基因的转移 (1)
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3. 试剂的质量要高
所用的试剂纯度高，用AR或GR。 用超纯水配制。 使用试剂分装保存。
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4. 无菌操作，防止污染
在转化过程中，防止DNA 酶、杂菌和 杂DNA的污染，否则实验失败。 在无菌条件下操作。 所用新的离心管、tip头等，并经高压 灭菌。 所用试剂要灭菌。
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二、转化的方法
转化大肠杆菌的方法有2类： 1. 感受态细胞法 将宿主细胞制备成感受态，这种细胞容 易接受外源DNA。 2. 电击法（电转化法） 利用电击的方法，在宿主细胞上瞬间打 “洞”，让外源DNA进入细胞内。
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三 感受态细胞的制备
（一）基本概念 由于质粒载体缺失了mob 基因，不能 自行接合转移，必须改变E.coli 质膜的 通透性。 1. 感受态* Compenent 受体细胞经过诱导，产生一种短暂的吸 收外源DNA的生理状态。 2. 感受态细胞 Compenent cells 经物理和化学方法处理，受体细胞膜的 通透性改变，允许外源DNA 进入。
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3. CaCl2法的优点
①方法简便，使用广泛。 ②转化效率高，106~108/gDNA。 可满足一般实验的要求。 ③制备的感受态E.coli，可于-70℃保存 半年（无菌甘油占总体积的15％）。
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图 制备感受态E.coli的过程
* 培养大
肠杆菌
On ice 30 min OD600至 0.3-0.4 用冰冷的 CaCl2重悬 冰冷CaCl2 重悬 On ice 10 min 4℃离心 收集菌 4℃离心 收集菌 用冰冷的 CaCl2重悬
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（4）电穿孔（electroporation） 主要机制：电流方式进行。 （5）显微注射（microinjection） 主要机制：在下显微镜，以微细针管穿 刺细胞将DNA射入。 （6）病毒感染（retrovirus infection） 主要机制：利用多种不同的病毒特性， 将DNA改造成病毒的一部份，另外病 毒本身有害基因也加以改造，再藉病毒 感染方式送入基因。
一、转染 transfection 1. 定义* 动物基因的转移感染作用，将DNA或 RNA转送进入活体细胞中。
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2. 转染的技术或方法
常用的转染方法有6种。 （1）磷酸钙（calcium phosphate） 主要机制：DNA附着到动物细胞之表面，然 后吞噬。 （2）二乙氨乙基-葡聚糖（DEAE-dextran） 主要机制：DNA附着到动物细胞之表面，然 后吞噬。 （3）脂质体（liposome） 主要机制：DNA带负电之磷酸根会与脂小体 表面之正电荷结合，脂小体带正电荷的部分 又会与细胞表面带负电荷的唾液酸结合，藉 以进行转染。
基因的转移
1
内容提要
第一节 基因转移的概念 第二节 宿主细胞与条件 第三节 重组体导入原核细胞 一、转化 二、受体细胞 三、感受态大肠杆菌的制备 四、转化：重组DNA导入大肠杆菌
2
第一节 基因转移的方法
定义：基因转移是重组DNA导入受体 细胞的过程。 一、基因转移的方法 转化作用 转导作用 转染作用 接合作用
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二、 磷酸钙共沉淀法
形成含磷酸钙和DNA的沉淀。 程序：将DNA溶解在磷酸缓冲液中， 加入CaCl2溶液混匀。DNA被包裹在磷 酸钙晶体颗粒内。细胞膜形成吞噬泡， 磷酸钙晶体局部溶解膜结构，DNA便 进入受体细胞。再继续培养筛选转化株。 该法不需要载体。不同细胞吸收DNA 沉淀的能力不同。最多10%。
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第二节 受体/宿主细胞
一、种类 细菌 E.coli 酵母 高等动物细胞 植物细胞
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二、受体细胞必须符合的条件
