DNS显色剂配制
β-淀粉酶(β-AL活性检测试剂盒说明书(DNS 显色法)__可见分光光度法UPLC-MS-4171
β-淀粉酶（β-AL）活性检测试剂盒说明书（DNS显色法）可见分光光度法UPLC-MS-417150T/24S试剂名称规格保存条件试剂一液体65mL×1瓶常温保存试剂二液体18mL×2瓶2-8℃保存试剂三粉剂×2支2-8℃保存标准品粉剂×1支2-8℃保存溶液的配制：1、试剂一：若有黄色晶体析出，需加热溶解后再用；2、试剂二：临用前取1支试剂三加入到1瓶试剂二中，置于常温水中并加热至煮沸，期间不断搅拌粉剂至溶解，用不完的试剂2-8℃保存4周；3、标准品：10mg无水葡萄糖。
临用前加入1mL蒸馏水配制成10mg/mL的标准溶液，2-8℃保存两周。
淀粉酶负责水解淀粉，主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。
β-淀粉酶(EC3.2.1.2)从淀粉的非还原端切开α-1,4糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。
还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质。
α-淀粉酶不耐酸，β-淀粉酶不耐热。
根据上述特性，钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。
Starchα-AL Reducing SugarReducing Sugar+3,5-dinitrosalicylic acid3-Amino-5-Nitrosalicylate(540nm)注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
可见分光光度计、水浴锅、离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器和蒸馏水。
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）称取约0.1g样本，加入0.8mL蒸馏水，研磨匀浆；将匀浆倒入离心管中，提取液在室温下放置提取15min，每5min振荡1次，使其充分提取；6000g，常温离心10min，取上清液加蒸馏水定容至10mL，摇匀，即淀粉酶原液。
吸取上述淀粉酶原液1mL，加入4mL蒸馏水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于（α+β）淀粉酶总活力的测定。
DNS法测还原糖
3，5-二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范实验围内反应的还原糖的量和棕红色物质颜色深浅的程度成一定比例关系，可测定生成化合物的吸光度，由标准曲线反推出还原糖的浓度。
操作简便，快速，杂质干扰较少，适于生物制氢中还原糖含量的测定。
显色条件包括:波长选择，显色剂用量，显色时间，溶液酸度，显色温度，有机络合物的稳定性及共存离子的干扰等。
此次实验选择波长选择，显色剂用量，显色时间，溶液酸度进行实验。
一．试剂的配置DNS试剂：称量18.1992g酒石酸钾钠溶于50ml蒸馏水中，加热，趁热加入0.6313g 3，5-二硝基水杨酸（DNS），另配制2mol/lNaOH溶液，取26.2ml加入上述溶液中，称量0. 5128g苯酚和0.5064g无水亚硫酸钠移入配置好的溶液中，蒸馏水定容至100ml，该试剂避光保存7～10天。
葡萄糖标准溶液（1.0*10-2mol/l）：准确称量0.1990g无水葡萄糖，待溶解后定容至100ml 容量瓶中。
葡萄糖标准溶液（1.0*10-3mol/l）：取10ml上述10-2mol/l溶液，稀释至100ml容量瓶中。
葡萄糖标准溶液（1.0*10-4mol/l）：取10ml上述10-3mol/l溶液，稀释至100ml容量瓶中。
二.显色条件的选择1. 波长选择取5支试管按下表加相应溶液，沸水浴15min, 均加入7ml水定容为1 0ml，流水冷却，在不同波长处分别进行扫描。
图1为不同条件下溶液的波长——吸光度图（水调零）。
由图1可以看出白色与绿色曲线几乎重合，说明0.0001mol/l葡萄糖溶液与DNS反应生成的氨基化合物极少，用比色法很难区分，故此法所能够测量的葡萄糖浓度应大于0.0001mol/l。
