H5N1亚型禽流感病毒HA基因核酸疫苗的构建及免疫效果研究
表达2.3.2.1d分支H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸭瘟病毒的构建和评价
中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第42卷第12期2020年12月V ol.42No.12Dec.2020doi ：10.3969/j.issn.1008-0589.202003016表达2.3.2.1d 分支H5亚型禽流感病毒HA 基因重组鸭瘟病毒的构建和评价王波，赵玉博，胡玉珍，丁蕾蕾，陈普成，焦晨晨，姜永萍，陈化兰，柳金雄*（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室，黑龙江哈尔滨150069）摘要：为研究H5亚型禽流感病毒（AIV ）HA 基因重组鸭瘟病毒（DEV ）载体活疫苗，本研究利用DEV 疫苗株多片段体外拯救系统，将我国H5亚型AIV 2.3.2.1d 分支代表病毒CK/LN/SD007株的血凝素（HA ）基因插入DEV 基因组中，构建了重组DEV ，对其进行PCR 、间接免疫荧光实验、western blot 和传至15代后的遗传稳定性试验。
结果显示，构建了一株表达CK/LN/SD007株HA 基因的重组DEV ，并且HA 基因能够在重组病毒中正确表达并稳定遗传，命名为rDEV H5-12；将rDEV H5-12和亲本病毒DEV 疫苗株接种鸡胚成纤维细胞（CEF ）后，收集96h 内不同时间点的病毒样品，检测TCID 50并绘制生长曲线。
结果显示，rDEV H5-12在CEF 中的生长曲线和亲本病毒DEV 疫苗株无显著差异；rDEV H5-12以105TCID 50免疫SPF 鸭2周后，进行DEV 和AIV 攻毒保护试验。
结果显示，rDEV H5-12一次免疫SPF 鸭后2周即能诱导对DEV 强毒和AIV （CK/LN/SD007）攻击的完全保护，即免疫组SPF 鸭在观察期内无排毒，无死亡，对照组SPF 鸭在观察期内全部排毒，而且死亡；rDEV H5-12以105TCID 50免疫SPF 鸭2次后，每周采集血清进行血凝抑制（HI ）抗体效价检测。
H5N1亚型禽流感疫苗免疫效果分析的开题报告
H5N1亚型禽流感疫苗免疫效果分析的开题报告
一、研究背景和意义
禽流感病毒是一种高致病性病毒，可以感染多种家禽和野生鸟类，
而H5N1亚型禽流感病毒对人类的致病性也很高，是一种潜在的人畜共患病。
为防控该病的传播，疫苗作为目前最有效的预防手段之一，广泛应
用于禽流感的控制和预防工作中。
然而，由于病毒的不断变异和演化，
现有的H5N1疫苗存在一定的缺陷，如免疫效果不高等问题，因此需要对疫苗的免疫效果进行深入的研究和分析。
二、研究内容和目标
本研究将选取一种H5N1亚型禽流感疫苗，通过动物实验的方式，
对其免疫效果进行测试和分析，研究该疫苗对于禽流感病毒的保护效果
以及抗体水平的变化情况，并结合生物学、生化学等方法，深入分析疫
苗的免疫机制和作用方式。
三、研究方法和技术路线
1. 疫苗的制备和纯化：本研究将选取一种H5N1亚型禽流感疫苗，
采用细胞工程技术进行制备和纯化。
2. 动物实验：本研究将选取小鼠为实验对象，将小鼠随机分成疫苗组和对照组，疫苗组接种H5N1亚型禽流感疫苗，对照组接种生理盐水。
在接种后分别进行观察和采血，检测抗体水平及病毒感染情况。
3. 实验数据处理和分析：对比两组数据，分析疫苗的免疫效果及保护效果，并对疫苗的免疫机制进行深入研究。
四、预期成果和意义
本研究旨在深入探究H5N1亚型禽流感疫苗的免疫效果和作用机制，为疫苗的改进和升级提供科学数据和参考意见，同时也为禽流感的防控
工作提供重要的理论基础和实验支持，具有一定的应用和推广价值。
高致病性禽流感病毒H5N1的载体疫苗构建及免疫原性研究的开题报告