１.对重组DNA的复制和扩增没有严格的限制 ２.不存在特异的内切酶体系，降解外源DNA；
３.在重组DNA增殖过程中，不会被修饰；
４.重组缺陷型，不会产生体内重组；
５.容易导入重组DNA；
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3. 转化率
（1）定义 每 g DNA可转化的受体细胞（细菌克 隆）数。 （2）计算 转化细胞数/gDNA。 如1 ng pBR322产生104个转化子，吸收 的DNA分子只占总DNA的0.1%，转化 效率不高。
23（3）转化率的计算源自统计每个培养皿中的菌落数。
６.符合重组DNA操作的安全标准。
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三、 E.coli受体细胞
1. 特性 用于转化的E.coli 细胞的特点
（1）限制修饰系统缺陷的突变体，即不含限制性 内切酶和甲基化酶的突变株 （Rˉ，Mˉ），
（2）允许外源DNA 进入E.coli体内，并稳定地遗 传给后代 。
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2. 受体菌的条件与选择 符合生物安全性的要求。 宿主菌的限制酶和重组酶应为缺陷型。 宿主菌处于感受态。 转化率。 3. 常用E.coli菌株 DH5α、DH10B JM101~JM109 其它
4℃离心 收集菌
分装，-70 ℃ 冻存
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（三）转化：热休克法 heat shock
1. 转化方法与过程 感受态细菌 加入重组质粒，置冰浴中混匀。 42℃，热休克。细菌摄入重组质粒。 加入LB培养基，37℃培养。 转化液接种到含抗菌素的平板 倒置培养， 37℃过夜 。
病毒的感染与转染相区别！
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二、基因转移的目的
为什么要将重组体导入受体细胞？ 1. 大量扩增重组DNA 重组DNA量少，只有导入受体细胞，经多次 细胞分裂，可大量扩增重组体。 2. 防止DNA降解 获得的重组DNA，必须立即导入宿主细胞， 否则非常容易降解。 3. 纯化和筛选重组DNA 区分重组体和非重组体。被转化的宿主中， 含有多种形式DNA ，必须筛选真正重组体。
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图 常用 E.coli 菌株
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第三节 重组体导入原核细胞
一、一般概念
1. 转化 transformation
将重组DNA或外源基因导入宿主细胞（菌株） 的过程。 将经过转化后的细胞，在选择培养基中培养， 筛选出的带有重组DNA 的受体细胞（菌株）。
2. 转化子 Transformant
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三、LiCl 转化法
1. LiCl 利用Li+盐，使细胞膜具有通透性，允 许DNA进入。 2. PEG（聚乙二醇） 利用PEG，使细胞壁具有通透性，允许 DNA进入。 3. 转化的过程 下图。
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0.1mol/L LiCl处理
酵母
感受态
40% PEG 4000
插入外源DNA的酵母载体
3
1. 接合作用 conjugation
当细菌通过菌毛相互接触时，质粒 DNA从一个细菌细胞转移至另一细菌 细胞，这种类型的DNA转移作用。 如F质粒 (F因子)的接合作用。
4
图 F质粒 (F因子)接合作用
5
2. 转化作用 transformation
定义*：受体细胞通过一些方法处理， 接受外源DNA而获得新的遗传表型。 将外源DNA导入细菌、酵母和植物细 胞的过程。由于外源DNA的进入而使 细胞遗传性改变。 受体细胞经过处理后，就容易接受外源 DNA的感受态细胞。
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图 磷酸钙沉淀法
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三、二乙氨乙基-葡聚糖法
二乙氨乙基（DEAE）—葡聚糖 （dextran）能促进哺乳动物细胞摄入 外源DNA。 吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分 DNA可以进入到细胞核里。