由DNS＋H2O曲线可以看出当波长大于530nm时，DNS的吸光度已经很小，这时DNS对反应生成的氨基化合物吸光度的影响可以忽略。
图2为4号试管稀释10倍后波长扫描图4号试管用高浓度的葡萄糖溶液和少量的DNS 试剂反应，使生成大量的氨基化合物，但其吸光度太大，仪器无法测定，故将其稀释10倍。
总糖含量的测定—3, 5-二硝基水杨酸法
总糖含量的测定——3, 5-二硝基水杨酸法原理：在氢氧化钠或丙三醇的的存在下, 还原糖能将3, 5-二硝基水杨酸(DNS) 中的硝基还原成氨基, 生成氨基化合物, 此化合物在过量的氢氧化钠碱性溶液中呈橘红色。
试剂：葡萄糖;3, 5-二硝基水杨酸(化学纯) ;酒石酸钾钠、苯酚、盐酸、氢氧化钠、无水亚硫酸钠(均为分析纯);超纯水。
仪器和设备：紫外可见分光光度计；电子天平（感量为0.0001g）；电热鼓风干燥箱；电热恒温水浴锅。
溶液的配制（1）DNS试剂的配制：称取18.2 g酒石酸钾钠、0.63 g3，5-二硝基水杨酸、2.1 g Na OH、0.5 g苯酚、0.5 g无水Na2SO3，分别加少量超纯水溶解，将酒石酸钾钠溶液放于45℃水浴锅，然后依次加入上述溶解好的试剂，边加边搅拌，取出后冷却至室温，加超纯水定容至100 m L，贮存于棕色瓶内，暗处保存，一周后使用。
（2）葡萄糖标准溶液的配制：将葡萄糖置于105℃中干燥至恒重，精密称取0.100g 葡萄糖于100mL烧杯中，加水溶解，定容至1000mL，即得浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液。
样品溶液的制备：准确称取样品0.2g～1.0g，精确到0.0001g，于50 mL试管中，加入20 m L蒸馏水，在沸水浴中煮沸20 min，取出冷却，过滤入100 mL容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度，即为样品测定液。
标准曲线的制作：精密量取0.1mg/mL的葡萄糖标溶液0mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL 置于25mL具塞比色管中，加入蒸馏水补充至2.0mL。
向试液中分别加入3 mL DNS显色剂，于沸水浴中加热9 min，立即冷却至室温，定容至刻度，显色20 min后于波长540 nm处，用可见分光光度计测定不同浓度葡萄糖混合溶液的吸光度，并以葡萄糖质量浓度 (x)为横坐标，吸光度 (y)为纵坐标，绘制葡萄糖溶液标准曲线。
DNS法测定还原糖的含量
absorbency
1 y = -0.14971 + 0.035786x R= 0.9954
0.8
0.6
0.4
0.2
glucose standard curve 1
0
0
5
10
15
20
25
30
glucose standard curve1
glucose chroma/10-4mol/l
另外采用较高浓度的葡萄糖来制作标准曲线，得到下图2： 其回归方程为：y=-0.10483+0.031804x,R=0.99817.
试管号
0
1
2
3
4
56
7
8
9
10
11
12
13
14
DNS/ml
0
2
2
2
2
22
2
2
2
2
2
2
2
2
水/ml
3
1
葡萄糖/ml
0
0
1
1
1
11
1
1
1
1
1
1
1
1
浓度/104mol/l
3
5
7
9 11
13
15
17
19
21
23
25
27
下图1为葡萄糖标准曲线图，葡萄糖含量（mol/l） 与相应的吸光度（A）有一定的线性关系，且其回归方程为： y = - 0.14971+0.035786x， R= 0.9954。
二.显色条件的选择
1. 波长选择 取5支试管按下表加相应溶液，沸水 浴15min, 均加入7ml水定容为10ml，流水冷却，在不 同波长处分别进行扫描。
dns紫外分光光度法
dns紫外分光光度法DNS紫外分光光度法是一种广泛应用于分子生物学领域的分析技术，其能够准确测定DNA、RNA以及蛋白质等生物大分子物质的浓度和纯度。
本文将从以下几个方面进行介绍。
一、DNS紫外分光光度法的原理DNS紫外分光光度法是利用生物大分子物质对紫外光的吸收来测定其浓度和纯度的方法。