高致病性禽流感病毒H5N1的载体疫苗构建及免疫原性研究的开题报告一、背景和研究意义高致病性禽流感病毒H5N1属于一种高度传染、致死率极高的病毒，对家禽和人类的危害极大。
近年来，随着全球化和人口迁徙等因素的增加，病毒的传播和流行越来越容易发生。
因此，针对高致病性禽流感病毒H5N1的疫苗研究显得尤为重要。
传统的禽流感疫苗主要是通过培养感染病毒，提取病毒颗粒扩增制备，存在病毒污染风险、制备时间长等缺点。
此外，高致病性禽流感病毒H5N1也因为其变异性和溯源性的特点，致使其疫苗的制备难度和疗效不断受到挑战。
因此，基于分子克隆和蛋白工程技术的疫苗研究成为当前的研究热点。
二、研究目的本研究的主要目的是构建一种新型的载体疫苗，作为高致病性禽流感病毒H5N1的防治手段之一。
通过基因重组技术，将H5N1病毒中的外膜蛋白HA、内膜蛋白NA 与吸附病毒的结构蛋白M2和M1等蛋白，合成一个新的载体疫苗，并进行动物免疫实验，研究其免疫效果和免疫机制。
三、研究内容和步骤（一）构建基因重组载体将H5N1病毒中的HA和NA与M2和M1等蛋白进行拼接和重组，得到新的载体疫苗。
首先，通过PCR扩增并测序确定所需基因片段的序列，然后采用pET32a质粒作为载体，克隆所需基因片段，并进行重组克隆，最后通过PCR鉴定和限制性内切酶切割确认所得克隆体的正确性。
（二）表达疫苗蛋白通过将所构建的重组载体转化到大肠杆菌中，利用IPTG诱导蛋白表达，然后进行超声波破碎，离心分离和酚盐析纯化等步骤，得到目标蛋白的纯化物。
（三）检测疫苗蛋白的免疫原性通过SDS-PAGE和Western Blot等方法，检测所得纯化物中目标蛋白的表达和纯度，并进行免疫原性的评估，以及抗原性的检测。
（四）动物免疫实验将所得纯化物进行动物免疫试验，选用小鼠和家兔为试验动物，观察其是否产生抗体，抗体效价以及对高致病性禽流感病毒H5N1的识别和中和效果等。
四、研究意义和创新本研究利用基因重组技术构建一种新型的载体疫苗，并通过动物免疫实验，对其免疫效果和免疫机制进行深入研究。
表达H5N1亚型禽流感病毒HA和NA基因的重组鸭瘟病毒的构建
摘 要 ： 用 Ｐ Ｒ 技 术 扩 增 出鸭 瘟 病 毒 （ Ｖ） 长 非 必 需 的Ｔ 基 因（ １１ｂ ， 其 克 隆入 ｐ Ｅ — ａ 利 Ｃ ＤＰ 生 Ｋ 约 ． ）将 ｋ Ｇ Ｍ Ｔ ｅｓ ｙ
Ｈ ｉ ＷＡ Ｇ Ｍｉ －ｉ Ｚ Ａ ｏ ｇｆｎ Ｇ Ｏ Ｘ ａ Ｌ ｎ－ ｉ Ｕ Ｘａ ｏ Ｎ ｎ ｊ Ｈ Ｏ Ｄ ｎ －ｅ ｇ ｇ ｅ Ａ ｕｎ ＩＭｉｇｙ
（ Ｃ ｌ ｇ ｆＡｎｍａ Ｓ ｉｎ ｅ ａ ｄ Ｔ ｃ ｎ ｌｇ ｂ ｉＡｇ ｃ ｌ ｒｌＵ ｉｅｓｔ； １ ｏｌ ｅ ｏ ｉ ｌ ｃｅ ｃ ｎ ｅ ｈ ｏｏ ｙ Ｈｅ ｅ ｒ ｕｔ ａ ｎｖ ｒｉ ｅ ｉ ｕ ｙ
ｐｉｅ ｙ ｐｌ ｅｉ ｈｉ ｒａｔ ｎＰ Ｒ ａ ｄ ｃ ｎ ｄ ｉｔ Ｔ ｅｓ ｅｔ ｏ ｏｔｉ ｐ Ｔ ． ｃｏｄ ｇ ｇｅｎｆ ｏｅ． ｌ ｄ ｂ ｏｙ ｒｅ ｃ ａ ｅｃ ｏ （Ｃ １ ｎ ｌ ｅ ｎ ～ ａｙ ｖｃｏ ｔ ｂａ Ｇ Ｋ Ａ ｃｒｉ ｒｅ ｕｒｓ ｉ ｆ ｍ ｓ ｎ ｉ ｏ ｏ ｒ ｎ ｎ ｌ
２ Ｑｎｄ ｏＹ ｂｏＢｏｎ ｉ ｅｉ ｏ ｐｎ Ｌｄ） ｉｇａ ｅｉ ｉ ｇ ｅｒ ｇ Ｃ ｍ ａｙ， ． ｅ ｎ ｎ ｔ
Ａｂ ｔａ ｔ ｓｒ ｃ：Ｕｓ ｇ ｅ ｔ ｃｅ ｏａ ＮＡ ｆｏ ｄ ｃ ｌｇ ｅ ｖｒｓ （ Ｖ ａ ｃｎ ｔ ｉ ｎｅ ｔｄ ｃ ｉｋ ｎ （ ａｌｓｄ ． ｉ ｘｒ ｔｄ ｔｔｌＤ ｒｍ ｕ ｋ ｐａ ｕ ｉ ＤＰ ）ｖ ｃ ｉｅ ｓｒ ｎ ｉｆｃｅ ｈｃ ｅ Ｇ ｌ ｏ ｎ ａ ｕ ａ ｕ ｍｅｔ ｕ ）ｅ ｒｏ ｆ ｒｂａｔ ｆＥＦ ｅｌ ａ ｅ ｌｔ，ｔｅ １ ｂ Ｔ ｇ ｎ ｏ ｅｓｎｉｌｆｒ ｖｒｌｒｐｉａｉｎ ｗ ｓ ａ ｓ ｃ ｓ ｍｂｙ ｂｏ ｌｓ Ｃ ）ｃ ｌ ｓ ｔｍｐａｅ ｈ ． ｋ Ｋ ｅ ｅ ｎ ｎ ｓｅ ｔ ｏ ｉ ｅ ｌ ｔ ａ ｍ． ｉ ｉ ｓ ｓ ０ ａ ａ ｃ ｏ