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体外包装好的重组噬菌体感染受体菌， 使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。每 g DNA能形成106噬菌斑。 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出 来、再次感染另一（受体）细胞时，发 生在供体细胞与受体细胞之间的DNA 转移及重组。
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图 转导作用
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（3）体外包装的噬菌体的转导
① 体外包装 in vitro packaging 定义：将重组的噬菌体DNA或Cosmid 质粒包装成具有感染能力的噬菌体颗 粒。
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3. 感受态假说
cacl2溶液制备感受态细胞的机制 假说1 细菌的细胞壁局部溶解，质膜穿孔，让 外源DNA进入。 假说2 细胞处于感受态时，表面形成一种可接 受DNA的酶位点，一旦细胞制备成感 受态细胞，就能稳定地摄取外源DNA 分子。
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（二） CaCl2制备感受态大肠杆菌
1. CaCl2的作用 改变细菌质膜通透性，允许DNA进入。 2. 操作程序 挑单菌落置培养基中。 过夜培养，至OD600=0.3 ~0.5 。 冰浴10 min。4℃离心，去培养液。 冰冷的0.1molCaCl2 悬浮菌体。 冰浴10 min 。4℃离心，去培养液。 冰冷的0.1molCaCl2 重悬浮菌体。 分装，-70 ℃冻存。
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② 体外包装的方法与过程
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③ 转导
通过受体大肠杆菌细胞表面的DNA接 受器位点（receptor site)，将带有外源 基因的重组体注入受体菌进行扩增。
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4. 转染 transfection
将外源DNA或病毒重组DNA直接导入 宿主细胞。 方法：CaCl2法处理宿主菌成感受态， 重组噬菌体DNA进入感受态细菌，进 行复制和繁殖。 采用人工脂质体包裹病毒DNA，再与 受体细胞膜融合，而将DNA导入宿主 细胞。
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2. 感受态细胞的生长状态和密度
①生长状态 细菌生长密度达到对数生长期为好。 ②密度过高或不足均会影响转化效率。 DH5α菌的OD600 =0.5 时，细胞密度在 5×107 株/ml菌液时，较合适。
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2. 感受态细胞的生长状态和密度
③ CaCl2处理要充分 使细菌细胞膜失去一些蛋白。 ④感受态菌要储存在-70℃以下。感受态 菌融化必须迅速。融化后的感受态菌不 能再次冻存使用。多次转接的菌不可用。
基因治疗
与安全性相联系的就是生殖细胞基因治疗。虽然在人类尚未实施，但在动物实验已获成功，这就是转基因的 动物出现。这一事实既给人类生殖细胞基因治疗带来了希望，同时也使人们耽心这种遗传特征的变化世代相传， 将给人类带来的是福还是祸。
概念
狭义概念
广义概念
狭义概念
指用具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，因而达到治疗疾病的目的。
广义概念
基因治疗指把某些遗传物质转移到患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的方法。
主要分类
按靶细胞
按基因操作
给药途径
按基因操作
