双波长分光光度法测定ppt课件
§2.2 双波长和三波长分光光度法
2和K1分别为在λ2和 λ1处的放大系数；组分A和B 在λ2和 λ1处的吸光度分别为
A B A B A 、 A 和 A 、 A 2 1 1，则 2
S＝K2 A2＋K2 A2－K1 A1－K1 A1
调节仪器中的信号放大 器，使干扰组分B在波长λ2 和λ1处的信号相等，由此得 系数倍率K为：
第二节 双波长和三波长分光光度法 一．双波长分光光度法的原理
双波长分光光度法是在传统的单波长分光度法的基础上发 展起来的。单波长分光光度法要求式样本身透明，不能有混 浊，如果是试样溶液在测量过程中逐渐产生浑浊便无法正确 测定。对于吸收峰相互重叠的组分或背景很深的试样分析， 也很难得到准确的结果。 双波长分光光度法的建立，在一定程度上克服了单波长 法的局限性，扩展了分光光度法的应用范围，在选择性、灵 敏度和测量精密度等方面都比单波长法有进一步的改善和提 高。
二． 三波长分光光度法的原理和应用
1．基本原理
如图所示，在任一吸 收曲线上，可以在任意选 择的三个波长处测量吸光 度。根据三角形和三角形 相似，可推导出在上述三 个波长处测量的吸收度具 有下列函数关系： 三波长法原理图
式中，m和n分别表示(2 -1)和(3 -2)的数值。1、2和3 分别为待测物在三波长处的摩尔吸光系数；C为待测物的摩尔浓 度；b为光程。方程中的系数 可预先求得，A值 与待测物浓度成正比，因而可通过曲线求出样品中待测组分的 含量。 从上图可知，如选择的三个波长相应于吸收曲线上三点处 于一条直线上，则测得的A值为零。因此，当干扰组分的吸收 光谱为一直线（如浑浊产生的干扰），则在任选的三个波长处 测定，测得的值与干扰物浓度无关，如果干扰物为一吸收曲线， 只要在曲线上找到处在一条直线上的三点，在此三点相应的波 长处测定，由于干扰物在此三波长处的值为零，故测得的只与 待测组分的浓度有关。
PPT-双波长分光光度法测定复方磺胺甲恶唑片中磺胺甲恶唑的含量
3. 本法的主要误差来源何在？ 4. 在选择实验条件时，是否应考虑赋形剂等
辅料的影响？如何进行？ 5. 如果只测定磺胺甲恶唑，甲氧苄啶对照品
溶液的浓度是否需要准确配置？
E11c%m
10 M
o 物质在某一波长下的吸光系数 ，是物质对某一特定波长光吸
收能力的衡量；吸光系数越大 ，吸光能力越强，测定时灵敏 度越高。同一吸收物质在不同
。 波长下的E值是不同的
A是波长的函数，当LC=1 时，A＝E，可见吸光系数 也是波长的函数。
A AB 1
AA 1
AB 1
A 2
A 1
)lc
A
可见，在双波长分光光度法中吸光度的差值与干扰组
份B无关。
四 操作步骤
l 1）.对照品溶液的配制 精密称取105℃干燥至恒重的甲氧 苄啶对照品约10mg，用乙醇溶解并定容至100mL，精取 2.00mL置100mL量瓶中，用0.4%NaOH稀释至刻度，摇匀 。取在105℃干燥至恒重的磺胺甲恶唑对照品约50mg，精 密称定，同法配制溶液。
A 1
lc
A
B 1
lc
B
A AB 2
AA 2
AB 2
A 2
lc
A
B 2
lc
B
o 双波长分光光度法(双波长等吸收法)
当光谱重叠时，在其光谱中选择两波长，在选定的 波长处，干扰组分有相同的吸收；被测组分与干扰组 分的吸收有足够大的差别。则两波长处吸光度的差值 与被测组份的浓度成正比。
双波长分光光度法测定爱索尔感冒片中乙酰水杨酸的含量
双波长分光光度法测定爱索尔感冒片中乙酰水杨酸的含量目的建立双波长分光光度法测定爱索尔感冒片中乙酰水杨酸的含量的测定方法。
方法样品操作及测定方法同重复性试验，平行操作5批样品，另按照中和滴定法测定，比较两种测定方法测定所得样品的百分标示量。
结果双波长法：99.2%，97.9%，98.5%，96.5%，98.2%；中和法：100.8%，98.7%，99.8%，97.1%，99.4%。
