基因的转移 (1)

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3. 试剂的质量要高
所用的试剂纯度高，用AR或GR。 用超纯水配制。 使用试剂分装保存。

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4. 无菌操作，防止污染
在转化过程中，防止DNA 酶、杂菌和 杂DNA的污染，否则实验失败。 在无菌条件下操作。 所用新的离心管、tip头等，并经高压 灭菌。 所用试剂要灭菌。


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（4）电穿孔（electroporation） 主要机制：电流方式进行。 （5）显微注射（microinjection） 主要机制：在下显微镜，以微细针管穿 刺细胞将DNA射入。 （6）病毒感染（retrovirus infection） 主要机制：利用多种不同的病毒特性， 将DNA改造成病毒的一部份，另外病 毒本身有害基因也加以改造，再藉病毒 感染方式送入基因。

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图 磷酸钙沉淀法
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三、二乙氨乙基-葡聚糖法
二乙氨乙基（DEAE）—葡聚糖 （dextran）能促进哺乳动物细胞摄入 外源DNA。 吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分 DNA可以进入到细胞核里。

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三、LiCl 转化法
1. LiCl 利用Li+盐，使细胞膜具有通透性，允 许DNA进入。 2. PEG（聚乙二醇） 利用PEG，使细胞壁具有通透性，允许 DNA进入。 3. 转化的过程 下图。
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0.1mol/L LiCl处理
酵母
感受态
40% PEG 4000
插入外源DNA的酵母载体

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1. 接合作用 conjugation

当细菌通过菌毛相互接触时，质粒 DNA从一个细菌细胞转移至另一细菌 细胞，这种类型的DNA转移作用。 如F质粒 (F因子)的接合作用。

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图 F质粒 (F因子)接合作用
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2. 转化作用 transformation

定义*：受体细胞通过一些方法处理， 接受外源DNA而获得新的遗传表型。 将外源DNA导入细菌、酵母和植物细 胞的过程。由于外源DNA的进入而使 细胞遗传性改变。 受体细胞经过处理后，就容易接受外源 DNA的感受态细胞。
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图 转化作用
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3. 转导作用 transduction
（1）定义 通过病毒的感染作用，将外源DNA导 入的受体细胞的过程。 （2）程序 用病毒或噬菌体作载体，与目的DNA 重组后，在体外用外壳蛋白将重组 DNA包装成有活力的噬菌体或病毒， 就能以感染的方式，进入宿主细菌或细 胞，使目的DNA得以复制繁殖。

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二、转化的方法
转化大肠杆菌的方法有2类： 1. 感受态细胞法 将宿主细胞制备成感受态，这种细胞容 易接受外源DNA。 2. 电击法（电转化法） 利用电击的方法，在宿主细胞上瞬间打 “洞”，让外源DNA进入细胞内。
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三 感受态细胞的制备
（一）基本概念 由于质粒载体缺失了mob 基因，不能 自行接合转移，必须改变E.coli 质膜的 通透性。 1. 感受态* Compenent 受体细胞经过诱导，产生一种短暂的吸 收外源DNA的生理状态。 2. 感受态细胞 Compenent cells 经物理和化学方法处理，受体细胞膜的 通透性改变，允许外源DNA 进入。
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2. 感受态细胞的生长状态和密度
①生长状态 细菌生长密度达到对数生长期为好。 ②密度过高或不足均会影响转化效率。 DH5α菌的OD600 =0.5 时，细胞密度在 5×107 株/ml菌液时，较合适。
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2. 感受态细胞的生长状态和密度
③ CaCl2处理要充分 使细菌细胞膜失去一些蛋白。 ④感受态菌要储存在-70℃以下。感受态 菌融化必须迅速。融化后的感受态菌不 能再次冻存使用。多次转接的菌不可用。
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第二节 受体/宿主细胞
一、种类 细菌 E.coli 酵母 高等动物细胞 植物细胞
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二、受体细胞必须符合的条件
１.对重组DNA的复制和扩增没有严格的限制 ２.不存在特异的内切酶体系，降解外源DNA；
３.在重组DNA增殖过程中，不会被修饰；
４.重组缺陷型，不会产生体内重组；
５.容易导入重组DNA；
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3. 感受态假说
cacl2溶液制备感受态细胞的机制 假说1 细菌的细胞壁局部溶解，质膜穿孔，让 外源DNA进入。 假说2 细胞处于感受态时，表面形成一种可接 受DNA的酶位点，一旦细胞制备成感 受态细胞，就能稳定地摄取外源DNA 分子。

