§2.2 双波长和三波长分光光度法
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UV-Vis原理及应用概述
lnT
微分后除以上式可得浓度的相对误差为：
C
C
T T lnT
当溶液的透光率为36.8%或吸光度为0.434时， 浓度的相对误差最小。
T值在65~20%或A值在0.2~0.7之间，浓度相对 误差较小，是测量的适宜范围。
§3 分析条件的选择
仪器测量条件的选择 显色反应条件的选择 参比溶液的选择
A 分子中电子能级、振动能级和转动能级示意图
2. 电子跃迁主要类型
按照价电子性质不同讨论不同的紫外-可 见吸收光谱。 以甲醛分子为例： 存在σ电子，π电子，n（p）电子。
分子轨道理论：
σ成键轨道< π成键轨道< n 非键轨道<π*反键轨道<σ*反键 轨道
分子中外层电子能级及跃迁类型示意图
2.1 σ→σ*跃迁
1. 仪器测量条件的选择
1.1 适宜的吸光度范围
即当A=0.434时，吸光度测量误差最小。 最适宜的测量范围为0.2~0.7之间。
1.2 入射光波长的选择
通常是根据被测组分的吸收光谱，选择最 强吸收带的最大吸收波长（λmax ）为入射波 长。当最强吸收峰的峰形比较尖锐时，往往 选用吸收稍低，峰形稍平坦的次强峰进行测 定。
1.3 狭缝宽度的选择
为了选择合适的狭缝宽度，应以减少狭缝 宽度时试样的吸光度不再增加为准。一般来 说，狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度的十 分之一。
2. 显色反应条件的选择
可见分光光度法一般用来测定能吸收可见光 的有色溶液。对某些无色或浅色物质进行测 定，常利用显色反应将被测组分转变为在可 见波长范围有吸收的物质。常见的显色反应 有配位反应、氧化还原反应等。
测定试样溶液的吸光度，需先用参比溶液调 节T为100% （A为0） ，以消除其它成分及 吸收池和溶剂等对光的反射和吸收带来的测 定误差。
§2.2 双波长和三波长分光光度法
2和K1分别为在λ2和 λ1处的放大系数；组分A和B 在λ2和 λ1处的吸光度分别为
A B A B A 、 A 和 A 、 A 2 1 1，则 2
S＝K2 A2＋K2 A2－K1 A1－K1 A1
调节仪器中的信号放大 器，使干扰组分B在波长λ2 和λ1处的信号相等，由此得 系数倍率K为：
第二节 双波长和三波长分光光度法 一．双波长分光光度法的原理
双波长分光光度法是在传统的单波长分光度法的基础上发 展起来的。单波长分光光度法要求式样本身透明，不能有混 浊，如果是试样溶液在测量过程中逐渐产生浑浊便无法正确 测定。对于吸收峰相互重叠的组分或背景很深的试样分析， 也很难得到准确的结果。 双波长分光光度法的建立，在一定程度上克服了单波长 法的局限性，扩展了分光光度法的应用范围，在选择性、灵 敏度和测量精密度等方面都比单波长法有进一步的改善和提 高。
二． 三波长分光光度法的原理和应用
1．基本原理
如图所示，在任一吸 收曲线上，可以在任意选 择的三个波长处测量吸光 度。根据三角形和三角形 相似，可推导出在上述三 个波长处测量的吸收度具 有下列函数关系： 三波长法原理图