基因治疗一类为基因修正（gene correction）和基因置换（gene replacement），即将缺陷基因的异常序 列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，不涉及基因组的其他任何改变。通过同源重组（homologous recombination）即基因打靶（gene targetting）技术将外源正常的基因在特定的部位进行重组，从而使缺陷基 因在原位特异性修复。另一类为基因增强（gene augmentation）和基因失活（gene inactivation），是不去除 异常基因，而通过导入外源基因使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因等的功能；或特异封闭某些基因的翻译或 转录，以达到抑制某些异常基因表达。
①ex vivo途径：这是指将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体细胞（或异种细胞），经体外细胞 扩增后，输回人体。ex vivo基因转移途径比较经典、安全，而且效果较易控制，但是步骤多、技术复杂、难度大， 不容易推广；
②in vivo途径：这是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体，直接导入体内。这种载体可以是病毒型或 非病毒性，甚至是裸DNA。in vivo基因转移途径操作简便，容易推广，但尚未成熟，存在疗效持续时间短，免疫 排斥及安全性等一系列问题。
基因的转移 PPT课件
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二、转化的方法
转化大肠杆菌的方法有2类： 1. 感受态细胞法 将宿主细胞制备成感受态，这种细胞容 易接受外源DNA。 2. 电击法（电转化法） 利用电击的方法，在宿主细胞上瞬间打 “洞”，让外源DNA进入细胞内。
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三 感受态细胞的制备
（一）基本概念 由于质粒载体缺失了mob 基因，不能 自行接合转移，必须改变E.coli 质膜的 通透性。 1. 感受态* Compenent 受体细胞经过诱导，产生一种短暂的吸 收外源DNA的生理状态。 2. 感受态细胞 Compenent cells 经物理和化学方法处理，受体细胞膜的 通透性改变，允许外源DNA 进入。
６.符合重组DNA操作的安全标准。
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三、 E.coli受体细胞
1. 特性 用于转化的E.coli 细胞的特点
（1）限制修饰系统缺陷的突变体，即不含限制性 内切酶和甲基化酶的突变株 （Rˉ，Mˉ），
（2）允许外源DNA 进入E.coli体内，并稳定地遗 传给后代 。
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2. 受体菌的条件与选择 符合生物安全性的要求。 宿主菌的限制酶和重组酶应为缺陷型。 宿主菌处于感受态。 转化率。 3. 常用E.coli菌株 DH5α、DH10B JM101~JM109 其它
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体外包装好的重组噬菌体感染受体菌， 使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。每 g DNA能形成106噬菌斑。 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出 来、再次感染另一（受体）细胞时，发 生在供体细胞与受体细胞之间的DNA 转移及重组。
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图 转导作用
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（3）体外包装的噬菌体的转导
① 体外包装 in vitro ing 定义：将重组的噬菌体DNA或Cosmid 质粒包装成具有感染能力的噬菌体颗 粒。
2012级八年制-第三章：细菌的遗传与变异
E.种内或种间存在广泛的基因交换
◎ Pathogenicity islands（also called Toxicity Islands,
fitness islands, ecological islands, symbiosis
② 转座子(Transposon, Tn)
Ⅰ. 定义
除了两端的IS和携带的转座酶编码基因
及转录调节蛋白以外还携带有一个或多个其
他基因（如耐药基因、重金属抗性基因等）
的转位因子。
Ⅱ 结构特点
a. 两侧带IS。
b. 中心序列除编码转座酶及与转录有关的调节蛋
白外，尚带有其它基因如耐药基因等。
Ⅲ.分类
① 插入序列 (Insertion sequence, IS)
Ⅰ.定义
仅含转座酶及转录调节蛋白编码基因的转