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（二） CaCl2制备感受态大肠杆菌
1. CaCl2的作用 改变细菌质膜通透性，允许DNA进入。 2. 操作程序 挑单菌落置培养基中。 过夜培养，至OD600=0.3 ~0.5 。 冰浴10 min。4℃离心，去培养液。 冰冷的0.1molCaCl2 悬浮菌体。 冰浴10 min 。4℃离心，去培养液。 冰冷的0.1molCaCl2 重悬浮菌体。 分装，-70 ℃冻存。
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四、原生质体转化法
原生质*：去除细胞壁后的酵母结构。 PEG（聚乙二醇）：使细胞壁具有通透 性，允许DNA进入。 CaCl2：使细胞膜具有通透性，允许 DNA进入。

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图 原生质体转化法
酵母菌
酶去壁 原生质体 CaCl2 PEG 感受态
插入外源DNA 的酵母载体
转化
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第五节 外源基因导入动物细胞
基因的转移
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内容提要
第一节 基因转移的概念 第二节 宿主细胞与条件 第三节 重组体导入原核细胞 一、转化 二、受体细胞 三、感受态大肠杆菌的制备 四、转化：重组DNA导入大肠杆菌

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第一节 基因转移的方法
定义：基因转移是重组DNA导入受体 细胞的过程。 一、基因转移的方法 转化作用 转导作用 转染作用 接合作用
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3. CaCl2法的优点
①方法简便，使用广泛。 ②转化效率高，106~108/gDNA。 可满足一般实验的要求。 ③制备的感受态E.coli，可于-70℃保存 半年（无菌甘油占总体积的15％）。
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图 制备感受态E.coli的过程
* 培养大
肠杆菌
On ice 30 min OD600至 0.3-0.4 用冰冷的 CaCl2重悬 冰冷CaCl2 重悬 On ice 10 min 4℃离心 收集菌 4℃离心 收集菌 用冰冷的 CaCl2重悬

病毒的感染与转染相区别！
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二、基因转移的目的
为什么要将重组体导入受体细胞？ 1. 大量扩增重组DNA 重组DNA量少，只有导入受体细胞，经多次 细胞分裂，可大量扩增重组体。 2. 防止DNA降解 获得的重组DNA，必须立即导入宿主细胞， 否则非常容易降解。 3. 纯化和筛选重组DNA 区分重组体和非重组体。被转化的宿主中， 含有多种形式DNA ，必须筛选真正重组体。
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二、 磷酸钙共沉淀法
形成含磷酸钙和DNA的沉淀。 程序：将DNA溶解在磷酸缓冲液中， 加入CaCl2溶液混匀。DNA被包裹在磷 酸钙晶体颗粒内。细胞膜形成吞噬泡， 磷酸钙晶体局部溶解膜结构，DNA便 进入受体细胞。再继续培养筛选转化株。 该法不需要载体。不同细胞吸收DNA 沉淀的能力不同。最多10%。
一、转染 transfection 1. 定义* 动物基因的转移感染作用，将DNA或 RNA转送进入活体细胞中。
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2. 转染的技术或方法
常用的转染方法有6种。 （1）磷酸钙（calcium phosphate） 主要机制：DNA附着到动物细胞之表面，然 后吞噬。 （2）二乙氨乙基-葡聚糖（DEAE-dextran） 主要机制：DNA附着到动物细胞之表面，然 后吞噬。 （3）脂质体（liposome） 主要机制：DNA带负电之磷酸根会与脂小体 表面之正电荷结合，脂小体带正电荷的部分 又会与细胞表面带负电荷的唾液酸结合，藉 以进行转染。
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② 体外包装的方法与过程
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③ 转导
通过受体大肠杆菌细胞表面的DNA接 受器位点（receptor site)，将带有外源 基因的重组体注入受体菌进行扩增。
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4. 转染 transfection
将外源DNA或病毒重组DNA直接导入 宿主细胞。 方法：CaCl2法处理宿主菌成感受态， 重组噬菌体DNA进入感受态细菌，进 行复制和繁殖。 采用人工脂质体包裹病毒DNA，再与 受体细胞膜融合，而将DNA导入宿主 细胞。
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图 热休克法 heat shock
10ng重组 DNA 冰上混合。摄入 吸附DNA 静置10分 DNA 42º C1 钟 100L感 分钟 受态菌 10-100L转 化液涂含抗 菌素的平板 37℃震 摇1小时 加入1mL LB培养基
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图 细菌的平板培养
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（四）影响转化率的因素
1. 重组质粒的质量和浓度 ①用于转化的重组质粒应是cccDNA。 1ng 的cccDNA 可使50μl 的感受态细胞 达到饱和。 ②转化效率与DNA 浓度在一定范围内 成正比。 DNA 过多，转化效率降低。 ③DNA 溶液的体积不应超过感受态细 胞体积的5％。
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图 常用 E.coli 菌株
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第三节 重组体导入原核细胞
一、一般概念
1. 转化 transformation