在285-300nm波长范围内，DNA、RNA和蛋白质等分子会吸收较多的紫外光。
DNS试剂在这样的紫外光照射下被物质还原为DNB，且DNB的产生与样品中丝氨酸、组氨酸、酪氨酸等氨基酸的含量成正比。
这样，通过对样品与标准品在波长范围内的吸收值进行比较，可计算出样品中的生物大分子物质的浓度和纯度。
二、DNS紫外分光光度法的步骤1. 制备DNS试剂：将1g 3,5-二硝基水杨酸溶于100ml浓硫酸中，加入冰水中，使其在冰水中降温结晶，将产生的白色晶体过滤、清洗并干燥，即得到DNS试剂。
2. 样品准备：将待测样品制备成一定浓度的溶液，一般为50～100μg/ml, 要求样品溶液中无酶及其他干扰物质。
同时，还需准备一系列标准样品。
3. 测定吸光度值：将样品与标准样品分别加入量刚好的稀释液中，然后在波长范围内进行吸光度测定，记录吸光度值。
4. 计算生物大分子物质的浓度和纯度：根据吸光度计算样品中生物大分子物质的浓度和纯度，并将其与标准品的吸光度值对比，判断样品是否纯度高、浓度精确。
三、DNS紫外分光光度法的应用DNS紫外分光光度法在蛋白质纯化、定量、质量控制等方面具有广泛应用。
它不仅可以用于测定DNA、RNA和蛋白质的浓度和纯度，还可以用于判断DNA、RNA的纯度以及分子量大小。
四、DNS紫外分光光度法的优缺点优点：具有简便操作、准确可靠、灵敏度高、测量速度快等优点，适用于大量样品的测定。
缺点：DNS试剂的稳定性差，易降解和硫酸等化学物品使用过程需要注意操作安全性与环保性等问题。
综上所述，DNS紫外分光光度法是一种简单而有效的生物大分子物质测定方法，其具有极高的应用价值以及很广的适用范围。
一种测定葡萄糖的方法
一种测定葡萄糖的方法在烷基糖苷合成过程中，应用DNS为显色剂的分光光度法对烷基糖苷合成过程中葡萄糖的分析测定进行了研究。
研究结果表明：采用玻璃比色皿，在最大吸光度为510nm波长，葡萄糖浓度范围为1.6-40.9μg·mL-1，吸光度与葡萄糖浓度满足线性关系具有良好的线性关系，吸光度与葡萄糖浓度标准曲线为A=0.0109c,摩尔吸光系数为1962 mol-1·L·cm-1，相关系数为0.9992，回收率在97%-103%之间，显色体系中含有脂肪醇及烷基糖苷对体系吸光度没有影响。
DNS 显色分光光度法用于烷基糖苷水解体系还原糖含量的测定可行，该方法方便快捷、准确度高。
化学分析法是应用葡萄糖分子结构中含有醛基的特点进行分析测定，一般是采用裴林试剂测还原糖的方法，葡萄糖具有还原性，可用还原糖法的测定方法测定，但是还原糖法特异性较差，如果样品中混有其他还原糖可使结果偏高。
优点是方法简单、实用，缺点是通常适用于高浓度系统，但是体系中混有溶剂时，此方法观察终点不明显。
分光光度法测定葡萄糖分为蒽酮显色法和DNS显色法，但是由于蒽酮显色法实在酸性体系中显色，而酸性体系烷基糖苷存在水解副反应的发生，影响测定结果，也不能用于烷基糖苷合成体系中的葡萄糖测定[5,6]。
而分光光度法中采用DNS显色法在碱性体系中显色，烷基糖苷在碱性体系中稳定，是合适的分析测定方法。
为了获得控制萄糖直接与高碳脂肪醇进行缩合反应生成烷基糖苷反应过程中葡萄糖的浓度，采用斐林试剂滴定，由于由N-甲基吡咯烷酮的存在，测定突变点无法确定。
探讨了显色剂用量、显色时间、显色体系碱浓度对吸光度的影响，考察了测定系统中脂肪醇、烷基糖苷存在对测定经过的干扰情况。
为改善萄糖与高碳脂肪醇进行缩合反应过程，提高合成烷基糖苷反应过程的速度、进一步提高烷基糖苷产品的质量，也为研发葡萄糖颗粒与脂肪醇的新工艺技术提供分析测定的可靠方葡萄糖具有醛基，具有还原性，碱性条件下可将3，5-二硝基水杨酸还原为3-氨基-5-硝基水杨酸，而3-氨基-5-硝基水杨酸在碱性条件下成橘红色，在一定的实验条件下具有最大吸收，并且在一定葡萄糖浓度范围内与其最大吸收波长下的吸光度成线性关系，本质为3-氨基-5-硝基水杨酸浓度与其最大吸收波长下的吸光度成线性关系，通过吸光度与3-氨基-5-硝基水杨酸浓度线性关系以及葡萄糖浓度与产物3-氨基-5-硝基水杨酸浓度反应关系的线性建立联系，从而以葡萄糖浓度和吸光度做标准曲线，通过测定样品吸光度对应算出样品中葡萄糖浓度，此外，配方中其他成分主要是去除试剂中的游离氧和增强并稳定显色效果[13]。
DNS显色剂配制
A.
