基因转移及方法

目的基因的用途
➢研究该基因的全貌与内涵：结构、功能、 调控
➢寻找异常基因异常点，探索疾病的机理与 治疗
➢研究生物种系进化与相关同源性 ➢基因工程重组表达 ➢改造某些基因 ➢基因治疗
原理
➢ 原核目的基因获得：直接分离 ➢ 真核目的基因获得：
➢ 从cDNA 中组织细胞
↓温和破碎细胞 DNA片段与载体的连接包装
↓限制性内切酶消化，噬菌体或粘粒 导入细胞
↓核酸杂交 筛选目的基因
人工合成目的基因片段
➢原理：DNA是由3’，5’-磷酸二酯键连接 ➢技术：DNA自动合成仪 ➢方法
➢ 化学合成法：固相 ➢ 酶促合成法：需模板 ➢ PCR
理
构建流程
组织细胞 ↓破碎细胞，除去DNA与蛋白质
提取总RNA ↓oligo（dT）纤维素亲合柱层析
制备mRNA ↓反转录 合成cDNA第一链 ↓置换法；外加引物法 合成cDNA第二链 ↓加接头，插入载体 重组D法
原理：2’，3’ddNTP与dNTP不同之处在于脱氧核糖 的3’ 位置缺少一个羟基。它们可以在DNA聚合酶 作用下通过其5’ 三磷酸基团掺入到DNA链中，但 不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链，DNA链就不 可能继续延伸。这样，合成时在4种dNTP中加入 少量的一种ddNTP后， 链延伸将与偶然发生但十 分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核 苷酸链，长度取决于从用以起始DNA合成的引物 末端到出现链终止位置之间的距离。在4组独立的 酶反应中分别采用4种不同ddNTP，结果将产生4 组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个A、 T、C、G位置上。
DNA 模板 (为第一轮聚合链反应产物经电泳纯化后混合)
引 物 A 突变区
3' 半分子
5' 半分子 5' EcoR Ⅰ
引物 B
突变区 H-mTNF-cDNA
3' BamH Ⅰ
工程菌构建
cIts4830
P L启动子
SD序列
Ampr
pBL
EcoR I, BamH I 双酶切 Ori
EcoR I
多克隆位点
基因工程方案 ： 分 、切 、接 、转 、筛
➢ 一 、分：目的基因的分离：从cDNA平端切口；粘端 切口
➢ 三 、接：把载体和目的基因连接成重组体：DNA 连接酶；“ 尾接法”；“ 人工连接器”
➢ 四 、转：重组体的转化
➢ 五 、筛：DNA 重组体筛选与鉴定：表型 ， DNA 限制酶酶切图谱, 核酸杂交 , 表达产物鉴 定等 。
第一轮聚合链反应
DNA 模板(pUC19- TNF 用Hind Ⅲ切后)
引物A
TNFcDNA
DNA 模板(pUC19- TNF用HindⅢ切后) TNFcDNA 引物 D
5' Hind Ⅲ 引物 C
3' Hind Ⅲ 5' Hind Ⅲ
引物 B 3' Hind Ⅲ
5'半分子
突变区
突变区
3' 半分子
第二轮聚合源于mRNA，反转录合成 双链cDNA，分别插入载体形成重组DNA 的集合体，导入宿主以扩增。
构建流程
组织细胞 ↓破碎细胞，除去DNA与蛋白质
提取总RNA ↓oligo（dT）纤维素亲合柱层析
制备mRNA ↓反转录 合成cDNA第一链 ↓置换法；外加引物法 合成cDNA第二链 ↓加接头，插入载体 重组DNA ↓导入宿主扩增
BamH I
T1
H-mTNF -cDNA
T2 EcoR I
BamH I
T4连接酶连接
PL 启动子 EcoR I
SD序
列
mTNF-cDNA
Amp r pBL-h-mTNF
BamH I T1
T2
Ori
切、接、转
目的基因序列测定
➢意义：前提；依据 ➢方法：酶促反应法（酶法）；化学裂解法
（化学法） ➢技术基础：变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；标
方法： M 13，ddNTP法
➢ 步骤 ：
➢ 1.待测定 DNA 插入双链 M 13 复制型 DNA 中
➢ 2.菌体中扩增，提取单链 M 13 DNA ➢ 3.按待测 DNA 3’端前方的互补序列人工合成
➢ 自动测序仪：荧光标记