将重组DNA或外源基因导入宿主细胞（菌株） 的过程。 将经过转化后的细胞，在选择培养基中培养， 筛选出的带有重组DNA 的受体细胞（菌株）。
2. Βιβλιοθήκη Baidu化子 Transformant
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第四节 外源基因导入酵母细胞
一、 酵母菌株的选择 转化率高的酵母菌。 突变酵母菌株（与导入的载体基因互 补）。 不育的酵母菌株（不会与其他酵母接 合）。 常用的酵母菌：ura3-52、 trp1-289、 leu2、leu3、his3等。
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二、酵母细胞的载体
酵母的克隆和表达载体有4种类型： YIP（整合型质粒） YRP（复制型质粒） YEP（附加体质粒） YCP（着丝点质粒）。 其中，YEP附加体类质粒，含有2um质 粒，是构建酵母表达质粒载体中最常用 的。
转化子：即转化后在含抗生素的平板上长出 的菌落。
根据此培养皿中的菌落数，可计算出转化子 总数和转化频率，公式如下： 转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应 原液总体积／涂板菌液体积 转化频率＝ 转化子数／每mg 质粒DNA 或转化子总数／加入质粒DNA 量mg
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感受态细胞总数＝对照组菌落数×稀释 倍数×菌液总体积／涂板菌液体积 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感 受态细胞总数
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体外包装好的重组噬菌体感染受体菌， 使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。每 g DNA能形成106噬菌斑。 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出 来、再次感染另一（受体）细胞时，发 生在供体细胞与受体细胞之间的DNA 转移及重组。

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图 转导作用
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（3）体外包装的噬菌体的转导
① 体外包装 in vitro packaging 定义：将重组的噬菌体DNA或Cosmid 质粒包装成具有感染能力的噬菌体颗 粒。
６.符合重组DNA操作的安全标准。
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三、 E.coli受体细胞
1. 特性 用于转化的E.coli 细胞的特点
（1）限制修饰系统缺陷的突变体，即不含限制性 内切酶和甲基化酶的突变株 （Rˉ，Mˉ），
（2）允许外源DNA 进入E.coli体内，并稳定地遗 传给后代 。
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2. 受体菌的条件与选择 符合生物安全性的要求。 宿主菌的限制酶和重组酶应为缺陷型。 宿主菌处于感受态。 转化率。 3. 常用E.coli菌株 DH5α、DH10B JM101~JM109 其它
4℃离心 收集菌
分装，-70 ℃ 冻存
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（三）转化：热休克法 heat shock
1. 转化方法与过程 感受态细菌 加入重组质粒，置冰浴中混匀。 42℃，热休克。细菌摄入重组质粒。 加入LB培养基，37℃培养。 转化液接种到含抗菌素的平板 倒置培养， 37℃过夜 。

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3. 转化率
（1）定义 每 g DNA可转化的受体细胞（细菌克 隆）数。 （2）计算 转化细胞数/gDNA。 如1 ng pBR322产生104个转化子，吸收 的DNA分子只占总DNA的0.1%，转化 效率不高。
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（3）转化率的计算

统计每个培养皿中的菌落数。