座元件，是细菌（也包括其它生物）基因组
（包括染色体、质粒及噬菌体）的正常组分。
Ⅱ 结构特点
a. 两侧带长度不一定相等的反向重复序列，其中 有3～10个bp为转座酶的识别位点。 b. 中心序列仅编码转座酶及与转录有关的调节蛋 白。 c. 插入序列的转座可以是双向的，即可通过正向 或反向整合到基因组上。 d. 可独立存在，也可以是转座子的一部分。 e. 长度一般在2.2k bp以下。
Ⅲ. 特点
※ 定位于细菌染色体、质粒或转座子上
※ 基本结构：两端为保守末端，中间为可变区，含
一个或多个基因盒 ※ 整合子含有3个功能元件：重组位点；整合酶基 因；启动子 ※ 通过转座子或接合性质粒，使多种耐药基因在细
菌中进行水平传播
生物技术概论第二版答案
⽣物技术概论第⼆版答案第⼀章1、现代⽣物技术是⼀项⾼技术，它具有⾼技术的“六⾼”特征是指哪“六⾼’’?⾼成长率；⾼利润；⾼风险率；⾼变化率；⾼知识⽔平2、什么是⽜物技术、它包括哪些基本的内容’它对⼈类社会将产⽣怎么样的影响?⽣物技术是指⼈们以现代⽣命科学为基础，结合其他基础学科的科学原理，采⽤先进的⼯程技术⼿段，按照预先的设计改造⽣物体或加⼯⽣物原料，为⼈类⽣产出所需产品或达到某种⽬的。
⽣物技术主要包括基因⼯程、细胞⼯程、两⼯程、发酵⼯程和蛋⽩质⼯程等新技术。
⽣物技术被世界各国观为⼀项⾼新技术，它⼴泛应⽤于医药卫⽣、农林牧渔、轻⼯、⾷品、化⼯和能源等领域，促进传统产业的技术改造和新兴产业的形成，对⼈类社会⽜活特产⽣深远的⾰命性的影响：⽣物技术对于提⾼国⼒，迎接⼈类所⾯临的诸如⾷品短缺、健康问题、环境问题及经济问题的挑战是⾄关重要的；⽣物技术是现实⽣产⼒，也是具有巨⼤经济效益的潜在⽣产⼒，它将是21世纪⾼技术⾰命的核⼼内容。
3、为什么说⽣物技术是⼀门综合性的学科，它与其他学科商什么关系?⽣物技术是由多学科综合⽽成的⼀门新学科。
就⽣物科学⽽⾔，它包括了微⼩物华、⽣物化学、细胞⽣物学、免疫学、育种技术等⼏乎所有增⽣命科学有关的学科，特别是现代分⼦⽣物学的最新理论成就更是⽣物技术发展的基础。
4、简要说明⽣物技术的发展史以及现代⽣物技术与传统⽣物技术的关系。
传统⽣物技术在⽯器时代后朗．我国⼈民就会利⽤⾕物造酒，这是最早的发酵技术。
在公元前221年，周代后期，我国⼈民就能制作⾖腐、酱和酷，并⼀直沿⽤⾄今。
公元lo世纪，我国就有了预防灭花的活疫苗；到了明代，就已经⼴泛地种植痘苗以预防天花。
16世纪，我国的医⽣已经知道被疯狗咬伤可传播狂⽝病。
在西⽅，苏美尔⼈和巴⽐伦⼈在公元前6000年就已开始啤酒发酵。
埃及⼈则在公元前4000年就开始制作⾯包：现代⽣物技术现代⽣物技术是以20世纪70年代DNA重组技术的建⽴为标志的。
生物化学第十四章-基因重组和基因工程
第十四章基因重组和基因工程一、自然界的基因转移和重组：基因重组(gene recombination)是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。
1．接合作用：当细胞与细胞相互接触时，DNA分子即从一个细胞向另一个细胞转移，这种遗传物质的转移方式称为接合作用（conjugation）。
2．转化和转染：由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。
噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。
通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。
转染是转化的一种特殊形式。
3．整合和转导:外来DNA侵入宿主细胞，并与宿主细胞DNA进行重组，成为宿主细胞DNA的一部分，这一过程称为整合。
整合在宿主细胞染色体DNA中的外来DNA，可以被切离出来，同时也可带走一部分的宿主DNA，这一过程称为转导(transduction)。
来源于宿主DNA的基因称为转导基因。
4．转座：转座又称为转位（transposition），是指DNA的片段或基因从基因组的一个位置转移到另一个位置的现象。
这些能够在基因组中自由游动的DNA片段包括插入序列和转座子两种类型。
⑴插入序列：典型的插入序列（insertion sequence，IS）是长750-1500bp的DNA片段，由两个分离的反向重复序列和一个转座酶基因。
当转座酶基因表达时，即可引起该序列的转座。
其转座方式主要有保守性转座和复制性转座。
⑵转座子：转座子(transposons)是可从一个染色体位点转移到另一个位点的分散的重复序列，含两个反向重复序列、一个转座酶基因和其他基因（如抗生素抗性基因）。
免疫球蛋白重链基因由一组可变区基因（VH）和一组恒定区基因（CH）构成，通过这些基因的选择性转座和重组，就可以转录表达出各种各样的免疫球蛋白重链，以对付不同的抗原。
