注意事项:
• 防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净, 需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。 有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为 这个地方是切片通过和附贴的地方,如果有残余 的包埋剂粘于刀或板上,将会破坏甚至撕裂切片, 便切片不能完整切出。 • 多例多块组织同时需做冰冻切片时,可各自放于 不同的支承器上,于冷冻台上冻起来,然后依据 不同的编号,依序切片,这样做既不费时也不会 乱。
2.7.2 改进的冷冻切片HE染色步骤
• 固定 切好的切片用95 %乙醇95 ml + 冰醋酸5 ml 固定1 min ,自来水冲洗。 • 染色 用吸管将苏木素染液滴于玻片组织 块上,放于酒精灯加热染色0. 5 - 1 min 左 右,自来水洗去染色液,用1 %盐酸分化液分 化2 s ,放入40℃温水中返蓝,再入伊红Y染 液染色2 s ,递度酒精80%-95%-无水酒精 各2S脱水,电吹风吹干。 • 封片 中性树胶封片。
2.7.1 试剂配置
• 0.5~1% 的伊红酒精溶液: 称取伊红Y 0.5~1 g,加少量蒸馏水溶解 后,再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过 滤,将滤渣在烘箱中烤干后,以95%酒精 (即工业酒精,如果不怕浪费,用无水乙 醇配制也可)100毫升溶解。
苏木素染液配方:(配制3000 ml,可按比列 减少)
• 染色结果 细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色,软骨基质、钙 盐颗粒呈深蓝色,粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红 染成深浅不同的粉红色至桃红色,胞浆内嗜酸性 颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色, 弹力纤维呈亮粉红色,红血球呈橘红色,蛋白性 液体呈粉红色。 着色情况与组织或细胞的种类有关,也随其生活 周期及病理变化而改变。例如,很多细胞在新生 时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱,当其衰老 时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维 在老化和出现透明变性时,伊红着色由浅变深。
苏木精 6 g 无水乙醇 100 ml 硫酸铝钾 150 g 蒸馏水 2000 ml 碘酸钠 1.2 g 冰醋酸 120 ml 甘油 900 ml 配制方法:将苏木素溶于无水乙醇,再将硫酸铝 钾溶于蒸馏水,溶解后将甘油倾入一起混合,最 后加入冰醋酸和碘酸钠。
• 1%盐酸酒精分化液:将1毫升浓盐酸加入 99毫升70%酒精中即可。 • 促蓝液:1% 浓氨水溶液(1:99)
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