木瓜蛋白酶提取茶树菇多糖的相关因素的正交试验研究

茶树菇多糖脱蛋白方法研究

茶树菇多糖脱蛋白方法研究摘要将传统的多糖提取方法、胰蛋白酶的“酶解-透析”作用及活性炭处理相结合去除茶树菇多糖提取液中的蛋白质。

结果表明：蛋白质去除较完全，多糖的损失率较少，同时还可去除色素、果胶和核酸等杂质。

关键词茶树菇多糖；脱蛋白；方法茶树菇是担子菌纲伞菌目类绣伞科的真菌微生物，是一种被人们称为“菇中珍品”的食用菌，它含有多种微量元素和人体所需要的17种氨基酸，营养价值和药用价值比其他食用菌高出数倍以上。

茶树菇多糖的药理作用很广泛，主要表现为可提高机体免疫功能、抗肿瘤、抗病毒、抑制流感病毒、抗感染以及对化学物质所致肝损伤有保护作用等。

有关茶树菇多糖分离纯化的报道并不多见。

在分离阶段大多都采用多次有机试剂沉淀法来去除其中的蛋白质，但是这种方法存在一次性除蛋白质效率低、多糖损失率高、有机相不易分离、污染较大等缺点。

笔者通过试验，获得一种去除茶树菇多糖中蛋白质的新方法，其一次除蛋白质效率高，操作简单，废液易回收。

1 材料与方法1.1材料与试剂茶树菇干品，购于辽宁省沈阳市超市；胰蛋白酶（北京奥博星生物技术责任有限公司产品）；95%乙醇、无水乙醇、丙酮、氯仿、正丁醇、活性炭均为分析纯。

1.2试验仪器721-A可见分光光度仪；国华-数显恒温水浴锅；LGR10-4.2高速冷冻离心机；LGJ-10冷冻干燥机；pHS-25 pH计；Nicolet Evolution300紫外-可见分光光度仪。

1.3工艺流程茶树菇干品→粉末（过60目）→热水浸提→离心取上清液→脱除蛋白→95%乙醇沉淀→丙酮、无水乙醇冲洗→回收多糖→冷冻干燥→茶树菇粗多糖。

1.4茶树菇提取液脱蛋白茶树菇提取液先用Sevage试剂（氯仿∶正丁醇为4∶1）除蛋白1次，离心透析48h，按一定比例加入胰蛋白酶溶液进行酶解，2h后透析，最后用活性炭处理，离心得到脱蛋白液。

1.5分析方法牛血清蛋白测定蛋白含量；紫外吸收法定性分析。

2结果与分析2.1茶树菇多糖提取液脱蛋白效果由表1可知，通过常用的脱蛋白方法，即反复多次使用“Sevage试剂透析”除蛋白，蛋白质去除率较高，但多糖损失率也较高，且该方法大量使用有机试剂，有机相与多糖不易分离，需要透析时间较长，污染较大。

正交设计法优化木瓜果实多糖提取工艺

安徽农学通报，Anhui Agri.Sci.Bull.2018，24（13）正交设计法优化木瓜果实多糖提取工艺陈向阳王恒刘勤吴海燕（黄山学院，安徽黄山245041）摘要：通过热水浸提法和醇沉法对木瓜果实的多糖进行提取，探讨热水提取温度、料液比、热水提取时间以及醇沉时乙醇浓度4个因素对木瓜果实多糖提取的影响，并以多糖含量为指标，蒽酮-硫酸比色法为测定方法，采用正交试验法确定木瓜果实多糖提取的最佳工艺条件。

