基因转移及方法

第一轮聚合链反应
DNA 模板(pUC19- TNF 用Hind Ⅲ切后)
引物A
TNFcDNA
DNA 模板(pUC19- TNF用HindⅢ切后) TNFcDNA 引物 D
5' Hind Ⅲ 引物 C
3' Hind Ⅲ 5' Hind Ⅲ
引物 B 3' Hind Ⅲ
5'半分子
突变区
突变区
3' 半分子
第二轮聚合链反应
理
构建流程
组织细胞 ↓破碎细胞，除去DN源自文库与蛋白质
提取总RNA ↓oligo（dT）纤维素亲合柱层析
制备mRNA ↓反转录 合成cDNA第一链 ↓置换法；外加引物法 合成cDNA第二链 ↓加接头，插入载体 重组DNA ↓导入宿主扩增
构建cDNA文库
酶法——Sanger双脱氧链终止法
原理：2’，3’ddNTP与dNTP不同之处在于脱氧核糖 的3’ 位置缺少一个羟基。它们可以在DNA聚合酶 作用下通过其5’ 三磷酸基团掺入到DNA链中，但 不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链，DNA链就不 可能继续延伸。这样，合成时在4种dNTP中加入 少量的一种ddNTP后， 链延伸将与偶然发生但十 分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核 苷酸链，长度取决于从用以起始DNA合成的引物 末端到出现链终止位置之间的距离。在4组独立的 酶反应中分别采用4种不同ddNTP，结果将产生4 组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个A、 T、C、G位置上。
记技术
酶法——Sanger双脱氧链终止法
原理：2’，3’ddNTP与dNTP不同之处在于脱氧核糖 的3’ 位置缺少一个羟基。它们可以在DNA聚合酶 作用下通过其5’ 三磷酸基团掺入到DNA链中，但 不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链，DNA链就不 可能继续延伸。这样，合成时在4种dNTP中加入 少量的一种ddNTP后， 链延伸将与偶然发生但十 分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的 核苷酸链，长度取决于从用以起始DNA合成的引 物末端到出现链终止位置之间的距离。在4组独立 的酶反应中分别采用4种不同ddNTP，结果将产生 4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个 A、T、C、G位置上。
方法： M 13，ddNTP法
➢ 步骤 ：
➢ 1.待测定 DNA 插入双链 M 13 复制型 DNA 中
➢ 2.菌体中扩增，提取单链 M 13 DNA ➢ 3.按待测 DNA 3’端前方的互补序列人工合成
➢ 自动测序仪：荧光标记
化学法——Maxam－Gilbert DNA 化学降解法
➢ 原理：一个末端标记的DNA片段在5组互相独立 的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反 应特异地针对于某种或某一类碱基。因此生成5组 放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末 端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中 均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组 反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此 后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离， 再通过放射自显影来检测末端标记的分子。
DNA 模板 (为第一轮聚合链反应产物经电泳纯化后混合)
引 物 A 突变区
3' 半分子
5' 半分子 5' EcoR Ⅰ
引物 B
突变区 H-mTNF-cDNA
3' BamH Ⅰ
工程菌构建
cIts4830
P L启动子
SD序列
Ampr
pBL
EcoR I, BamH I 双酶切 Ori
EcoR I
多克隆位点
分——目的基因的分离
目的基因的获得及方法
➢目的基因概念 ➢获得目的基因方法
➢构建cDNA文库 ➢构建基因组文库 ➢人工合成目的基因 ➢PCR扩增 ➢其他方法：差异显示，基因陷阱
目的基因的概念
➢基因是DNA分子上含特定遗传信息的核酸 序列的总称，是遗传物质的最小功能单 位。
➢目的基因：对基因组中某个基因通过克隆 扩增，获得该基因以进行研究或应用，称 这种基因为目的基因。
BamH I
T1