表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及其免疫原性
体内的复制。
关键词：猪流感病毒；H5N1亚型；HA 基因；重组腺病毒
中图分类号：S852. 659.5
文献标识码：A
文章编号：0366-6964(2009)09-1363-07
Construction and Immunogenicity of a Recombinant Adenovirus Expressing H A Gene of H5N1 Subtype Swine Influenza Virus
A型流感病毒依据血凝素(HA)划分为16个 亚型(H1-H16)，依据神经氨酸酶(NA)划分为9个 亚型[1]。其中，高致病力H5N1亚型流感病毒不但 能够引起各种鸟类禽流感的暴发，而且还能够导致 人、猫、虎等一些哺乳动物的感染与死亡[2-3]。从 2003年年底到2009年3月，该病毒已经在全球造 成409人感染、256人死亡[4]。通过病原学监测，在 中国的猪群中曾分离到2株H5N1亚型猪流感病 毒[5]；高致病力H5N1亚型流感病毒猪体感染试验 结果表明，病毒能够在体内复制到一定滴度，但不足 以造成疾病在猪群内的传播，但猪作为潜在中间宿 主更加有利于其传播[6]。因此，该亚型病毒对养殖 业及人类的威胁无法估量，防控工作依然十分艰巨。
of Agricultural Sciences，Harbin 150001，China；2.Liaoning Center for Animal Disease Control and Prevention，Shenyang 110164，China)
Abstract：To construct recombinant adenovirus shuttle plasmid pDC315-H5HA-EGFP，HA gene of A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)was amplified by RT-PCR and then inserted into adenovirus shuttle plasmid pDC315.A replication-defective recombinant adenovirus expressing HA gene (rAd-H5 HA-EGFP)was generated by co-transfecting HEK293 cells with the recombinant shuttle plasmid pDC315-H5 HA-EGFP and the genomic plasmid pBHGloxΔE1，E3Cre.The recombinant adenovirus was confirmed by PCR，RT-PCR and Western blot assay.These results demonstrated that HA protein was properly expressed by the rAd-H5HA-EGFP in HEK293 cell with natural biological activities.The TCID50 of the rAd-H5HA-EGFP was evaluated as 2.26×1010 mL-1after propagation and purification.And the results of immunization in BALB/c mice indicated rAd-H5HA-EGFP could induce HI antibodies and inhibit virus replication in mice lungs. Key words：swine influenza virus；H5N1 subtype；HA gene；recombinant adenovirus
禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗设计、表达制备及动物实验研究
禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗设计、表达制备及动物实验研究刘学东;包振民;王志亮【期刊名称】《同济大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(032)006【摘要】目的设计并获得一种安全、高效,并能对以H5N1亚型为主的多种禽流感病毒亚型产生保护的复合基因工程疫苗.方法利用分子生物学和分子免疫学方法对国内以及周边国家流行的禽流感毒株进行全面分析,利用生物信息学技术合理设计亚单位加表位的全新复合结构疫苗的氨基酸序列；利用大肠杆菌密码子优化技术根据疫苗氨基酸序列获得基因序列；通过全基因合成的方法获得该疫苗的基因,并通过大肠杆菌表达系统对该疫苗进行表达；目的蛋白经过包涵体洗涤和色谱纯化后复性；通过ELISA评价其抗原特异性,并乳化制备成禽流感蛋白疫苗,通过小鼠体内免疫试验检测其免疫效力.结果设计了包含通用性的辅助性T细胞表位、B细胞表位以及CTL表位的串接疫苗结构；全基因合成获得了该复合疫苗的基因序列；该基因在大肠杆菌表达系统中得到了高效表达,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白30％；经过粗纯和精纯后的目的蛋白纯度达到95.5％,复性后获得可溶性蛋白溶液,浓度可达2.4 mg/mL.结论通过小鼠实验,验证了该H5N1亚型基因工程疫苗的抗原性,证实该基因工程疫苗在免疫小鼠体内激发体液免疫的同时调动了细胞免疫.小鼠免疫试验证明,该疫苗可以在小鼠体内有效诱发免疫应答.%Objective To design and prepare a genetic engineering vaccine against avian influenza virus H5N1. Methods The composite amino acid sequences plus epitope subunit of vaccine were designed based on the analysis of prevalent avian influenzaH5N1 strains and bioinformatics. The amino acid sequence was obtained with E. Coli codon optimization technique; the vaccine gene was synthesized with the whole gene synthesis method and expressed with E. Coli expression system. Theprotein inclusion bodies were purified by renaturation chromatography after washing; the antigen specificity was measured by ELISA. The emulsified protein vaccine of avian influenza prepared was evaluated by immunization test in mice for immune effect. Results The target protein expressed in E. Coli accounted for approximately 30% of the total bacterial protein; the purity of protein was 95. 