结果表明，提取温度80℃，料液比1：60g/mL，提取时间60min，乙醇浓度80%，在此条件下多糖的提取率达到5.6%，工艺条件最佳，具有可行性和可靠性。

关键词：木瓜；多糖提取；正交试验；蒽酮-硫酸比色法中图分类号S661.6文献标识码A文章编号1007-7731（2018）13-0018-03 Optimization on Extraction Technology of Polysaccharides from Papaya Fruit by Orthogonal Ex⁃perimental DesignChen Xiangyang et al.（Huangshan University，Huangshan245041，China）Abstract：In this study，polysaccharides was isolated from papaya fruit by hot water extraction and alcohol deposit.In hot water extraction，extraction temperature，the ratio of material to solution，extraction time and the concentration of ethanol as the factors affecting extraction ratio were studied.The content of the polysaccharide was determinated by phenol sulfuric acid method.Orthogonal test was conducted to select the optimal conditions for the determination of polysaccharide from papaya fruit.The optimum conditions of papaya fruit were：the optimal temperature for80℃bap⁃tized mention，best liquid ratio for1：60g/mL，best extraction time for60minutes，best ethanol concentration is80%. Under these conditions，the extraction efficiency of polysaccharide was5.6%.The feasibility and reliability of this op⁃timum conditions were verified through experiments.The experiments had provided the strongest assurance on the study of polysaccharides content of Chaenomeles sinensis.Key words：Papaya fruit；Extraction of polysaccharides；Orthogonal test；Anthrone-sulphuric acid colorimetry1引言木瓜（Chaenomeles sinensis（Thouin）Koehne），又称皱皮木瓜、贴梗海棠，属蔷薇科木瓜属，主要产于山东、安徽、湖北等地［1］。

茶树菇粗多糖水提醇沉工艺优化研究

茶树菇粗多糖水提醇沉工艺优化研究【摘要】：目的：优化筛选茶树菇粗多糖水提醇沉工艺。

方法：以茶树菇多糖得率为考察指标，采用正交设计法对提取工艺中水提取次数、提取时间、提取次数三个因素进行优化研究；再对醇沉的工艺中醇沉液的乙醇浓度三个因素进行优化研究。

结果：茶树菇粗多糖提取以加水量10倍、提取时间2小时，提取次数3次为最优化工艺；醇沉液的乙醇浓度为85%时醇沉效果最佳。

【关键词】：茶树菇；粗多糖；水提醇沉；工艺优化茶树菇(Agrocybe aegerita)隶属于担子菌门、层菌纲、伞菌目、粪锈伞科、田蘑属，又名柱状田头菇。

中医学认为茶树菇性平甘温，有祛湿、利尿、健脾胃等功效。

其主要成分多糖，具有抗衰老，降低胆固醇，增强免疫作用，防癌和抗癌等功效，是一种极具开发潜力的真菌[1]。

但目前，对其多糖提取分离方法的系统研究报道极少，因此文章对茶树菇粗多糖的提取分离方法的工艺流程进行了系统的考察。

1．仪器与材料仪器：751G分光光度计（上海分析仪器厂）；电子天平（上海精科天平厂）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）等。

材料：茶树菇（自购）；葡萄糖标准品（上海化学试剂公司）；苯酚（成都化学试剂厂）；其它试剂均为分析纯。

2．方法与结果2.1 多糖含量测定方法的确定2.1.1 葡萄糖标准溶液的配制取葡萄糖0.25g，精密称定，加蒸馏水定容于250ml容量瓶中，摇匀，精密吸取10ml置100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，作为对照品溶液。

2.1.2 标准曲线的绘制分别精密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml置干燥具塞试管中，分别加水使成2.0ml，再分别加人4％苯酚溶液1.0ml摇匀，最后迅速加入浓硫酸7.Oml，充分振摇，在4O℃水浴中加热30min，取出置冷水浴中放5min，在490nm处进行比色测定，同时做空白对照，测定吸光度。