基因转移与重组概述
染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就 越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。
Hfr ×F-杂交
3.F′×F-杂交——性导
Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游 离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。
3.性导——F′×F-杂交
初
生
F′
F′×F-与F+×F-的不同点：
F因子为附加体质粒，既可以脱离染色体在细 胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上
（三）接合
F因子的四种细胞形式（掌握）
①F-菌株(“雌性”菌株)：不含F因子，无性菌毛，但可以 通过接合作用接收F因子而变成F+菌株。 ②F+菌株(“雄性”菌株)：F因子独立存在，细胞表面有性
菌毛。 ③Hfr菌株：F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性 菌
溶源转变特点
1. 噬菌体不携带任何供体菌的基因； 2. 噬菌体是完整的，而不是缺陷的； 3. 噬菌体基因的整合到宿主染色体上导致宿 主获得新性状，未通过基因重组而形成的稳 定转导子； 4. 宿主获得新性状具有不稳定性。
（三）接合(conjugation)
通过细胞与细胞的直 接接触而产生的遗传信 息的转移和重组过程。
（一）转化
供体菌
DNA片段
受体菌
转化子（transformant）：转化后的受体
感受态
来自Trp+细胞的DNA
色氨酸缺陷型 没有色氨酸野生型生长
在缺乏色氨 酸培养基上 有菌落产生 （野生型）
自然转化的必要条件
1、建立感受态的受体细胞 感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞。 自然感受态：细胞一定生长阶段的生理特性，受自 身的基因控制（感受态因子）。 人工感受态：通过人为诱导，使细胞具有摄取DNA 的能力，或将DNA导入细胞内。
细菌的遗传和变异
5、质粒的转移
细菌质粒可在同种、同属或不同属细菌间转移
方式： 接合性耐药性质粒，通过性菌毛接合转移 非接合性耐药性质粒，通过噬菌体为媒介 将DNA中信息转移；
结果：耐药菌可以将耐药基因转移至敏感菌，
使敏感菌也携带了耐药性，成为耐药菌；
（三）细菌转位子
1 、定义： 为存在于细菌的染色体或质粒上一段
表达调控：
（1）调控部位：起动子、终止子
（2）调节蛋白：阻遏蛋白
（3）效应物分子
乳糖操纵子模型
Francois Jacob和Jacques Monod提出，
E.coli 利用乳糖需两种酶：
LacZ基因编码的半乳糖苷酶→乳糖来自解为葡萄糖、半乳糖LacY基因编码的半乳糖穿透酶→将乳糖运输入细胞内
LacA基因编码转酰基酶→与前两酶一起受调控
减弱：BCG（卡介苗） Calmette 和Guerin 230次历时13年之久 传代培养，毒力减弱，抗原性不变的菌株。预 防接种，不致病，但可获得免疫力。 增强： 无荚膜肺炎链球菌→小白鼠腹腔接种， 毒力增强→产生荚膜；
（五）耐药性变异
对某种药物敏感的细菌变成对该药耐受的
变异称为耐药性变异；
染色体耐药基因的突变 耐药性质粒的转移 转座子的插入 →细菌产生特定的酶类或多肽 类物质→阻挡药物向靶细胞穿 透、发生新的代谢途径；
染色体（核质）
质粒
（一）细菌的染色体
1、特点：
（ 1 ）一条环状双螺旋长链，反复扭曲折叠，
呈负超螺旋结构； （2）长度约菌体1000倍，分子量109dal左右
2、细菌染色体的复制；
E.coli约需要20分钟，平均每分钟105bp
复制叉（replicating fork）
转基因方法
转基因方法一、基因枪法：1、综述：基因枪法又称为高速微弹法、微粒抢法、微粒轰击法，是由康奈尔大学的Sanford等于1987年首次研制出的火药引爆基因枪，并与该校工程技术专家Wolf及Kallen合作研究出的一种基因转移的新方法。
1990年美国杜邦公司推出商品基因枪PDS-1000系统。
在此期间，高压放电、压缩气体驱动等各种基因枪相继出现，并都在重复的实践中得到改进和发展。
其改进的核心是粒子加速系统，以提高射弹的可控度，即粒子速度和射入的浓度等。
2、基本原理：其基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。
微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化。