5% after purification and the concentration of soluble protein was up to 2.4 mg/ml. Immune tests proved that the vaccine effectively induced immune responses in mice. Conclusion The engineering vaccine against avian influenza virus H5N1 has been successfully prepared which can induce immune response in mice.【总页数】8页(P1-8)【作者】刘学东;包振民;王志亮【作者单位】中国海洋大学海洋生物遗传学与种质工程实验室,山东青岛266003;青岛市市立医院呼吸科,山东青岛266011;中国海洋大学海洋生物遗传学与种质工程实验室,山东青岛266003;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266008【正文语种】中文【中图分类】R254.2【相关文献】1.H5N1亚型禽流感病毒核蛋白NP的原核表达及抗体制备 [J], 罗孟成;陶攀;肖庚富;潘兹书2.禽流感病毒抗原表位分析及H5N1亚型基因工程疫苗设计 [J], 刘学东;王志亮;包振民3.表达H5N1亚型高致病性禽流感病毒HA基因的DNA疫苗可保护SPF鸡抵抗同型病毒的致死性攻击 [J], 姜永萍;陈化兰;于康震;张建林;步志高;唐秀英;田国彬4.H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶的表达及抗体制备 [J], 杨振华;陶攀;周思榆;吴叔文;潘兹书5.禽流感病毒H5N1亚型NS1蛋白在大肠杆菌中的高效表达和多克隆抗体的制备[J], 俞瑞卿;张传福;周晓巍;王玉炯因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
H5、H7亚型禽流感病毒HA基因DNA疫苗的研究
H5、H7亚型禽流感病毒HA基因DNA疫苗的研究H5、H7亚型禽流感病毒HA基因DNA疫苗的研究引言禽流感是由禽流感病毒引起的一种高传染性和致命性病情，对禽类养殖业和人类健康构成了重大威胁。
H5和H7亚型禽流感病毒特别具有关注度，因为它们往往会对家禽群体产生严重病症，且可以通过适应性变异传播至人类。
现有疫苗在应对新型病毒株变异方面存在一定限制。
鉴于此，研究人员开始探索基因工程方法以开发更有效的疫苗，其中包括H5、H7亚型禽流感病毒HA基因DNA疫苗。
基因工程方法H5和H7亚型禽流感病毒的HA基因被认为是目前疫苗研发的重点。
HA（Hemagglutinin）蛋白是病毒侵入宿主细胞所必需的重要复制酶。
基于HA基因的DNA疫苗研究致力于利用真核表达系统来构建和表达HA抗原，以试图提高对新型病毒株的免疫效果。
疫苗构建和表达H5、H7亚型禽流感病毒HA基因的DNA疫苗构建主要包括三个步骤：基因克隆、真核表达载体构建和病毒蛋白的表达。
首先，通过PCR技术从源病毒株中扩增HA基因。
然后，将扩增的HA基因连接到真核表达载体的多克隆位点，并通过限制性内切酶切割与连接方法实现基因载体的构建。
接下来，可选择适宜的真核表达载体，如pCI等，作为基因的载体，并进一步将HA基因插入载体中。
这样，就可以得到HA基因的真核表达载体。
最后，通过转染（transfection）技术将HA基因的真核表达载体导入哺乳动物细胞，如CHO细胞、293细胞等，实现病毒蛋白的表达。
DNA疫苗的特点相较于传统的疫苗，DNA疫苗具有以下特点：易于合成和扩增、较低的成本、更长时间的保护作用、更快的研发速度和多重免疫反应。
第一，DNA疫苗可以通过合成技术进行批量的大规模生产，降低了制备成本和供应的难度。
第二，DNA疫苗的保护效果具有持久性，一次接种可以产生长时间的免疫效果。
第三，相较于传统疫苗，DNA疫苗的研发速度更快，可以在短时间内合成和表达感兴趣的抗原。
H5亚型禽流感病毒HA基因杆状病毒载体的构建