以吸光度对葡萄糖浓度作线性回归,得回归方程：y=5.64x-0.0522 （R=0.9997）。

茶树菇多糖提取的复合酶制剂筛选及工艺研究

ＭｉｎｉｓｔｙｒｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００４５７，Ｃｈｉｎａ；２．ＮａｔｉｏｎａｌＥｎｇｉｎｅｅｉｒｎｇＬａｂｏｒａｔｏｙｒｆｏｒＩｎｄｕｓｔｉｒａｌＥｎｚｙｍｅｓ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００４５７，Ｃｈｉｎａ；３．ＴｉａｎｊｉｎＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｙｒｏｆＩｎｄｕｓｔｉｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｙ，ｇＴｉａｎｊｉｎ３０４５０７，Ｃｈｉｎａ；４．ＴｈｅＣｏｌｌｅｇｅｏｆ
茶树菇提取多糖的最佳工艺。复合酶最优复配组合为纤维素酶：木聚糖酶：ｐ一葡聚糖酶＝３：３：６（酶活以８０Ｕ／ｍｇ计），最
佳提取工艺为ｐＨ为５．０，酶解时间２ｈ，酶解温度５Ｏｃｃ，料液比为１：２０，在此条件下多糖含量为１９７．６５ｍｇ／ｇ，与其他方
（１。工业发酵微生物教育部重点实验室（天津科技大学），天津３００４５７；２。天津科技大学生物工程学院，天津
３００４５７；３．工业酶国家工程实验室，天津３００４５７；４．天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学，天津３０４５０７）

茶树菇多糖提取及其抗氧化性能的研究

茶树菇多糖提取及其抗氧化性能的研究作者：胡晓倩，唐洪华，程安阳来源：《湖北农业科学》 2011年第21期胡晓倩，唐洪华，程安阳（黄山学院生命与环境科学学院，安徽黄山２４５０４１）摘要：利用水浸提法提取茶树菇（Ａｇｒｏｃｙｂｅｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）多糖，通过单因素试验考察料水质量比、浸提时间、ｐＨ、醇析时乙醇用量等４个因素对茶树菇粗多糖得率的影响。

结果表明，茶树菇粗多糖的最佳提取条件为料水质量比１∶１０、浸提时间２ｈ、ｐＨ７．５、浸提浓缩液４倍体积的９５％乙醇醇析。

用乙醚和Ｓｅｖａｇｅ法纯化茶树菇多糖，并对其抗氧化性能进行了分析，发现茶树菇多糖具有良好的抗氧化性能。

在试验浓度范围内，其总还原能力和对羟自由基、超氧阴离子自由基、脂过氧自由基的清除能力随多糖浓度的升高而增强，且其在酸性条件下对亚硝酸根离子具有良好的清除能力。

关键词：茶树菇（Ａｇｒｏｃｙｂｅｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）；多糖；提取；抗氧化性中图分类号：Ｓ６４６；Ｒ２８４．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）21－4465-04ＳｔｕｄｙｏｎＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＰｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅs ｆｒｏｍＡｇｒｏｃｙｂｅｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａａｎｄＩｔｓＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＡｃｔｉｖｉｔｙＨＵＸｉａｏ－ｑｉａｎ，ＴＡＮＧＨｏｎｇ－ｈｕａ，ＣＨＥＮＧＡｎ－ｙａｎｇ（ＬｉｆｅａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅＣｏｌｌｅｇｅ，ＨｕａｎｇｓｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕａｎｇｓｈａｎ２４５０４１，Ａｎｈｕｉ，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＰｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍＡｇｒｏｃｙｂｅｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａｕｓｉｎｇｗａｔｅｒａｓｓｏｌｖｅｎｔ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｔｅｓｔｓ，ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｏｂｔａｉｎｉｎｇｈｉｇｈｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｙｉｅｌｄｗｅｒｅ，ｍａｓｓｒａｔｉｏｏｆｍａｔｅｒｉａｌｔｏｗａｔｅｒ，１∶１０； E ｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ，２ｈ；ｐＨ，７．５ａｎｄｖｏｌｕｍｅｒａｔｉｏｏｆ９５％ｅｔｈａｎｏｌｔｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｅｘｔｒａｃｔｓｏｌｕｔｉｏｎｆｏｒａｌｃｏｈｏｌｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，４∶１．ＴｈｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｃｒｕｄｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｗａｓｒｅｆｉｎｅｄｂｙｅｔｈｅｒａｎｄＳｅｖａｇｅｒｅａｇｅｎｔａｎｄｉｔｓａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｏｆＡ．ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａｗａｓｗｉｔｈｇｒｅａｔａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｂｉｌｉｔｙｏｆｃｌｅａｒｉｎｇｈｙｄｒｏｘｙｌｒａｄｉｃａｌ，ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎｒａｄｉｃａｌ，ａｎｄｌｉｐｉｄｐｅｒｏｘｙｒａｄｉｃａｌｎｉｔｒｉｔｅｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｄｏｓａｇｅ in the scope of test concentration； Aｎｄｉｔａｌｓｏｈａｄｅｘｃｅｌｌｅｎｔｃｌｅａｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙｔｏｎｉｔｒｉｔｅｉｏｎｉｎａｃｉｄｉｔｙｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｇｒｏｃｙｂｅｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ；ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ食用菌是一类具有较高营养价值和药用价值的食物资源［１］，近年来国内外已对多种食用菌，如香菇、灵芝、金针菇、灯芯菇、黑木耳等，进行了水溶性多糖的提取纯化、分离鉴定及功能研究［３－７］。