根据基因枪的动力系统，可将它们分为三种类型：一类是以火药爆炸力为加速动力，其显著特征是塑料子弹和阻挡板。
塑料子弹前端载放已沉淀有DNA的钨金粉。
当火药爆炸时，塑料子弹带着钨金粉向下高速运动，至阻挡板时，塑料子弹被阻遏，而其前端的钨金粉粒子继续以高速向下运动，击中样品室的靶细胞。
其粒子的速度主要是通过火药的数量及速度调节器控制，不能做到无级调整，可控度较低。
第二类是以高压气体作为动力，如以氦气、氢气、氮气等。
其工作原理是把载有DNA 的钨金粉喷洒在一张微粒载片上，电极间悬滴众着微水滴。
在压缩空气的冲击下，微水滴雾状喷射，驱动载片。
当载片受阻于金属筛网时，载有DNA的钨金粒继续向下冲击射入细胞。
第三类是以高压放电为驱动力。
其最大优点是可以无级调速，通过变化工作电压，粒子速度及射入浓度可准确控制，使载有DNA的钨金粉粒子能到达具有再生能力的细胞层。
3、步骤：（1）微粒体的洗涤。
取60-100mg钨或金粉，溶于1ml无水乙醇中，用超声波振荡洗涤。
微粒体处理后可在密闭条件下室温贮存一周。
离心除去乙醇，密闭贮存于室温中，备用，保存时间不要超过一周。
（2）DNA微粒载体的制备。
基因治疗
基因矫正、基因置换、基因失活、基因修饰
从临床治疗角度，目前肿瘤基因基因治疗的策略
直接杀伤肿瘤细胞或抑制其生长； 增强机体免疫系统，间接杀伤或抑制肿瘤胞； 改善肿瘤常规治疗方法，提高疗效；
肿瘤基因治疗常用方法
基因干预技术 反义RNA技术：①封闭异常表达的癌基因； ② 作用癌基因的易位和重排部位；⑶抑制肿瘤细胞 的耐药性，提高化疗效果。 RNA干扰技术：用于阻断、抑制癌基因异常表 达的恶性肿瘤治疗。 反义基因技术：设计原癌基因启动子的竞争剂， 从而抑制原癌基因转录。
遗传病的基因治疗研究
人类遗传病4000多种，发病率为40-50%， 必须符合以下要求的遗传病才可考虑开展 基因治疗研究：（30余种） 在DNA水平上明确其发病原因及机制； 单基因遗传病，而且属隐形遗传； 该基因的表达不需要精确调控； 该基因能在一种便于临床操作的组织细胞 中表达并发挥其生理作用； 该遗传病不经治疗将有严重后果。
基因转移的生物学与非生物学方法
生物学方法：以病毒载体作为转移系统
逆转录病毒基因组经过改造后作为载体 ( retrovirus vector) 腺病毒(adenovirus,AV)基因组可作为载体携带治疗基因
腺病毒相关病毒（adenovirus associated virus, AAV)载体适合治疗基因的稳定长效表达。
几种已经或可望在临床进行基因治疗的 人类单基因遗传病
腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶（PNP) 缺乏症； 血友病：针对凝血因子Ⅸ基因； 中国科学家1991年12月成功进行了血友病B的基因 治疗。 将携带凝血因子Ⅸ基因的巨细胞病毒载体导入患者 自身皮肤的成纤维细胞—— 经体外培养---再植入患者皮下----患者血浆中凝血因子Ⅸ浓度 上升，凝血活性改善。
第章基因水平转移
主要内容
细菌可移动遗传元件 水平基因转移方式及机制 水平基因转移生物进化意义 水平基因转移障碍
水平基因转移环境修复领域意义
第一节：细菌的可移动遗传元件
水平基因转移 (horizontal gene transfer) ➢ 差异生物个体之间，或单个细胞内部细胞器之间所进行的遗传物质的交 流 ➢ 水平基因转移不仅发生在细菌之间，而且也发生在细菌与高等动物之间， 甚至高等动物之间
第一节：细菌的可移动遗传元件
复杂转座子(complex transposon) 接合型转座子(conjugative transposon)
两端是短(30-40bp)的末端反向复 杂序列(IR)或同向重复序列(DR)， 中央是转座酶基因和抗药性基因
通过接合作用转移的转座子，末端没有重 复序列，但含有整合酶基因、切离酶基因、 接合型转移基因及抗生素基因
病毒基因以及形成新代谢路径的代谢基因 ➢ 取决于基因模块的组成，同一种GEIs可促进不同类型微生物的进化，例
如致病菌和环境微生物
第一节：细菌的可移动遗传元件
基因组岛（例：细菌水平基因转移与进化的工具）
GEI总体特性图 GEIs是一段大的DNA 片段，核酸特性不 同于其他染色体。 GEI通常插入于tRNA 基因，靠近DR酶 GEIs有与基因迁移相 关的编码子，例如 整合酶, 转座酶和插 入序列。根据基因 含量，GEIs被称为致 病性岛、共生岛、 代谢岛、抗性岛、 FEMS MicrobiolR适ev应3岛3 (等2009) 376– 393
启动子识别障碍
宿主细胞的RNA聚合酶不能有效地识别外源基因的转录信号
第四节：水平基因转移的障碍
复制障碍 • 质粒的复制需要多种蛋白质因子参与，其中一种蛋白质因子不表达或低表达，