医疗器械初始污染菌检验
初始污染菌检查
初始污染菌检查生物学检查初始污染菌检查空气中细菌总数检测方法物体表明和生产人员手细菌总数检测方法初始污染菌检测初始污染菌检测目的:保证灭菌的效果，确定灭菌剂量，监控灭菌过程的有效性。
引用标准: GB15980-1995 一次性使用医疗用品卫生标准中华人民共和国药典2010版附录微生物限度检查法 GB15980-1995 规定了一次性使用医疗用品灭菌、消毒前、后的卫生标准。
对一次性使用医疗用品(包括灭菌和消毒的一次性使用医疗用品)生产企业中生产、装配、包装车间(空气中细菌总数检查方法)等生产过程和生产工人手提出卫生要求的质量控制。
检测环境和检验量在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向空气区域内进行。
洁净区设置可在微生物室操作各类产品每批随机抽样10件样品(10个包装) 方法主要步骤采样初始污染菌检测初始污染菌检测检验方法将每样取5份平行样(取一份样品，根据限值制备好供试液后，取5份1:10，取5份1:100，取5份1:1000，……) 初始污染菌检测结果计算公式:平均菌落数×稀释倍数菌数菌数/每件次(或g) ―――――――――――――――――――件次或重量(g) 注意事项: 供试品的取样必须在万级环境中100级净化条件下，无菌操作，防止污染。
应严格遵守无菌操作，同时消除抑菌成份的干扰。
产品初始污染菌数限值: 灭菌产品管道类内腔?10cfu/件次，外部?100cfu/件次，非管道类?100cfu/件次，敷料类?100cfu/g;消毒产品?1000cfu/件次或重量(g) 初始污染菌检测细菌计数细菌计数先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5-10倍的放大镜检查，以投射光衬以暗色背景，以防遗漏(可辅助菌落计数器)记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数(每个稀释度的5个平板值，相加后除以5)。
若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数，若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘2，以代表全皿菌落数。
初始污染菌检验规程
初始污染菌检验规程初始污染菌检验规程1、准备工作1）与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30min。
2）采样数量：每批产品随机抽取10件样品.3）检测标准《GB 15980-1995一次性使用医疗用品卫生标准》：≤100cfu/件次。
4）洗脱液、稀释液采用0.9％无菌氯化钠溶液。
2、试验步骤：1）用无菌手续取出10个样品，分别放入10支装有10ml0.9％无菌氯化钠溶液的试管中，将每个采样管震打80次，混匀，分别吸取1ml放入灭菌平皿，用普通琼脂培养基作倾注培养，置37℃温箱培养48±2h观察结果。
2）用肉眼直接计数，然后用5-10倍放大镜检查，有否遗漏。
若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辩时仍以2个或2个以上菌落计数。
3）计算公式为：菌数/件次=平均菌数×稀释倍数/件次。
阴性对照试验：将使用的0.9％无菌氯化钠溶液吸取1ml放入无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。
制备2个平板均不得有菌生长。
3、注意事项：1）在无菌操作台上做试验，防止环境对样品的再次污染，采取一切措施防止人为对样本的污染。
2）由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀的区别，必要时用显微镜鉴别。
编制：审核：批准：ZC-14-8初始污染菌监测操作规程1范围适用于对刚包装好的外科手套和检查手套的初始污染菌的监测和对新购进的小包装（接触手套的小包装）的监测。
第一个月每周进行一次监测，如果监测结果是稳定的以后每个月监测一次，如果3个月都稳定，监测周期改为每季度一次。
2职责质管部负责取样、按ISO 11737进行试验、如试验结果初始污染菌超过6 cfu/cm2,要及时查找原因，提出改进措施，包括工艺中产品防护和进行环境消毒。
3生物负载测定方法A.1概要A.1.1生物负载测定，可使用不同的方法内容。
初始污染菌检测
-所需供试液的用量和浸提时间需验证 处理方法：振动、冲洗、擦拭法、袋蠕
动、超声、涡旋混合、搅拌
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举例—振动
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小型医疗器械可以投 入无菌的自封袋中， 加入缓冲液充分振动。
另外，用缓冲液冲洗 内包装袋的内壁。并 与产品缓冲液相混。
A 试验组