1.称取DNS（6.3g）加水500ml，水浴45度；
2.逐步加入氢氧化钠（21g）溶液，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明；（a.药品中的氢氧化钠要配制成溶液；直接加颗粒，可能产生鸡蛋花； b.加入氢氧化钠溶液时，溶液的温度会上升，所以要慢慢加，不停地搅拌，同时溶液的温度不能超过48度；温度高了，溶液颜色变黑。
）
3. 逐步加入四水酒石酸钾钠（182g）、苯酚（5g）和无水亚硫酸钠（5g）；（顺序最好不要更改！）
4.继续45度水浴，同时补水，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解；（一定要有耐心地搅拌！）
5. 停止加热，冷却至室温，用水定容。
6. 烧结玻璃漏斗过滤（过滤与否，影响不大。
）
7. 储存在棕色瓶中，避光保存。
室温下存放7天后使用。
有效期为6个月。
B.
1.称取酒石酸钾钠182g加水500ml配成热水溶液；
2.制备262ml的2mol/L的氢氧化钠溶液
3. DNS6.3g，苯酚5g，午睡亚硫酸钠5g
4.将2，3准备的药品加入1中并加水搅拌，溶解
5. 冷却定容
C.
甲液：将6.9 g结晶苯酚溶于15.2 mL10%NaOH溶液，蒸馏水稀释至69 mL，在此溶液中加入6.9 g亚硫酸氢钠。
乙液：将225 g酒石酸钾钠溶于300 mL10%NaOH溶液中，再加入880 mL1%的3，5-二硝基水杨酸溶液。
将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，储于棕色瓶中放置7-10 d后使用。
在棕色瓶内保存一年有效。
dns溶液的配制方法
dns溶液的配制方法
DNS溶液是一种常用的植物组织DNA提取缓冲液，其名称来源于其成分：二甲基亚砜（DMSO）、氯化钠（NaCl）和柠檬酸（Citric acid）。
DNS溶液的配制方法如下：
1. 准备所需试剂：二甲基亚砜、氯化钠、柠檬酸、蒸馏水。
2. 按照以下比例将试剂加入蒸馏水中：
- 二甲基亚砜：10 ml
- 氯化钠：1.5 g
- 柠檬酸：2.5 g
- 蒸馏水：86 ml
3. 将试剂充分混合，直到完全溶解。
4. 调节pH值至7.5-8.0。
可以使用NaOH或HCl溶液进行调节，直到达到所需的pH值。
5. 最后，用蒸馏水将溶液体积补至100 ml。
注意事项：
1. 在配制DNS溶液时，应使用高纯度的试剂和蒸馏水，以避免杂质对实验结果的影响。
2. 在调节pH值时，应逐滴加入NaOH或HCl溶液，并不断搅拌，
以避免过度调节。
3. 配制好的DNS溶液应保存在冰箱中，避免阳光直射和高温。
DNS溶液是一种常用的DNA提取缓冲液，其配制方法简单易行，但在实验中仍需注意一些细节，以确保实验结果的准确性。
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A.
1.称取DNS（）加水500ml，水浴45度；
2.逐步加入氢氧化钠（21g）溶液，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明；（a.药品中的氢氧化钠要配制成溶液；直接加颗粒，可能产生鸡蛋花；b.加入氢氧化钠溶液时，溶液的温度会上升，所以要慢慢加，不停地搅拌，同时溶液的温度不能超过48度；温度高了，溶液颜色变黑。
）
3.逐步加入四水酒石酸钾钠（182g）、苯酚（5g）和无水亚硫酸钠（5g）；（顺序最好不要更改！）
4.继续45度水浴，同时补水，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解；（一定要有耐心地搅拌！）
5.停止加热，冷却至室温，用水定容。
6.烧结玻璃漏斗过滤（过滤与否，影响不大。
）
7.储存在棕色瓶中，避光保存。
室温下存放7天后使用。
有效期为6个月。
B.
1.称取酒石酸钾钠182g加水500ml配成热水溶液；
2.制备262ml的2mol/L的氢氧化钠溶液
，苯酚5g，午睡亚硫酸钠5g
4.将2，3准备的药品加入1中并加水搅拌，溶解
5.冷却定容
C.
甲液：将g结晶苯酚溶于mL10%NaOH溶液，蒸馏水稀释至69mL，在此溶液中加入g亚硫酸氢钠。
乙液：将225g酒石酸钾钠溶于300mL10%NaOH溶液中，再加入880mL1%的3，5-二硝基水杨酸溶液。
将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，储于棕色瓶中放置7-10d后使用。
在棕色瓶内保存一年有效。