式中，m和n分别表示(2 -1)和(3 -2)的数值。1、2和3 分别为待测物在三波长处的摩尔吸光系数；C为待测物的摩尔浓 度；b为光程。方程中的系数 可预先求得，A值 与待测物浓度成正比，因而可通过曲线求出样品中待测组分的 含量。 从上图可知，如选择的三个波长相应于吸收曲线上三点处 于一条直线上，则测得的A值为零。因此，当干扰组分的吸收 光谱为一直线（如浑浊产生的干扰），则在任选的三个波长处 测定，测得的值与干扰物浓度无关，如果干扰物为一吸收曲线， 只要在曲线上找到处在一条直线上的三点，在此三点相应的波 长处测定，由于干扰物在此三波长处的值为零，故测得的只与 待测组分的浓度有关。
双波长分光光度法的基本原理及应用
双波长分光光度法的基本原理及应用应用分光光度法对共存组分进行不分离定量测定时，通常采用的方法有双波长法，三波长法，导数光谱法、差谱分析法及多组分分析法等方法，其快速，简便的优点使这些方法在实用分析中得到越来越广泛的应用。
其中以双波长法的应用为最多，该法的准确度和精密度要高于其它方法，是对共存组分不分离定量测定的有效方法之一。
实用中的双波长法主要采用等吸收波长法和系数倍增法两种分析方法，下面就其基本原理和应用作以介绍：一、等吸收波长法1、基本原理图1是同一组分三个不同浓度供试液的吸收光谱图，经典分光光度法的定量测定通常是在被测组分的最大吸收波长处进行测定，根据兰伯一比耳定律，其吸光度值与被测组分的浓度C成正比，即：依（3）式测定被测组分a，则可完全消除b组分的干扰，达到共存组分不分离进行定量测定的目的。
2、影响因素（1）测定波长和组合波长的选择应使被测组分的△A值尽可能大，以增加测定的灵敏度和精确度。
（2）测定波长和组合波长应尽可能选择在光谱曲线斜率变化较小的波长处，以减小波长变化对测定结果的影响。
（3）干扰组分等吸收波长（组合波长）的选择必须精确，只有其△A值等于零时才能完全消除干扰，否则会引入测定误差。
为此，在实用分析中，都是先配制一个干扰组分b的供试液，在仪器上准确找出等吸收波长，然后再对样品进行测定。
3 应用实例等吸收波长法的一个典型应用实例为收载于《中华人民共和国药典》中的抗菌消炎药复方磺胺甲噁唑片的含量测定。
复方磺胺甲噁唑片中含有磺胺甲噁唑（SMZ）和甲氧苄（TMP）两个成分，其吸收光谱见图3。
当测定SMZ时，选择其最大吸收波长257nm为测定波长，可以在干扰组分TMP的光谱曲线上304nm附近找到等吸收波长为组合波长消除其干扰；当测定TMP时，选择239nm为测定波长，可以在干扰组分SMZ的光谱曲线上295nm附近找到等吸收波长为组合波长消除其干扰，分别对SMZ和TMP进行含量测定。
双波长
双波长分光光度法 的基本原理及应用
指 导 老 师 ：孙杰 研究生姓名：郑许光
2015年6月10日
提纲
一、双波长分光光度法的概述
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
二、双波长分光光度法的原理
三、双波长分光光度法的特点
四、双波长法的应用
一、双波长分光光度法的概述
紫外----可见分光光度法是当 前用途最广泛、应用最普遍的 仪器分析方法之一。自1829 年伯格提出，数年后由郎伯发 表“伯格---郎伯定律”，以及 1852年比耳提出“比耳定律” 后，为吸光度法奠定了理论基 础。分光光度法不仅用于溶液 中有色成分的定量分析而且可 在紫外光区对许多有机化合物 作定量和定性分析，此外还可 以作络合物（络合比）测定， 及有关物理化学常数的测定。
谢谢! 请老师批评指正!