乙酰水杨酸在255nm的波长处有最大吸收，盐酸吗啉胍在250nm的波长附近为225nm波长的等吸收波长，经过精选，选择250.1nm波长为参比波长，225nm波长为测定波长。
乙酰水杨酸乙醇溶液放置3h基本稳定，其他成分的乙醇溶液均稳定。
结论采用双波长分光光度法测定爱索尔感冒片中乙酰水杨酸的含量，操作简单，所用试剂方便易得，通过两种试验方法的比较，效果较满意。
标签：双波长分光光度法；爱索尔感冒片；乙酰水杨酸；含量爱索尔感冒片是乙酰水杨酸和盐酸吗啉胍的复方制剂，原质量标准采用中和滴定法测定乙酰水杨酸含量，且操作繁琐，本文改用双波长分光光度法测定爱索尔感冒片中乙酰水杨酸的含量，取得较满意的效果。
1 仪器与试药岛津UV-2100型紫外分光光度计；乙酰水杨酸对照品、盐酸吗啉胍对照品（符合中国药典2005年版规定）；乙醇为分析纯；爱索尔感冒片为市售品。
2 实验条件的选择精密称取乙酰水杨酸对照品适量，用乙醇配制成10ug/ml的溶液，按处方量配制盐酸吗啉胍溶液及辅料溶液，在200nm～300nm的波长范围内绘制吸收曲线。
结果表明：乙酰水杨酸在255nm的波长处有最大吸收，盐酸吗啉胍在250nm 的波长附近为225nm波长的等吸收波长，经过精选，选择250.1nm波长为参比波长，225nm波长为测定波长。
乙酰水杨酸乙醇溶液放置3h基本稳定，其他成分的乙醇溶液均稳定。
3 标准曲线的制备精密称取乙酰水杨酸约25mg和盐酸吗啉胍10mg，同置50ml量瓶中，加乙醇适量，振摇使溶解，并稀释至刻度摇匀。
双波长紫外分光光度法
②样品测定：取阿司匹林肠溶片20片，精密称定，研细。精密称取约 相当于阿司匹林50mg置于50mL容量瓶中，加乙醇适量，振摇使溶解 并定容，摇匀，滤过。精密量取续滤液2mL置25mL容量瓶中，加乙 醇至刻度，摇匀。分别在276nm、322nm波长处测定吸收度，用回 归方程计算阿司匹林的含量。
含量计算
阿司匹林制剂在体外的含量测定
——双波长紫பைடு நூலகம்分光光度法
原料
阿司匹林肠溶片
原理
采用双波长紫外分光法（测定波长为276nm和322nm），测定了阿 司匹林肠溶片的含量，可消除附加产物水杨酸的干扰。
方法
①标准曲线的绘制：精密称取阿司匹林对照品适量，加乙醇溶解使成 1000μg/mL的溶液。精密吸取1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mL，分置于 25mL容量瓶中，加乙醇至刻度，分别制成40，60，80，100和 120μg/mL的对照品溶液，以乙醇为空白，分别在276nm、322nm波； 长处测定吸收度，以浓度C和ΔA进行线性回归得出方程式。
分光光度法ppt课件
A
0.7 0.2
3.显色剂
显色剂的选择
• 灵敏度高,ε值大于104 • 选择性好 • 有色物组成确定且稳定 • 显色剂在测定波长处无明显吸收 显色条件的选择 •酸度 •显色剂用量
•显色时间和温度
（1）溶液的酸度 M+HR===MR+H+
* 影响显色剂的平衡浓度和颜色 * 影响被测金属离子的存在状态 * 影响络合物的组成 * pH与吸光度关系曲线确定pH范围。
B
电子能级
转动能级
振动能级
A
分子中电子能级、振动能级和转动能级示意图
由于光子的能量也是量子化的，所以 分子对光的吸收也是量子化的，即分 子只选择吸收能量与其能级间隔一致 的光子而不是对各种能量的光子普遍 吸收。
分子吸收光能后引起运动状态的变化称 为跃迁，跃迁产生吸收光谱
以吸收光强度为纵坐标,以波长为横 坐标作图,所得曲线即吸收光谱曲线
解：Cd的原子量为112.4，则
140×10-6
C Cd2+ = 112.4
=1.24×10-6mol·L-
A=εbc
ε =A/bc
0.220
ε=
=8.87×104 L·mol-1cm-1