H5亚型禽流感病毒HA基因杆状病毒载体的构建熊蕊;邓国华;黎玉梅;冉多良;陈化兰【期刊名称】《黑龙江畜牧兽医》【年(卷),期】2007()5【摘要】经过PCR反应,以特异性引物扩增了禽流感病毒DK/Zhejiang/11/00(H5N1)去除信号肽的HA基因,克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTA中,阳性重组质粒转座DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染sf 9昆虫细胞,获得含H5亚型禽流感病毒HA基因的重组杆状病毒H5HA-Bac HTA。
利用SDS-蛋白酶K方法提取重组病毒DNA,PCR反应证实HA基因片段已重组到杆状病毒基因组中。
以适宜剂量的重组杆状病毒接种sf 9昆虫细胞,待绝大部分细胞产生细胞病变后收获细胞。
细胞裂解产物经间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western-Blot试验检测,结果表明:H5亚型禽流感病毒HA基因在重组杆状病毒H5HA-Bac-HTA感染sf 9细胞后获得高效表达,且具有良好的蛋白活性及特异免疫反应原性。
【总页数】3页(P15-17)【关键词】H5;禽流感病毒;HA基因;重组杆状病毒【作者】熊蕊;邓国华;黎玉梅;冉多良;陈化兰【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室;新疆农业大学动物医学学院【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5【相关文献】1.H5N1亚型禽流感病毒HA、NA基因在杆状病毒中的重组体的构建 [J], 杨若松;李明义;赵雪丽;张志2.H5N1亚型禽流感病毒HA基因杆状病毒双表达系统的构建及其在小鼠的免疫原性分析 [J], 樊惠英;林文耀;佟铁铸;张杰;叶昱;靳立明;张春雷;廖明3.禽流感病毒H5亚型HA基因在杆状病毒系统中的表达及生物学活性鉴定 [J], 赵双成;常晓飞;田石;柳金雄;陈普成;田国彬;邓国华;姜永萍;陈化兰4.H5亚型禽流感病毒HA基因在重组杆状病毒中的表达及检测 [J], 费东亮;金宁一;马鸣潇;夏志平;鲁会军;金扩世5.H5亚型禽流感病毒HA基因昆虫／杆状病毒系统的表达及对BALB/c小鼠的免疫保护 [J], 孟庆文;刘光亮;于康震;童光志;刘娣;施建忠;陈化兰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
１ ３ 实 验 动 物 ．
死亡 ， 引起公 众 极 大 恐 慌［ 。研 究 Ｈ５ １ ］ Ｎ１禽 流感 疫 苗的工 作显得 尤 为重要 。传统 减 毒 疫苗 存 在 毒力 返
段病 毒基 因， 不存在 这 种危 险 ， 且具 有 与 减 毒疫 苗 并
强的 危险 ， 比之 下 Ｄ 相 ＮＡ 疫 苗 由 于 其 序 列 仅 是 一 脂 质 体 Ｌｐ ｆｃａ ｎ ０ ０均 为 Ｉｖｔｏ ｅ 司 产 ｉｏｅｔｍｉｅ２ ０ ｎｉ ｇｎ公 ｒ 相 当 的免 疫原 性［ 。ＨＡ 是 诱 导 体 液免 疫 的 主要 保 ２ ］
暴发 了 Ｈ５ 亚 型 高 致 病性 禽 流感 ， Ｎ１ 同时 也 发 生 了 Ｅ ａ ＤＮＡ 聚合 酶 、 ｕ Ｉ和 Ｘ ｏ Ｉ限制 性 ＸＴｑ ＭＺ ｈ
数 百起 禽流感 病 毒 感 染 人 的 事 件 ， 至 引 起 了人 的 甚
内切 酶 和 Ｔ ４ ＤＮＡ 连 接 酶 购 自宝 生 物 工 程 （ 大连 ） 有 限公 司 ； 回 收试 剂 盒 和质 粒 小 提 试 剂盒 购 自上 胶 海华 舜 生物 工 程 公 司 ； 毒 Ｒ 病 ＮＡ 提 取 试 剂 Ｔｒ ｏ、 ｉｌ ｚ 品 ； 内毒素 质 粒大 量 提取 试 剂 盒采 用 Ｏｍｅ ａ公 司 无 ｇ
次 ， 次免 疫 间隔 ３周 。每 次免 疫 前采 集血 清 用 Ｅ Ｉ Ａ检 测抗 体 效价 。最后 一 次免 疫后 ３周 用 １ 。 Ｉ ５的 每 ＬＳ ０ＥＤ。