可采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合。
三、双波长分光光度法的特点
可进行浑浊试样的分析。 通过适当的波长组合，可进行双组合或三组合混合物的同 时测定。 当波长相差1~2nm时，使双波长同时扫描，可记录一阶导 数光谱。 采用一波长固定，另一波长扫描，记录吸收光谱。可消除 浑浊背景的影响。 采用双笔记录器，可记录溶液中发生的两种现象。 从原理上讲，单波长法和双波长法的不同之处是:双波长 用二个单色器，得到二个不同波长的单色光，测量的是两个 波长处的吸光度差，使用一个吸收池，取消了参比池。
二、双波长分光光度法的原理
1、双波长分光光度计光路示意图
2、双波长工作原理示意图
3、双波长分光光度法的分析 3.1 根据朗伯—比尔定律：A=εbc
3.2 测量波长λ2和参比波长λ1的选择与组合 以两组分x和y的双波长法测定为例： 设：x为待测组分，y为干扰组分，二者的 吸光度差分别为ΔAx和ΔAy，则该体系的总 吸光度差ΔAx+y为： ΔAx+y=ΔAx+ΔAy
指 导 老 师 ：孙杰 研究生姓名：郑许光
2015年6月10日
提纲
一、双波长分光光度法的概述
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
二、双波长分光光度法的原理
三、双波长分光光度法的特点
四、双波长法的应用
一、双波长分光光度法的概述
紫外----可见分光光度法是当 前用途最广泛、应用最普遍的 仪器分析方法之一。自1829 年伯格提出，数年后由郎伯发 表“伯格---郎伯定律”，以及 1852年比耳提出“比耳定律” 后，为吸光度法奠定了理论基 础。分光光度法不仅用于溶液 中有色成分的定量分析而且可 在紫外光区对许多有机化合物 作定量和定性分析，此外还可 以作络合物（络合比）测定， 及有关物理化学常数的测定。
谢谢! 请老师批评指正!
可采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合。
三、双波长分光光度法的特点
可进行浑浊试样的分析。 通过适当的波长组合，可进行双组合或三组合混合物的同 时测定。 当波长相差1~2nm时，使双波长同时扫描，可记录一阶导 数光谱。 采用一波长固定，另一波长扫描，记录吸收光谱。可消除 浑浊背景的影响。 采用双笔记录器，可记录溶液中发生的两种现象。 从原理上讲，单波长法和双波长法的不同之处是:双波长 用二个单色器，得到二个不同波长的单色光，测量的是两个 波长处的吸光度差，使用一个吸收池，取消了参比池。
二、双波长分光光度法的原理
1、双波长分光光度计光路示意图
2、双波长工作原理示意图
3、双波长分光光度法的分析 3.1 根据朗伯—比尔定律：A=εbc
3.2 测量波长λ2和参比波长λ1的选择与组合 以两组分x和y的双波长法测定为例： 设：x为待测组分，y为干扰组分，二者的 吸光度差分别为ΔAx和ΔAy，则该体系的总 吸光度差ΔAx+y为： ΔAx+y=ΔAx+ΔAy
分光光度法
续前
百分吸收系数与摩尔吸收系数之间的关系是：
M 1% ε = 10 E1cm
吸收系数是物质的特性常数，表明物质对某一特 定波长光的吸收能力。不同物质对同一波长的单 色光有不同的吸收系数，吸收系数越大，表明吸 光能力越强，灵敏度越高，所以吸收系数是物质 定性和定量分析的依据。
四、吸收光谱
吸收光谱又称吸收曲线，是在浓度一定的条件下， 以波长（λ）或波数（δ）为横坐标，以吸收度 （A）为纵坐标所描绘的曲线。
仪器
可见分光光度计
721型分光光度计
仪器
紫外-可见分光光度计
一、基本组成
光源 单色器 样品室 检测器 显示器