2×1.24×10-6
朗伯-比尔定律的适用条件
1. 单色光
应选用max处或肩峰处测定
2. 吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线性关系 应控制条件(酸度、浓度、介质等)
λ
电磁波谱
Hale Waihona Puke 二、物质对光的选择性吸收溶液呈现不同的颜色是由于它对不同 波长的光具有选择性吸收而引起的.用 白光照射某有色溶液,呈现出的是透射 光颜色.吸收的色光和透过光称为互补 色光.
分光光度分析法ppt课件
Fe2++3R[Fe(3R)]2+ （红橙色，max=510 nm） （注： Fe3++3R[Fe(3R)]3+ ，兰色，max=600 nm ）
用盐酸羟胺还原，再显色反应，则可以测得溶液中总 铁含量：
2Fe3++2NH2OH·HCl=2Fe2++N2+2H2O+2Cl-
精选ppt课件
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三、实验步骤
H2O 稀至刻度
以试剂溶液作参比，在508 nm处，测定不同pH下的吸
光度，并且pH计测定相应溶液pH值，绘制A-pH曲线
，考察pH的影响。
精选ppt课件
32
5、标准溶液曲线的制作 按照书中方法配制0#~8#溶液，以0#为参比溶液，测
定1#~8#溶液的吸光度值，并且绘制A~c标准曲线。 6、未知样中总铁含量的测定 按照书中的方法配制9#溶液，测定其吸光度值，从标
精选ppt课件
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分光光度法测定铁的含量
一、实验目的 1、了解分光光度法测铁的基本原理； 2、学习分光光度法中显色与测量条件的优化与选择； 3、学习标准曲线的绘制以及试样测定方法； 4、了解分光光度计的性能、结构及使用方法。
精选ppt课件
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二、实验原理
A=bc
在一定实验条件下，A=kc，Ax值cx值。 pH3~9，Fe2+与Phen反应：
1、吸收曲线的制作
试样溶液：
1.00mL100mg/L 铁标
1.00mL10%盐酸羟胺
摇匀
50
2.00mL 0.15%邻二氮菲
5.00mL 1mol/L NaAC
H2O 稀至刻度
试剂溶液：不加铁标，其余同上配制。
双波长分光光度法
双波长分光光度法建立在Lambert—beer定律基础上的单波长分光光度分析技术，应用极为广泛，但由于单波长法存在混浊试样对光的散射和比色杯背景吸收等难以克服的缺点，它在高精度测量中的应用受到一定的限制。
为了解决浑浊试样对分光光度测定的干扰问题，美国的B.Chance于1951年制成了用振动镜使两束不同波长的单色光交替通过待测溶液的双波长分光光度计（Double Wavelength Spectrophotometer）,从而奠定了双波长分光光度法的基础。
随着科学技术的发展，双波长分光光度分析技术已日臻完善，与先进的后分光技术相结合，在生化自动化分析中得到了广泛的应用并显示出了光明的发展前景。
1 双波长分光光度法的原理双波长分光光度法是在传统分光光度法的基础上发展起来的，它的理论基础是差吸光度和等吸收波长。
它与传统分光光度法的不同之处，在于它采用了两个不同的波长即测量波长（又叫主波长λp,Primary Wavelength）和参比波长（又叫次波长λs, SecondWavelength）同时测定一个样品溶液[1,2]，以克服单波长测定的缺点，提高了测定结果的精密度和准确度。
早期的双波长分光光度计在测定时，两束不同波长的单色光经斩光器（Chopper，一种用于双波长分光光度计中使光束按一定周期反射，遮断或通过的装置）处理后，以一定的时间间隔交替照射[1]比色杯，经待测溶液吸收后，再照到光电管上，产生两个不同的吸光度，再将这两个吸光度相减，就得到了差吸光度ΔA。