供试液+试验菌（50~100cfu）
B 菌液组
试验菌（50~100cfu）
C 供试品对照组
D缓冲液对照组 缓冲液+试验菌（50~100cfu）
(A-C)/B>70%
D/B>70%
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菌落计数报告规则—平板法
选取细菌、酵母菌平均菌落数在30～300之间、霉菌平均菌落数在 30~100之间的稀释级作为报告菌落数的依据。
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薄膜过滤法
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培养
药典中的培养条件： 细菌 30-35℃ 48h 霉菌、酵母菌 23-28 ℃ 72h 必要时，可适当延长培养时间至5-7天
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菌落计数
计数方法：将平板置菌落计数器或从平板的背面直接 以肉眼用标记笔点计，以投射光衬以暗色背景，仔细 观察，计数。必要时可以借助于放大镜、菌落计数器。
菌落特征： ⑴ 形态特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、
淡黄色（如果培养基中加入0.1%TTC(氯化三苯基四 氮唑试剂)，菌落为红色） ⑵ 边缘整齐或不整齐，表面有光滑、粗糙，皱褶、突起 或扁平。 ⑶ 大小差异很大。
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医疗器械的无菌和初始污染菌检验
器械的无菌和初始污染菌检验
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培养基适用性检验
血琼脂平板上金黄色葡萄球菌 （大金黄色菌落）
在划线过程中，细胞逐步分散，培养后可形成单个菌落。
器械的无菌和初始污染菌检验
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培养基适用性检验
定时移植法:亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜斜 面培养基上，最适条件下培养，完成培养于(4～6)℃进行保 留并间隔一定时间进行移植培养一个短期菌种保藏方法。
细胞核及核膜、核仁，直径普通为1μm ~ 10μm。
器械的无菌和初始污染菌检验
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真菌：为多细胞或单细胞微生物，其细胞分化完善， 有细胞核和各种细胞器，故易在体外生长繁殖，直径普
通为10μm ~ 100μm。
器械的无菌和初始污染菌检验
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医疗器械无菌检验所需设备
超净工作台
器械的无菌和初始污染菌检验
医疗器械的无菌和初始污染菌检验
医疗器械无菌检验技术
器械的无菌和初始污染菌检验
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什么是无菌检验法？
用于检验要求无菌医疗器械是否无菌一个方法。 若供试品符合无菌检验法要求，仅表明了供试品在 该检验条件下未发觉微生物污染。
无菌试验目标：将医疗器械或其浸提液接种于培 养基内，以检验供试品是否有细菌和真菌污染。
无菌检验人员必须具备微生物专业知识，并经过 无菌技术培训。还应该含有高度责任心和严谨细 致工作作风。
器械的无菌和初始污染菌检验
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无菌检验法 环境要求
器械的无菌和初始污染菌检验
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无菌检验法 环境要求
隔离系统
器械的无菌和初始污染菌检验
初始污染菌检验规程
初始污染菌检验规程
背景介绍：
在实验室实验过程中，初始污染菌检验是非常重要的步骤。
初始污染菌指的是
空气、水、试剂或其他材料中存在的微生物。
检验规程的制定能够帮助实验室准确检测和控制初始污染菌的存在，确保实验结果的准确性和可靠性。
检验标准：
初始污染菌检验应符合国家相关标准要求，例如《实验室建设与管理规范》中
对于实验室环境洁净度的规定。
检验过程中应注意保持环境清洁，严格按照检验程序进行操作，确保检测结果的准确性。
检验步骤：
1.准备工作：检验前应检查所需试剂、工具和设备是否齐全，确保实
验室环境干净整洁。
2.取样：根据检验对象的不同，采取相应的取样方法，避免外界污染
的介入。
3.样品处理：对样品进行适当处理，如过滤、稀释等，以便得到合适
的实验样品。
4.培养：将样品接种在适当的培养基上，并在合适的环境条件下培养，
观察细菌的生长情况。
5.检测分析：通过显微镜观察细菌的形态特征，或进行生物学、生化