1. 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具 有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。 可见光区：钨灯作 为光源，其辐射波长范 围在350～1000 nm。 紫外区：氢、氘灯。 发射200～360 nm的连 续光谱。
三种分光光度计的比较
721型分光光度计的使用
三、应用
（一）定性鉴别 根据物质的吸收光谱特征，如吸收光谱的形状、 最大吸收波长、吸收峰数目、各Байду номын сангаас收峰的位置， 强度和相应的吸收系数等进行分析。
1、比较光谱的一致性
两个化合物相同，在相同的条件下测出的吸收光 谱应完全相同。 具体做法：
（1）样品与标准品在完全相同的情况下，分别测出 吸收光谱，比较二者光谱是否一致 （2）没有标准品，用标准光谱图对归照比较，二者 吸收光谱一致，可初步断定是同一化合物。
（二）朗伯-比尔定律
当一束平行的单色光通过均匀、无散射现象的溶 液时，在单色光强度、溶液的温度等条件不变的 情况下，溶液对光的吸收度与溶液的浓度及液层 厚度的乘积成正比。 A=－lgT=ECL 朗伯-比尔定律适用于无色溶液、有色溶液及气体 和固体的非散射均匀体系。
双波长紫外分光光度法
将样品在276nm和322nm波长处的得的吸收度计算得的ΔA，代入标 准曲线，求得样品中阿司匹林的浓度。
②样品测定：取阿司匹林肠溶片20片，精密称定，研细。精密称取约 相当于阿司匹林50mg置于50mL容量瓶中，加乙醇适量，振摇使溶解 并定容，摇匀，滤过。精密量取续滤液2mL置25mL容量瓶中，加乙 醇至刻度，摇匀。分别在276nm、322nm波长处测定吸收度，用回 归方程计算阿司匹林的含量。
含量计算
阿司匹林制剂在体外的含量测定
——双波长紫பைடு நூலகம்分光光度法
原料
阿司匹林肠溶片
原理
采用双波长紫外分光法（测定波长为276nm和322nm），测定了阿 司匹林肠溶片的含量，可消除附加产物水杨酸的干扰。
方法
①标准曲线的绘制：精密称取阿司匹林对照品适量，加乙醇溶解使成 1000μg/mL的溶液。精密吸取1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mL，分置于 25mL容量瓶中，加乙醇至刻度，分别制成40，60，80，100和 120μg/mL的对照品溶液，以乙醇为空白，分别在276nm、322nm波； 长处测定吸收度，以浓度C和ΔA进行线性回归得出方程式。
②样品测定：取阿司匹林肠溶片20片，精密称定，研细。精密称取约 相当于阿司匹林50mg置于50mL容量瓶中，加乙醇适量，振摇使溶解 并定容，摇匀，滤过。精密量取续滤液2mL置25mL容量瓶中，加乙 醇至刻度，摇匀。分别在276nm、322nm波长处测定吸收度，用回 归方程计算阿司匹林的含量。
含量计算
阿司匹林制剂在体外的含量测定
——双波长紫பைடு நூலகம்分光光度法
原料
阿司匹林肠溶片
原理
采用双波长紫外分光法（测定波长为276nm和322nm），测定了阿 司匹林肠溶片的含量，可消除附加产物水杨酸的干扰。
方法
①标准曲线的绘制：精密称取阿司匹林对照品适量，加乙醇溶解使成 1000μg/mL的溶液。精密吸取1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mL，分置于 25mL容量瓶中，加乙醇至刻度，分别制成40，60，80，100和 120μg/mL的对照品溶液，以乙醇为空白，分别在276nm、322nm波； 长处测定吸收度，以浓度C和ΔA进行线性回归得出方程式。
双波长分光光度法