根据Lamber—Beer定律, 得：Aλp=ελpLC+Ap (1)A λs=ελsLC+As (2)式中Aλp 、 A λs—分别为待测溶液在主波长和次波长处的吸光度，ελp 、ελs—分别为待测溶液在主波长和次波长处的摩尔吸光系数L—光径C—待测溶液的浓度Ap 、As—分别为待测溶液在主波长和次波长处的散射或背景吸收当λp 、λs相差不太大时，由同一待测溶液产生的光散射吸光度和背景吸光度大致相等，即Ap＝A s，将（1）式－（2）式得：Aλp－A λs＝ΔA＝（ελp－ελs）LC （3）对于同一待测溶液来说，ελp－ελs是一常数K，在光径L不变的情况下，（3）式可简化为：ΔA＝KC （4）（4）式说明，待测溶液在λp与λs两个波长处测定的差吸光度ΔA与试样中待测物质的浓度C成正比。
双波长叠加分光光度法测定水中微量氰化物
ｓ＝ ．１Ｘ１ ／ ｔ ｌ ｃ 。若 以 ｚ ４ ６ ０ Ｌ （ ｏ ・ ｍ） ｏ Ｓ ， ．２计 ， Ａ＝００ 其
检 出浓 度 为 ０ ０ ３ ｇ ｍ 。 ．０ ／ Ｌ
２ ７ 呈 色稳 定 性 ．
Ｃ 与异烟 酸 一硫代 巴比妥酸 首先形 成 红 色染 Ｎ一 料 ， 后 逐 渐 变 成 蓝 色 ， 在 ５ ５ ｎ 处 的 吸 光 度 然 其 ２ ｍ
在 实 验条 件 下 ，Ｎ一 异 烟酸 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ硫 代 巴 比妥 酸 Ｃ 与
收稿 日期 ：０ １０ —７ ２ １ —４ ０
溶液 ２ ３ Ｌ 搅拌 ， ８～ ０ｍ ， 使其溶解 后用纯水定 容至
吴 佑 琼 ： 波 长 叠 加 分 光 光 度 法 测 定 水 中 微 量氰 化 物 双
６１
形 成红 一蓝 色染 料 ， 该染 料分 别在 ５ ０— ３ ｍ 和 ２ ５０ｎ ６ ２ｎ ４ ｍ处各 有一 个 吸收峰 ， 应试 剂 空 白的最 大 吸 相 收 波长 位 于 ５ ０ｎ 处 ， 图 １ ３ ｍ 见 。
馏 出液 至 ５ ． Ｌ， 次 分 取 ５ ０ｍ ０ ０ｍ 每 ． Ｌ按 １２ １ 操 ．（） 作 测定 吸光 度 ， 以标 准 曲线 法 进 行氰 化 物定 量 ， 并 与异 烟 酸 一巴 比妥 酸 光 度 法 测 定 结 果 进 行 比
对。
氰 化 物 标 准 溶 液 ：．０ｍｇｍ （ 确 浓 度 用 银 ０ １ ／ Ｌ 准 盐法 标定 ） 临用 时 用 ０ ０ ｏ／ ， ．５ｍ ＬＬ的 Ｎ Ｏ 稀 释 成 ａＨ
１０ｒ （ ０ ｎ 此溶 液 ｐ Ｌ Ｈ值 近 中性 ） ；
氯 胺 Ｔ溶 液 ：０ ０ｇ Ｌ 用 时现 配 ； １ ． ／ ， ＮＯ ａ Ｈ溶液 ： ．０ ０ ０ ｏ ０ ５ 、 ．５ｍ ｗＬ；
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3
二、基本原理
当吸收光谱重叠的a、b两组分共 存时，若要消除a组分的干扰测定b组 分，可在a组分的吸收光谱上选择两 个吸收度相等的两波长λ1和λ2，测定 混合物的吸光度差值。然后根据ΔA 值计算b的含量。
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4
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5
磺胺甲噁唑（SMZ）在257nm波长 处有最大吸收；甲氧苄啶（TMP）在此 波长吸收最小并在 3 0 4 nm 波 长 附 近 有 一 等吸收点，故选定257nm为SMZ的测定 波长（λ2），在 3 0 4 nm波长附近选择参 比波长（λ1）。
(λ1)，要求ΔA＝Aλ2－Aλ1＝0。
.