等相关检测，确定是否存在初始污染菌。
6.记录结果：将检验结果详细记录，包括检测方法、结果数据、存在
问题等，便于回顾和分析。
结论与建议：
初始污染菌检验是确保实验室环境洁净度和实验结果准确性的重要步骤。
在检
验过程中，应严格按照规程操作，保持实验样品的完整性和准确性。
实验室应建立健全的质量管理体系，加强对初始污染菌的监测和控制，不断优化检验方法，提高检测效率和准确性，确保实验室的质量与信誉。
医疗器械无菌和初始污染菌检
≤200 ≤20
不得检出不得检出
不得检出不得检出
≤100 不得检出
尿布等 普通级 消毒级
— ≤10 000
≤200 ≤20
不得检出不得检出
不得检出不得检出
≤100 不得检出
注：致病性化脓菌指绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌与溶血性链球菌。
初始污染菌的检验
03
02
当菌落数在100以内，按实有数报告，大于100时采用二位有效数字。
超净工作台
恒温培养箱（至少2台）
压力蒸汽灭菌器
电热干燥箱
集菌仪
电子天平
光学显微镜
环境及人员要求
无菌检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
需氧菌生长
厌氧菌生长
培养基:
改良马丁培养基： 23℃ ~ 28℃培养14天
培养基:
培养基的适用性检查
无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。
01
02
灵敏度检查所用菌种 （药典2010版规定） 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 白色念珠菌 黑曲霉
待琼脂凝固后翻转平皿置35 ℃±2 ℃培养48h后，计算平板上的菌落数。
取上清液共接种5个平皿，每个平皿中加入1mL供试液
稀释度 5
医疗器械的无菌和初始污染菌检验相关标准
初始污染菌检查
菌数/cm2=
平均菌数 稀释倍数 采样面积c（ m2）
菌数/每只手=平均菌数×稀释倍数
谢谢
对生产人员手采样：被检人五指并拢，将浸有灭菌生 理盐水的棉拭子在右手指曲面，从指尖、甲沟至指根 处往返涂抹10次后，将棉拭子放入10ml灭菌生理盐 水的试管中。
检验方法和结果计算
将每个采样管震打80次，混匀，10倍递 减稀释，对每个稀释度(取3个稀释度)， 分别取1ml放于灭菌平皿内，每个稀释 度倾注2块平板），用普通琼脂培养基 作倾注培养，置37℃温箱倒置培养24h， 观察结果，取菌落数为30～300的平板 计算，求出平均菌落数。
2. 2.供试品是液体取10ml加至100ml灭菌生理盐水中充分振荡后取样。作为1：10 的供试液。
3. 3.对供试品不能采用破坏性取样可用浸有无菌生理盐水拭子涂抹采样，被采表面 积为100cm2.加入灭菌生理盐水100ml。作为供试液。
4. 4.可用破坏性方法取样供试品：（参照中华人民共和国药典2019年规定进行)
6、菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告。大于100时，采用 二位有效数字，在两位有效数值后面，应以四舍五入法计算。在报告菌落数 为“不可计”时，应表明样品的稀释度
细菌计数结果及报告方法
例次 1 2 3 4 5 6
不同稀释度的平均菌落数
10-1
10-2
10-3
1365
164
20
2760
初始污染菌检测
供试液制备
•推荐的制备方法
样品制 备
用灭菌剪刀将纱布剪成小块，称取
10g，移入100ml灭菌生理盐水中， 不时振摇。作为1：10供试液。
纱布模拟
供试液制备
供试液10倍递减稀释。 尽量避免丝线等杂物的混入。
初始污染菌方法验证
初始污染菌方法验证公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]1.目的验证产品初始污染菌数的试验方法。
2.范围适用于质量部门对产品初始污染菌数验证试验的检测。
3.职责质量检验人员负责执行此规程。
4.依据标准及相关文件2010 版《中华人民共和国药典第二部》附录Ⅺ J 微生物限度检查法GB/《医疗器械的灭菌-微生物学方法-第一部分产品中微生物数量的估计》GB15980-2009 《一次性使用医疗用品卫生标准》5.试验产品6.注意事项本操作应在环境洁净度10000 级下的局部洁净度100 级的无菌操作台内进行。
操作过程应尽量避免任何可能使结果发生偏差的污染。
无菌操作台必需定期进行洁净度检测??试验前提前开紫外灯15min 后方可进行实验操作。
过滤器、滤膜、镊子以及无菌设备杯使用前应进行灭菌??使用时应保证滤膜在过滤前后的完整性。
7.器材与试剂器材35℃恒温培养箱、23℃恒温培养箱、灭菌器、洁净工作台、无菌过滤装置、镊子、剪子、电子天平、移液器、接种环稀释液、冲洗液及其制备方法稀释液、冲洗液配制后按说明书要求进行灭菌。
pH 无菌氯化钠溶液—蛋白胨缓冲液%无菌氯化钠溶液。
培养基营养琼脂培养基：按说明书方法保存配制。