高致病 性 流感病 毒 Ａ／ ｏ ｅ ＨＬ ／ Ｙ／ ４ Ｈ５ ） 行 攻 毒 试 验 。免 疫 组 小 鼠抗 体 效 价 与 对 照组 相 比 明 Ｇｏ ｓ／ Ｊ ＱＦ ０ （ Ｎ１ 进 显 升高 ， 脂质 体位 剂免 疫 组与 非 脂质 体免 疫 组 小鼠抗体 效 价 差异 不显 著 ， 因免 疫 组 小 鼠能够 抵抗 Ｈ５ 但 基 Ｎ１ 高致 病性 禽流 感病毒 的 致死 性 攻击 。该核 酸 疫 苗 虽然 能 够诱 导 Ｓ Ｆ鸡 产 生 抗 体 应 答 ， 抗 体产 生 缓慢 ， Ｐ 但 效
维普资讯
动 物 医学进展 ．０ ８ ２ （ ） １— ８ ２ ０ ， ９ ７ ： ３１
Ｐｒ ｒ ｓ ｎ Ｖｅ ｅ ｉ ｒ ｅ ｉ ｉ ｏｇ ｅ ｓ ｉ ｔ ｒｎａ ｙ Ｍ ｄ ｃｎｅ
Ｈ５ Ｎ１亚 型 禽 流 感病 毒 ＨＡ 基 因 核 酸 疫 苗 的 构 建 及 免 疫 效 果 研 究
护 性抗 原 ， 量 的研 究 表 明 ＨＡ 在 病 毒 人 侵 宿 主细 大 胞 的过程 中起 着 重 要 作 用 ［ ， 此 ＨＡ 基 因 成 为 禽 ３因 ］
流感 ＤＮＡ疫 苗 的首选 基 因 。
６ 龄 ～８周 龄 、 性 Ｂ ｌ／ 周 雄 ａｂ ｃ小 鼠购 自 中国科
学 院 实验 动物 中 心 ， 验 期 间 饲 养 于禽 病 感 染 实验 试 本试 验 成 功 构 建 了 含 有 流 感 病 毒 Ａ／ ｏ ｓ／ 室 的 负压 隔离 器 中 。 Ｇ ｏｅ
摘 要 ： 用 Ｒ ／ ４ Ｈ５ ）ＨＡ 基 因， 采 ＴＰ Ｒ Ｇｏ ｓ／ Ｊ ＱＦ ０ （ Ｎ１ 然
后将 其 克隆到 真核表 达 载体 ｐ Ｉｎ ｏ中 ， 得 重组 质 粒 ｐ ＩＨＡ。在 脂 质 体 介 导 下转 染 Ｖｅｏ细胞 ， 抗 免 Ｃ－ｅ 获 Ｃ－ ｔ 单
疫组 化 Ｉ ＭＡ 结果表 明 ， Ｐ ＨＡ 蛋 白在 ＶｅｏＥ ｒ ６细胞上 大 量表 达 。 Ｃ － 质 粒在 有 或 无脂 质体 佐 剂存在 下以 ｐ ＩＨＡ
５ ｇ剂 量 免 疫 接 种 Ｂ ｌ／ ０肛 ａｂ ｃ小 鼠 和 Ｓ Ｆ 鸡 ， 照 组 只接 种 ５ ｇｐ Ｉｎ ｏＤ Ｐ 对 ０ Ｃ —ｅ ＮＡ ， 组 以 相 同剂 量 加 强 免 疫 两 各
价较 低 。
关键词 ： 流感病 毒 ； 禽 ＨＡ 基 因； 酸 疫 苗 ； 疫 效力 核 免
中 图 分 类号 ： ８ ２ ６ ９５ Ｓ ５ ． ５ ． 文献标识码 ： Ａ 文章 编 号 ：０ ７５ ３ （０ ８ ０ —０ ３０ １ ０—０ ８ ２ ０ ）７０ １—６
２０ ０ ３年 以来 ， 亚洲 、 欧洲 和 非 洲 数 １ ０个 国 家都 １ ２ 主 要 试 剂 ．
陈 浩 刘 明 ， 一， 刘春 国。杨 涛。 李 洪涛ｈ ， ， ， 。杜金玲。 孙恩成。 ，
（． １ 东北 农 业 大 学 动 物 医 学 院 ， 龙 江 哈 尔 滨 １０ ３ ；． 国 农 业 科 学 院 哈 尔 滨 兽 医研 究 所 ， 业 部 动 物 流感 黑 ５００２中 农 重 点 开 放 实 验 室 ， 医生 物 技 术 国 家 重 点 实 验 室 ， 龙 江 哈尔 滨 １ ０ ０ ；． 龙 Ｋ ／ － 农 垦 大 学 ， 龙 江 大 庆 １３ １ ） 兽 黑 ５０ １ ３ 黑 ｋ 黑 ６３ ９
参考 已发 表 的 ＨＡ 基 因序 列 用 Ｏｌ ｏ６ ０软件 ｉ ． ｇ 设 计 了 １对 引 物 。上游 引 物 带有 Ｘ ｏ Ｉ酶切 位点 ， ｈ
Ｈ５ １ ｈ － ｏ Ｘ Ｉ： ＡＴ Ｔ ＧＡＧＧ ＡＡＡＡＧ— ＧＣ Ｃ Ｃ
Ｃ ＡＧＧ ＧＧＴ Ｃ Ｃ ＡＡＴ ＴＧＴ 下游 引 物 带 有 Ｃ Ｃ；
１ ４ 引物设 计 ．
ＨＬ ／ Ｙ ０ （ Ｎ１ ＨＡ 基 因 的 重 组 质 粒 ｐ Ｉ ＪＱＦ ／ ４ Ｈ５ ） Ｃ— ＨＡ， 用其作 为 ＤＮＡ 疫 苗 ， 小 鼠进 行 免 疫 保 护 并 对 试验， 为进 一 步的研 究 奠定 基础 。
１ 材料 与方 法
１ １ 病毒 、 ． 细胞 与 栽体