双波长分光光度法建立在Lambert—beer定律基础上的单波长分光光度分析技术，应用极为广泛，但由于单波长法存在混浊试样对光的散射和比色杯背景吸收等难以克服的缺点，它在高精度测量中的应用受到一定的限制。
为了解决浑浊试样对分光光度测定的干扰问题，美国的B.Chance于1951年制成了用振动镜使两束不同波长的单色光交替通过待测溶液的双波长分光光度计（Double Wavelength Spectrophotometer）,从而奠定了双波长分光光度法的基础。
随着科学技术的发展，双波长分光光度分析技术已日臻完善，与先进的后分光技术相结合，在生化自动化分析中得到了广泛的应用并显示出了光明的发展前景。
1 双波长分光光度法的原理双波长分光光度法是在传统分光光度法的基础上发展起来的，它的理论基础是差吸光度和等吸收波长。
它与传统分光光度法的不同之处，在于它采用了两个不同的波长即测量波长（又叫主波长λp,Primary Wavelength）和参比波长（又叫次波长λs, SecondWavelength）同时测定一个样品溶液[1,2]，以克服单波长测定的缺点，提高了测定结果的精密度和准确度。
早期的双波长分光光度计在测定时，两束不同波长的单色光经斩光器（Chopper，一种用于双波长分光光度计中使光束按一定周期反射，遮断或通过的装置）处理后，以一定的时间间隔交替照射[1]比色杯，经待测溶液吸收后，再照到光电管上，产生两个不同的吸光度，再将这两个吸光度相减，就得到了差吸光度ΔA。
根据Lamber—Beer定律, 得：Aλp=ελpLC+Ap (1)A λs=ελsLC+As (2)式中Aλp 、 A λs—分别为待测溶液在主波长和次波长处的吸光度，ελp 、ελs—分别为待测溶液在主波长和次波长处的摩尔吸光系数L—光径C—待测溶液的浓度Ap 、As—分别为待测溶液在主波长和次波长处的散射或背景吸收当λp 、λs相差不太大时，由同一待测溶液产生的光散射吸光度和背景吸光度大致相等，即Ap＝A s，将（1）式－（2）式得：Aλp－A λs＝ΔA＝（ελp－ελs）LC （3）对于同一待测溶液来说，ελp－ελs是一常数K，在光径L不变的情况下，（3）式可简化为：ΔA＝KC （4）（4）式说明，待测溶液在λp与λs两个波长处测定的差吸光度ΔA与试样中待测物质的浓度C成正比。
第三章紫外可见吸收光谱法
吸收谱带的强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有关，也提 供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测得的摩尔 吸光系数εmax也作为定性的依据。不同物质的λmax有时可能 相同，但εmax不一定相同；
吸收谱线强度A与该物质分子吸收的光子数成正比，即与 该物质的浓度C成正比，这是定量分析的依据。
A bc
s*
收远紫外光的能量才能发生跃
p*
迁；
E
n
饱和烷烃的分子吸收光谱出现
p
在远紫外区；
s
吸收波长λ<200 nm；
例：甲烷的λmax为125 nm , 乙烷λmax为135 nm。只能被真 空紫外分光光度计检测到；故可作为溶剂使用。
- 18 -
1.2 n→σ＊跃迁
所需能量较大； 吸收波长为150～250 nm，大部分在远紫外区，近紫外区
光聚焦至出射狭缝； 出射狭缝
- 43 -
色散元件：
光学系统的核心部分，起分光的作用。其性能直接影响 入射光的单色性，影响测定灵敏度、选择性及校准曲线的线 性关系等。
棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同而将不同波 长的光分开，缺点是波长分布不均匀，分辨能力较低。
光栅：利用光的衍射与干涉作用制成，它可用于紫外、可 见及红外光域，而且在整个波长区具有几乎均匀一致的高 分辨能力。它具有色散波长范围宽、分辨本领高、成本低、 便于保存和易于制备等优点。缺点是各级光谱会重叠而产 生干扰。