玫瑰红钠琼脂培养基：按说明书方法保存配制。
改良马丁液体培养基：按说明书方法保存配制。
改良马丁琼脂培养基：按说明书方法保存配制。
营养肉汤培养基：按说明书方法保存配制。
8.计数方法的验证试验当建立产品初始污染菌数检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：以确认所采用的方法适合于该产品细菌、霉菌及酵母菌的测定。
若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。
对各试验菌的回收率应逐一进行验证。
菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为0代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
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起草人/日期 审核人/日期
批准人/日期 分发部门 品质部
1、目的
检测产品灭菌前实际带菌（活的微生物群）的数目。
2、适用范围
适用于本公司产品初始污染菌的检测。
3、职责
由品管部负责执行实施。
4、检测程序
4.1检验频次：
车间生产的产品三个月做一次初始污染菌检验，至少抽取3个批次进行检测，对不同车间和材质的产品进行轮流循环抽样。
标准作业规程
标准要求
4.2取样方法
4.3试验方法
4.3.1配制洗脱液
4.3.1.1称量
4.3.1.2溶解
4.3.1.3洗脱液分装
用电子太平准确称取9gNaCl 。
用灭菌镊子于同一个批次三个大包装（三个以上员工的产品）中至少随机抽取90g 或抽取12个最小销售包装样品，1/3样品用于检测,1/3样品用于留样，另1/3样品(可就地封存)必要时用于复检。
装入无菌的塑料袋中，立即密封好（塑料袋上应标示产品的生产日期、定单编号、规格、生产车间、员工姓名、产品代号）并立即送检，送检中不得打开塑料袋，三分之一用于测试，三分之一用于留样，三分之一必要复试。
样品最小包装不应有破损,检验前不得开启。
将已称好9gNaCl 溶于1000ml 蒸馏水中，充分搅拌直至完全溶
解。
4.3.1.4洗脱液灭菌
4.3.2样品处理
4.3.2.1样品制备
4.3.2.2 样品混匀
4.3.2.3
吸取样液
4.3.2.4平板倾注法
称取9gNaCl溶于1000ml蒸馏水中,然后用锥形瓶分装，每瓶
100ml（可以根据实验的需要分装不同体积的液体）。
在 100 级净化工作台条件下用无菌方法打开用于检测的至
少3个包装，从每个包装中随机取样，准确称取l0g土1g样品.
用灭菌剪刀和镊子把样品剪碎.
样品剪碎后用灭菌镊子加入到100ml的洗脱溶液中，将装有
样品的锥形瓶靠压在旋涡混合器上的施转垫上振荡（2800次
/min）2min。
如被检样品是吸水量较高的材料而导致不能
吸出足够样液时，洗脱液量可按每次50ml,递增，直至能吸
出足够测试
在无菌操作台中，待上述生理盐水样液自然沉降后取上清液,
用灭菌移液管从锥形瓶中吸取1ml样品的洗脱液转移到无菌
平皿。
每个样品分别接种于两个平皿.
用牛皮纸或医用透析纸密封，放入高压蒸汽灭菌器中121℃灭
菌，15分钟。
4.2.3 培养
4.2.4菌落计数
阳性组
实验组
4.2.5复检
4.2.6结果报告
将冷却到45℃左右的熔化营养琼脂培养基15～
20ml倾注无
菌平皿内，立即旋转平皿，使样液与培养基充分混匀。
每个
样品应倾注两个平皿，待琼脂凝固后，翻转平皿，使底部面
向上，平皿的菌落数即为产品灭菌前的菌落数。
菌落呈片状生长的平板不宜采用;计数符合要求的平板上的菌
落。
当菌落数在100以内，按实有数报告，大于100时采用二位有
效数字。
如果样品菌落数超过4.2.3.8规定应进行复检.
待琼脂凝固后，翻转平皿，使底部面向上。
日本、美洲、欧洲
产品以及它区域产品在30-35℃下的恒温箱内培养3D～7D后
进行菌落计数，若是培养霉菌、酵母菌则更换成沙氏琼脂培养
基或马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）至25℃±2℃培养7D，分别于
3、5、7天观察，计算平板上菌落数，如果发现菌落蔓延，以
前一次的菌落计数为准。
两个平板中的平均菌落数为0.1g产
品灭菌前的菌落数。
在对照组的对照下数菌落数，产品初始污染菌=产品灭菌前菌
落计数乘以校正因子
[日本产品根据日本药典要求真菌≤100cfu/g, 好氧性细菌≤
1000cfu/g,欧洲产品根据EN ISO11737.1-2006要求菌落总数
≤100cfu/g,其它产品根据ISO11737.1-2006要求菌落总数≤
100cfu/g]，即为产品的实际带菌数。
记录结果，出具报告。
将留存的复检样品依前法复测2次，2次结果平均值都达到本
标准的规定，则判定被检样品合格其中有任何1次结果平均值
超过本标准规定，则判定被检样品不合格。
5、引用文件
EN ISO11737.1-2006，日本药典，GB15980-2009.
6、相关记录。