木瓜蛋白酶的提取纯化实验报告

木瓜蛋白酶的分离纯化一、目的（1）它是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁中提取粗酶液，并进一步纯化，获得高纯度的木瓜蛋白酶。

（2）通过此次试验，熟悉掌握木瓜蛋白酶分离纯化的基本步骤和原理，了解离心分离，萃取等实验技术。

二、原理木瓜蛋白酶（ Papain ）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。

它也具有脂酶活力。

其分子量约为 23000 左右。

在 25 ℃ , pH6.2 时， 1 分钟生成1umol酪氨酸的酶量为 1 单位。

木瓜蛋白酶是单条肽链，有 211 氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有 1 个巯基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸，硫化物，亚硫酸盐和 EDTA ；抑制剂有巯基试剂，包括重金属和羧基试剂和过氧化氢。

酪蛋白是一种蛋白质，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275nm 处有吸收峰，根据测定 275nm 处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。

吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。

三、实验材料番木瓜汁；PEG (聚乙二醇，分子量为6000)； (NH4)2SO4；三氯乙酸(TCA)；酪氨酸；考马斯亮蓝四、仪器设备（ 1 ）离心机 4000-1000rpm （冷冻式或非冷冻式）（ 2 ） 752 紫外分光光度计（ 3 ）水浴箱（ 4 ）冰箱（ 5 ）榨汁机五、玻璃器皿（以组为单位）试管（ 6 ）， 100 mL 烧杯（ 2 ），吸管（ 1 ）、玻棒（ 1 ），试剂瓶（ 1000 mL 、 500 mL 、 250 mL 等），移液管或移液器5mL(1) 、 1mL(2) 、 0.5mL （ 1 ），漏斗（ 3 ），滤纸（ 3-6 ）等六、实验试剂配制及实验步骤（一）酪氨酸的标准曲线将上述各管混匀，静置2min, 测定各管的A 275nm，做标准曲线，曲线如下：（二）粗酶活测定1 试剂（ 1 ） 3mg/ml 木瓜蛋白酶液（用 0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2 配制）（ 2 ）0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2（ 3 ）用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制含 80mmol/L 半胱氨酸（ 4 ）1% 酪蛋白溶液：用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制（ 5 ）15% 三氯乙酸（ TCA ）溶液2 方法量取酶液0.2 mL，加入激活剂0.25 mL于带塞试管中，在37℃水浴中保温8 min，吸取预热37℃酪蛋白液（质量分数为1%）1 mL加入此管，在37℃水浴中反应10 min，加入三氯乙酸（TCA）2 mL摇匀，静置5 min；另取样液（已激活）0.3 mL置另一带塞试管中，加入TCA 2 mL，37℃保温10 min后，加入预热至37℃的酪蛋白液1 mL，静置5 min，测2个管的A275 nm值，同时做2个平行试验。