远紫外光区：10-200 nm； 近紫外光区：200-400 nm； 可见光区：400-780 nm。
紫外可见吸收光谱法特点：
仪器较简单，价格较便宜； 分析操作简单； 分析速度较快。
-2-
2. 紫外可见吸收光谱的产生
紫外可见吸收光谱：分子价电子能级跃迁（伴随着振 动能级和转动能级跃迁）。
吸收谱线强度A与该物质分子吸收的光子数成正比，即与 该物质的浓度C成正比，这是定量分析的依据。
A bc
s*
收远紫外光的能量才能发生跃
p*
迁；
E
n
饱和烷烃的分子吸收光谱出现
p
在远紫外区；
s
吸收波长λ<200 nm；
例：甲烷的λmax为125 nm , 乙烷λmax为135 nm。只能被真 空紫外分光光度计检测到；故可作为溶剂使用。
- 18 -
1.2 n→σ＊跃迁
所需能量较大； 吸收波长为150～250 nm，大部分在远紫外区，近紫外区
光聚焦至出射狭缝； 出射狭缝
- 43 -
色散元件：
光学系统的核心部分，起分光的作用。其性能直接影响 入射光的单色性，影响测定灵敏度、选择性及校准曲线的线 性关系等。
棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同而将不同波 长的光分开，缺点是波长分布不均匀，分辨能力较低。
光栅：利用光的衍射与干涉作用制成，它可用于紫外、可 见及红外光域，而且在整个波长区具有几乎均匀一致的高 分辨能力。它具有色散波长范围宽、分辨本领高、成本低、 便于保存和易于制备等优点。缺点是各级光谱会重叠而产 生干扰。
远紫外光区：10-200 nm； 近紫外光区：200-400 nm； 可见光区：400-780 nm。
紫外可见吸收光谱法特点：
仪器较简单，价格较便宜； 分析操作简单； 分析速度较快。
-2-
2. 紫外可见吸收光谱的产生
紫外可见吸收光谱：分子价电子能级跃迁（伴随着振 动能级和转动能级跃迁）。
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S K2 A2 K1 A1
式中，K2和K1分别为在λ2和 λ1处的放大系数；组分A和B 在λ2和 λ1处的吸光度分别为
AA2、AB2 和AA1、AB1，则
S＝K2
AA2＋K2
AB2－K1
AA1－K1
AB 1
调节仪器中的信号放大
器，使干扰组分B在波长λ2
和λ1处的信号相等，由此得
所以
A
AA 2
AA 1
(
A 2
A 1
)bc
该式表明，此时测得的 A与干扰组分无关。 (b) 系数倍率法
当干扰组分B的吸收光谱曲线无吸收峰，仅出现陡坡，不 存在吸光度相等的两个不同波长，如下图所示。在这种情况下， 采用系数倍率法。利用双波长分光光度计本身的电子线路，选 择被测组分吸收差值大的波长进行测定。用差分放大器可获得 混合试样在波长λ2和λ1处的差示信号S：
式（2）中，I和是波长的函数，I的一阶导数值与浓度成线性关 系。灵敏度（一阶导数值的大小）决定于摩尔吸光系数对波长 的变化率，最大时，灵敏度最大。 对式（1）作二次微分处理，得
从式（3）可知，当时，I的二阶导数值与浓度呈线性关系。同 理，对式（6.1）作三次和四次微分处理得：
从式（4）可知，对三阶导数， =0时，I的三阶导数值与浓度 成正比；对四阶导数，则必须满足 =0和 =0两个条件，才 能使四阶导数与浓度成正比。这就为我们利用导数光谱做定量 分析时，正确选择波长提供理论依据。在通常情况下，四阶导 数即可获得极佳的分辨率，并保持较高的信噪比，因此在采用 导数分光光度法测定时，导数的阶数一般选择n ≤4。
A2 A1
( 2
1 )bc