14
再在λ2与λ1两波长处分别测定供试品 溶液的稀释液与对照品溶液(1)稀释液
的吸收度，求出各自的吸收度差值
(ΔA)，计算，即得。
.15四、操作注意事项测定之前应先检查仪器波长是否 准确。
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16
五、思考题
1．双波长分光光度法测定复方制剂有 何优点?
2．应用双波长分光光度法应如何选择 测定波长和参比波长?
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6
A257＝AS，257＋AT,257
A304＝AS，304＋AT,304 ΔA＝ A257－ A304 ∵AT,257＝AT,304
＝AS，257－AS，304
＝ΔEC SMZl ΔA与CSMZ有线性关 系。
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7
在λ2与λ1两波长处分别测定供试 品 溶 液 与 SMZ对照品溶液的吸收度，
求出供试品溶液吸收度差值 ( ΔAx) 、 SMZ对照品溶液的吸收度差值
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10
三、实验内容
1、供试品溶液的制备（教师准备）
取本品10片，精密称定，研细，精密 称取适量(约相当于磺胺甲噁唑50mg 与甲氧苄啶 1 0 mg)，置于 1 0 0 mL量瓶 中，加乙醇适量，振摇 1 5 分 钟 使 磺 胺 甲噁唑与氧苄啶溶解，加乙醇至刻度， 摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶 液。
.
17
精密量取供试品溶液与对照 品 溶 液 ( 1 ) ， ( 2 ) 各 2 mL，分别置 于 1 0 0 mL量瓶中，各加 0 . 4 ％ 氧 化钠溶液稀释至刻度，摇匀。
.
13
取对照品溶液(2)的稀释液，以257nm
为测定波长（λ2），在304nm波长附近(每 间隔0.5nm)选择等吸收点波长为参比波长
(ΔAs) ，计算，即得。
AxCx As Cs
Cx A Ax sCs
.
8
每片中含SMZ的毫克数
mSMZ
Cs
Ax 100W As W称1000
Cs = 0.505mg/ml
W称=0.06960g
W=552.64mg
.
9
由于参比波长对测定影响较大， 故采用对照品溶液来确定。此波长 可因仪器不同而异，测定时应仔细 选择。
实验六 双波长分光光度法测定 复方磺胺甲噁唑片中磺胺甲恶 唑的含量
.
1
一、实验目的 1．掌握双波长分光光度法测定原理。 2．学习双波长分光光度法在复方制 剂分析中的应用。
.
2
复方磺胺甲噁唑片的处方为： 磺胺甲噁唑（SMZ） 400g 甲氧苄啶 （TMP） 80g 制成1000片 每片含SMZ：360~440mg(Chp 2000)
.
11
二、对照品溶液的制备（教师准备）
精密称取在105℃干燥至恒重的磺 胺 甲 噁 唑 对 照 品 5 0 mg与甲氧苄啶对 照品 1 0 mg，分别置于 1 0 0 mL瓶中， 各加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀， 分别作为对照品溶液 ( 1 ) 与 对 照 品 溶 液(2)。
.
12
三、磺胺甲噁唑的测定