茶树菇营养成分的提取与检测研究进展

氰戊菊酯样品编号 1 2 3 4 5
样品浓度 ∥μg/mL 0.60 1.20 1.80 2.40 3.00
表 3 氰戊菊酯精密度
9 次测量值∥μg/mL 0.565 8~0.597 3 1.169 2~1.198 3 1.707 3~1.796 8 2.296 6~2.393 2 2.870 6~2.989 7
茶树菇中含有丰富、活性独特的多糖[1]，约占 43.6%，其子实体多糖含量为 4.7 g/100g 干重，深层发酵菌丝体胞内含量为 3.0 g/100g 干重，发酵滤液中含有 22 g/L 胞外多糖。从茶树菇子实体中提取纯化出一种称为 “Cylinda” 的糖蛋白和 2 种多糖，一种为高分子质量的 AG-HN1；另一种为低分子质量的异型多糖 AG-HN2，AG-HN1 有显著地降血糖作用。茶树菇中的真菌水溶性多糖[2]，分别是AP1、AP2、AP3、AP4、 AP5，其中 AP2 含量最高，是由 D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖和半乳糖醛酸组成的酸性多糖，AP2 为白色结晶，易吸潮，不溶于有机溶剂，易溶于水，水溶液呈透明粘稠状。通过单因素及正交试验探讨纤维素酶酶解辅助提取茶树菇子实体多糖最佳工艺条件为：料液比 1∶80，酶浓度 1.5%，提取液 pH 值 6.0，提取温度 50 ℃，这种方法的提取率比普通水浴法高出 70.47% [3]。使用微波辅助提取多糖，得出影响因素的顺序依次为料液比＞微波时间＞微波功率，通过统计分析得到微波提取多糖回归方程 Y=3.363 3+0.507 5 X1+0.250 0 X2-0.277 5 X3+0.372 1 X12+0.192 5 X1X2-0.007 5 X2X3-0.097 9 X22-0.1675 X2X3+0.712 1 X32，线性相关系数为 0.995 4。通过响应面法优化微波提取多糖最佳工艺为 44 倍水量，在微波辐射频率为 1 960 MHz 下微波 6 min，该提取条件下多糖提取率为 9.70%。用超声波进行了相同的试验，表明超声波可以很好地促进多糖提取得率。采用热水浸提法对茶树菇多糖的提取工艺条件进行优化，以多糖得率为评价指标，选用单因素试验和正交实验法考察浸提比、pH 值、浸提温度、乙醇浓度、浸提时间等 5 个因素对茶树菇多糖得率的影响，表明多糖的提取与这 5 个因素相关。 2 矿物质

木瓜蛋白酶的研究进展

另一方面，由于嫩化剂比较充分的发挥作用是在肉品被
蒸煮的期间，温度较高，而木瓜蛋白酶最适合温度55～60℃，热稳定性强，在90℃时也不会完全失活，因此常用于生产嫩肉粉水解啤酒内的蛋白质，部分水解一些已形成的复合物，产生更多的多肽或氨基酸，保证啤酒在冷冻过程中的高清澈度，同时改善啤酒口感及原有多肽和氨基酸的组成和比例，有效地改良啤酒品质。
木瓜蛋白酶的研究进展
一木瓜蛋白酶的简介二木瓜蛋白酶的提取三木瓜蛋白酶的固定化四木瓜蛋白酶的应用五木瓜蛋白酶的展望
一木瓜蛋白酶的简介
中文名称：木瓜蛋白酶，别名番木瓜酶,木瓜朊酶, 番瓜酵素,木瓜酶英文名称：papain 定义：一种蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点
双水相萃取具有目标产物收率高、易于连续化操作、不存在有机溶剂残留、分离过程经济等优点。
三木瓜蛋白酶的固定化
由于木瓜蛋白酶价格昂贵且无法重复利用，促使人们研究和制备固定化木瓜蛋白酶。固定化的木瓜蛋白酶可以避免其在酸碱和有机介质中失活，实现酶的反复利用，达到节约生产成本的目的。常用的固定化方法有吸附法、载体交联法和包埋法。
3.包埋法
将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。
金锋采用微孔淀粉-海藻酸钠包埋法固定化木瓜蛋白酶，结果表明，最佳固定化木瓜蛋白酶制备条件为微孔淀粉浓度4%，海藻酸钠浓度3%，CaCl2浓度5.5%。此时固定化木瓜蛋白酶的最适pH值为5.7，最适温度72℃，其耐热性、操作稳定性、机械强度都不同程度增加，操作成本低，适合工业推广。