该式表明，试样溶液中被测组分的浓度与两个波长λ1和λ2处的
吸光度差 △A成比例，这是双波长法的定量依据。
双波长分光光度计既可作为双波长的方式，也可作为单波
长双光束的方式工作。
双波长光光度计不仅可测定多组分混合试样、混浊试样，
而且还可测得导数吸收光谱。测量时使用同一吸收池，不用空
背景吸收较大产生的误差显著的降低了测定的准确度，并使方法的测定受到 限制。
用双波长法能在一定程度上消除浑浊背景的干扰，进行混浊样品分析。 在生物化学和临床医学上，浑浊样品较多，双波长法应用更为广泛。
二． 三波长分光光度法的原理和应用
1．基本原理 如图所示，在任一吸
收曲线上，可以在任意选 择的三个波长处测量吸光 度。根据三角形和三角形 相似，可推导出在上述三 个波长处测量的吸收度具 有下列函数关系：
为了消除干扰组分B的吸收，分析波长λ1选择在组分A的最 大吸收峰或它的附近，参比波长λ2用作图法确定，如下图所 示。在组分A的λ2处作一垂直于X坐标的直线，该直线与干扰 组分B
相交于某一点，再从这点作平行于X坐标的直线并与组分B的 吸收曲线相交于一点或几点，与该交点相对应的波长作为参比
波长，如图中的λ1或λ1。所选择的λ2和λ1应符合以下条件：第 一，干扰组分在该两波长处的吸光度相同；第二，被测组分在
第三节 导数分光光度法
在分光光度分析中引入导数技术，扩展了分光光度法的应
用范围，在多组分同时测定、浑浊样品分析、消除背景干扰和
加强光谱的精细结构以及复杂光谱的辨析等方面，导数分光光
度法在一定程度上解决了普通分光光度法难于解决的问题。导
数光谱最大的优点是分辨率得到了很大的提高：(1) 能够分辨 两个或两个以上完全重叠或以很小波长差相重叠的吸收峰；(2) 能够分辨吸光度随波长急剧上升时所掩盖的弱的吸收峰；(3) 能够确认宽阔吸收带的最大吸收波长。
在有机化学、生物化学和药物化学中，广泛应用双波长法作异构体或 类似物的同时测定。
(2)．单一组分测定中干扰组分影响的消除 当待测组分和共存组分吸收光谱重叠，严重干扰待测组分时，采用双
波长法可消除干扰组分的影响，提高测定的准确度。 (3). 双波长法作背景吸收和浑浊干扰的消除 在分光光度法分析中，有些显色剂或显色体系，在测定条件下，由于
由于双波长分光光度计光路结构和电学线路较为复杂，仪器 价格比较昂贵。
4. 双波长法应用
(1)．双组分同时测定 有些化学性质相似的元素，可在一定条件下同时与一种显色剂反应，
生成的有色配合物吸收光谱相互重叠，相互干扰测定。由于它们的化学性质 相似，一般难于找到合适的掩蔽剂来消除干扰影响。采用双波长法，通过适 当的波长组合，就能顺利地消除干扰影响，实现两组分同时测定。
光谱。 • 采用一波长固定，另一波长扫描，记录吸收光谱。可消除浑
浊背景的影响。 • 采用双笔记录器，可记录溶液中发生的两种现象。
从原理上讲，单波长法（单光束和双光束）和双波长法 的不同之处是：双波长用二个单色器，得到二个不同波长的 单色光，测量的是两个波长处的吸光度差，使用一个吸收池， 取消了参比池。
系数倍率K为：
K＝
K1
＝
AB 2
K2
AB 1
K
2
AB 2
－K1
AB1＝0
则上式为：
S＝K
2
AA2－K1
AA 1
该式表明，干扰组分消除，信号S与被测组分的吸光度值有关， 从而可以测定其含量。
2. 双波长分光光度计
双波长分光光度计采用两个单色器，如图所示。光源的光
束经两个单色器后分别产生波长为 λ1和λ2的两单色光，由切
光器使两单色光以一定的时间间隔交替通过同一吸收池，并被
光电倍增管交替接收，测得吸光度差A。当光强度为Io的两
单色光λ1和 λ2交替通过同一吸收池时，根据比耳定律，对λ1
波长：
A 1
lg
IO I 11 1bc 源自s1双波长分光光度计光路示意图