化学法——Maxam－Gilbert DNA 化学降解法
➢ 原理：一个末端标记的DNA片段在5组互相独立 的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反 应特异地针对于某种或某一类碱基。因此生成5组 放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末 端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中 均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组 反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此 后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离， 再通过放射自显影来检测末端标记的分子。
➢缺点：重复序列无法处理
嵌套缺失法
原理：核酸外切酶匀速消化DNA 步骤： 构建含目的序列测序载体
↓ 线性化DNA，形成3’突出端
↓ 核酸外切酶Ⅲ消化不同时间
↓ S1酶成平端
↓ 重新环化，分别测序，拼接
小结——分：目的基因的分离
➢目的基因的概念 ➢分离方法：基因；c DNA ；人工合成 ➢Sanger双脱氧链终止法基因序列测定原理 ➢长链（全基因）测序——嵌套缺失法的原
反转录合成cDNA
➢合成cDNA第一链：反转录酶 ➢合成cDNA第二链：
➢置换合成法：RNaseH；DNA聚合酶Ⅰ； T4DNA连接酶
➢外加cDNA与载体相连 ➢导入宿主细胞进行克隆
筛选目的基因
➢核酸杂交法：探针 ➢免疫结合法：抗体 ➢其他方法：双杂交；基因芯片
分——目的基因的分离
目的基因的获得及方法
➢目的基因概念 ➢PCR扩增 ➢其他方法：差异显示，基因陷阱
目的基因的概念
➢基因是DNA分子上含特定遗传信息的核酸 序列的总称，是遗传物质的最小功能单 位。
➢目的基因：对基因组中某个基因通过克隆 扩增，获得该基因以进行研究或应用，称 mRNA丰富，目的基因表达活跃 ➢ 注意点：防止RNA酶污染 ➢ 10-5μg/细胞，80~85%为rRNA，15%小分子量
RNA（tRNA等）1-5%mRNA，28S：18S=2： 1 ➢ 提取总RNA ：常规方法；Trizon ➢ 提取纯化脱氧链终止法
原理：2’，3’ddNTP与dNTP不同之处在于脱氧核糖 的3’ 位置缺少一个羟基。它们可以在DNA聚合酶 作用下通过其5’ 三磷酸基团掺入到DNA链中，但 不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链，DNA链就不 可能继续延伸。这样，合成时在4种dNTP中加入 少量的一种ddNTP后， 链延伸将与偶然发生但十 分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的 核苷酸链，长度取决于从用以起始DNA合成的引 物末端到出现链终止位置之间的距离。在4组独立 的酶反应中分别采用4种不同ddNTP，结果将产生 4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个 A、T、C、G位置上。
➢ 优点：高保真
测序策略
➢确证性测序：突变体验证 ➢从头测序：长链DNA ➢方法：
➢ 随机法（或鸟枪测序法） ➢ 定向法
➢嵌套缺失法：酶解均匀变短（核酸外切酶Ⅲ） ➢引物延伸法：测序↔合成引物
随机法（或鸟枪测序法）
➢原理：序列资料从含有靶DNA随机片段的 亚克隆中收集而来的。
➢流程：随机断裂（超声、核酸酶Ⅰ切割、 限制性内切酶切割）→亚克隆 →重叠排列 胞的分裂周期、 细胞对药物和生长因子的诱导反应以及肿瘤等疾 病的分子基础。
mRNA差示显示法获得目的基因
➢原理：一般15%基因表达，而且在不同状 态表达的基因是不同的
➢方法：PCR扩增（标记）→测序电泳→筛 选差异
➢优点：简便；灵敏度高；重复性好；多能 性；快速
选择原则
➢根据获得目的基因的目的选择方法 ➢根据目的基因本身特点选择方法 ➢根据实验室条件选择方法
基因定点突变