H-mTNF -cDNA
T2 EcoR I
BamH I
T4连接酶连接
PL 启动子 EcoR I
SD序
列
mTNF-cDNA
Amp r pBL-h-mTNF
BamH I T1
T2
Ori
切、接、转
目的基因序列测定
➢意义：前提；依据 ➢方法：酶促反应法（酶法）；化学裂解法
（化学法） ➢技术基础：变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；标
mRNA差示显示法获得目的基因
➢原理：一般15%基因表达，而且在不同状 态表达的基因是不同的
➢方法：PCR扩增（标记）→测序电泳→筛 选差异
➢优点：简便；灵敏度高；重复性好；多能 性；快速
选择原则
➢根据获得目的基因的目的选择方法 ➢根据目的基因本身特点选择方法 ➢根据实验室条件选择方法
基因定点突变
基因工程方案 ： 分 、切 、接 、转 、筛
➢ 一 、分：目的基因的分离：从cDNA 中分离 ； 人工合成 ；反转录 ；基因文库
➢ 二、切：限制性内切酶的应用：平端切口；粘端 切口
➢ 三 、接：把载体和目的基因连接成重组体：DNA 连接酶；“ 尾接法”；“ 人工连接器”
➢ 四 、转：重组体的转化
➢ 五 、筛：DNA 重组体筛选与鉴定：表型 ， DNA 限制酶酶切图谱, 核酸杂交 , 表达产物鉴 定等 。
目的基因的用途
➢研究该基因的全貌与内涵：结构、功能、 调控
➢寻找异常基因异常点，探索疾病的机理与 治疗
➢研究生物种系进化与相关同源性 ➢基因工程重组表达 ➢改造某些基因 ➢基因治疗
原理
➢ 原核目的基因获得：直接分离 ➢ 真核目的基因获得：
➢ 从cDNA 中分离 ➢ 人工合成 ➢ 反转录 ➢ 基因文库 ➢ PCR ➢ 其他方法：差异显示，基因陷阱，人类基因组
构建基因组文库筛选目的基因
➢要求：全 ➢流程：组织细胞
↓温和破碎细胞 DNA片段与载体的连接包装
↓限制性内切酶消化，噬菌体或粘粒 导入细胞
↓核酸杂交 筛选目的基因
人工合成目的基因片段
➢原理：DNA是由3’，5’-磷酸二酯键连接 ➢技术：DNA自动合成仪 ➢方法
➢ 化学合成法：固相 ➢ 酶促合成法：需模板 ➢ PCR
➢ 优点：高保真
测序策略
➢确证性测序：突变体验证 ➢从头测序：长链DNA ➢方法：
➢ 随机法（或鸟枪测序法） ➢ 定向法
➢嵌套缺失法：酶解均匀变短（核酸外切酶Ⅲ） ➢引物延伸法：测序↔合成引物
随机法（或鸟枪测序法）
➢原理：序列资料从含有靶DNA随机片段的 亚克隆中收集而来的。
➢流程：随机断裂（超声、核酸酶Ⅰ切割、 限制性内切酶切割）→亚克隆 →重叠排列 → 分析
其他方法
构建差示文库（扣除文库）筛选 特殊基因
➢ 差示文库：反映不同组织细胞或同一种细胞在不 同功能状态下，基因表达差异的cDNA文库。
➢ 方法：构建两个cDNA文库→杂交→羟基磷灰石 柱分离→构建cDNA文库
➢ 用于研究细胞的发育、分化、细胞的分裂周期、 细胞对药物和生长因子的诱导反应以及肿瘤等疾 病的分子基础。
➢缺点：重复序列无法处理
嵌套缺失法
原理：核酸外切酶匀速消化DNA 步骤： 构建含目的序列测序载体
↓ 线性化DNA，形成3’突出端
↓ 核酸外切酶Ⅲ消化不同时间
↓ S1酶成平端
↓ 重新环化，分别测序，拼接
小结——分：目的基因的分离
➢目的基因的概念 ➢分离方法：基因文库；c DNA 文库 ；人工
合成 ；PCR ➢构建cDNA文库的原理及方法 ➢获得目的基因方法的选择 ➢Sanger双脱氧链终止法基因序列测定原理 ➢长链（全基因）测序——嵌套缺失法的原
计划等
构建cDNA文库筛选目的基因
➢cDNA文库概念：源于mRNA，反转录合成 双链cDNA，分别插入载体形成重组DNA 的集合体，导入宿主以扩增。
构建流程
组织细胞 ↓破碎细胞，除去DNA与蛋白质
提取总RNA ↓oligo（dT）纤维素亲合柱层析
制备mRNA ↓反转录 合成cDNA第一链 ↓置换法；外加引物法 合成cDNA第二链 ↓加接头，插入载体 重组DNA ↓导入宿主扩增
反转录合成cDNA
➢合成cDNA第一链：反转录酶 ➢合成cDNA第二链：
➢置换合成法：RNaseH；DNA聚合酶Ⅰ； T4DNA连接酶
➢外加引物合成法：全长双链
构建cDNA文库
➢cDNA两端加接头或衔接头 ➢cDNA与载体相连 ➢导入宿主细胞进行克隆
筛选目的基因
➢核酸杂交法：探针 ➢免疫结合法：抗体 ➢其他方法：双杂交；基因芯片
构建cDNA文库
mRNA的分离
➢ 选材：mRNA丰富，目的基因表达活跃 ➢ 注意点：防止RNA酶污染 ➢ 10-5μg/细胞，80~85%为rRNA，15%小分子量
RNA（tRNA等）1-5%mRNA，28S：18S=2： 1 ➢ 提取总RNA ：常规方法；Trizon ➢ 提取纯化mRNA：oligo-dT柱