1. 光源，2、3 . 两个单色器，4 . 斩光器，5 . 样品池，6 . 光电倍增管。
白溶液作参比，消除了参比池的不同和制备空白溶液等产生的
误差。此外，使用同一光源来获得两束单色光，减小了由光源
电压变化而产生的误差，因此，灵敏度高。
3．双波长分光光度法的特点
双波长分光光度法的特点具有如下的特点： • 可进行浑浊试样的分析。 • 通过适当的波长组合，可进行双组合或三组合混合物的同时
测定。 • 当波长相差1~2nm时，使双波长同时扫描，可记录一阶导数
该两波长处的吸光度差A要足够大。由吸光度加和性知，混合 试样在λ2和λ1处的吸光度可表示为：
A2
AA 2
AB 2
A1
AA 1
AB 2
双波长分光光度计的输出信号为△A：
A A2 A1
合并以上三式
A
AA 2
AB 2
AA 1
AB 1
因
AB 2
AB 1
第二节 双波长和三波长分光光度法
一．双波长分光光度法的原理
双波长分光光度法是在传统的单波长分光度法的基础上发 展起来的。单波长分光光度法要求式样本身透明，不能有混 浊，如果是试样溶液在测量过程中逐渐产生浑浊便无法正确 测定。对于吸收峰相互重叠的组分或背景很深的试样分析， 也很难得到准确的结果。
双波长分光光度法的建立，在一定程度上克服了单波长 法的局限性，扩展了分光光度法的应用范围，在选择性、灵 敏度和测量精密度等方面都比单波长法有进一步的改善和提 高。
1．基本原理
对于混浊试样或成分复杂、背景吸收较大的试样，采用 经典的分光光度法就难以找到合适的参比溶液来消除其干扰。 若采用双波长分光光度法，将λ2选择在被测组分的最大吸收 波长处，λ1选择在基本无吸收的波长处，这样可以从分析波 长的信号中减去参比波长的信号，消除了干扰，大大提高了 方法的选择性和灵敏度。 (1)单组分的分析
在实际工作中，三波长法中的波长选择和计算比单波长法麻烦而费时，但 测定的准确度、精密度比解联立方程组分析混合组分的方法高。随着计算机 技术的普及，用电子计算机控制的分光光度计的广泛应用，已设计出三波长 法的专用计算程序，岛津UV-240、UV-260型双光束紫外-可见分光光度计就 是具有这种功能的仪器。可对样品溶液中待测组分的三波长自动 测定并进行结果计算，操作简便快速。
与双波长法相比 较，三波长法能更有 效地消除散射干扰物 的影响，因而更适合 于浑浊样品分析；此 外，对吸收干扰物， 如果在它的吸收光谱 上找不到合适的等吸 光度点，用一般分光 光度计就难于进行双 波长测定，而用三波 长法就可顺利完成测 定。
零点法原理示意图
2．三个波长的选择
(1) 等吸光度点法 如果在干扰组分的吸收光谱上能找到三个等吸光度点，且在此
测定波长λ2和λ1通常选用被测组分的最大吸收波长和等 吸光点波长进行测定。若无等吸光点或等吸光点无法准确确 定，可以选用被测组分的最大吸收波长和该组分吸收光谱曲 线下端的某一波长作为测定波长。
(2) 双组分中某一组分的分析 试样中含有A、B两组分，组分B干扰组分A的测定。若采用
双波长分光光度法，可不分离B而直接测定A的含量。 (a) 等吸光度波长法
三波长法原理图
式中，m和n分别表示(2 -1)和(3 -2)的数值。1、2和3 分别为待测物在三波长处的摩尔吸光系数；C为待测物的摩尔浓
度；b为光程。方程中的系数
可预先求得，A值
与待测物浓度成正比，因而可通过曲线求出样品中待测组分的
含量。
从上图可知，如选择的三个波长相应于吸收曲线上三点处
对λ2波长：
A 2
lg IO I 2
2 bc As2
式中，△As1和△As2为背景吸收，若λ1和λ2很相近，可视为相 等。因此通过吸收池后的光强度差为：
式中，△As1和△As2为背景吸收，若λ1和λ2很相近，可视为相 等。因此通过吸收池后的光强度差为：
A lg I1 I 2
一. 基本原理