细菌感染的病原学诊断

六、其他生化试验
1.凝固酶试验
原理
致病性葡萄球菌可产生两种凝固酶：结合凝固酶 （或凝聚因子）和游离凝固酶。
纤维蛋白原
结合凝固酶 协同因子
纤维蛋白
（玻片法 ）
游离凝固酶 （凝血酶原）
凝血酶样物质
纤维蛋白 （试管法）
纤维蛋白原
结果
玻片法：对照侧无凝集颗粒 血浆侧出现明显凝集颗粒
阳性
试管法： 血浆凝固、不流动—— 阳性
只用一种染料色的方法
制片→结晶紫1min→水洗→晾干、油镜检
革兰染色法（Gram stain）
方法（改良快速法）
– – – –
初染： 媒染： 脱色： 复染：
结晶紫＋等量NaHCO3 碱性碘液 丙酮酒精 碱性稀释复红
3～5s，水洗 3～5s，水洗 3～5s，水洗 3～5s，水洗
结果
紫色：革兰阳性菌
3. 厌氧培养

厌氧菌对O2敏感，培养过程中需造成低氧化还原 电势的厌氧环境。

物理法、化学法、生物法。

厌氧罐培养法、气袋法、厌氧手套箱法、需氧 菌共生厌氧法等。
五、细菌的生长现象 细菌的菌落特征:




菌落大小 形状（露滴状、圆形、菜花样、不规则等） 高度（突起、扁平或凹陷） 边缘（整齐、波形、锯齿状、卷发状等） 表面（光滑、粗糙等） 湿润度（干燥、湿润等） 透明度（不透明、半透明、透明等） 颜色（红色、灰白色、黑色、绿色、黄色或无色等） 溶血性（α溶血、β溶血或γ溶血） 特殊气味
用人工方法将适合细菌生长需要的各种营养 物质配制成的混合营养制品。
（二）培养基的组成成分

营养物质 氮源、碳源、无机盐类、生长因子等 凝固物质 琼脂、明胶、卵白蛋白等
抑制剂
指示剂
抗生素、化学物质、染料等
酚红、溴甲酚紫、中性红等
（三）培养基的种类



按用途分类
基础培养基（basic medium）牛肉汤、普通琼脂平板

用途 鉴别A群和非A群链球菌的重要试验，
A群链球菌为阳性，其他群链球菌为
阴性。
2.奥普托欣（Optochin ）敏感试验

原理 Optochin(乙基氢化羟基奎宁) 能干扰肺炎链 球菌叶酸合成，抑制该菌的生长，故肺炎链球菌 对Optochin敏感，而其它链球菌对其耐药。
用途
用于肺炎链球菌和甲型链球 菌的鉴别。肺炎链球菌为阳性， 甲型链球菌为阴性。
• 用途
糖发酵试验是鉴定细菌最常用的生化反应，特别用于肠 杆菌科细菌的鉴定。
2.氧化/发酵试验（O／F试验）

原理
有氧 有氧或无氧 有氧或无氧
分解葡萄糖 分解葡萄糖 不分解葡萄糖
氧化型 发酵型 产碱型
细菌
又 称 葡 萄 糖 代 谢 类 型 鉴 别 试 验 或 Hugh-Leifson （HL）试验
4.苯丙氨酸脱氨酶试验

原理
细菌（苯丙氨酸脱氨酶）
苯丙氨酸
苯丙酮酸＋NH3
Fe+++
绿色化合物

用途
主要用于肠杆菌科的鉴定。
三、碳源和氮源利用试验
枸橼酸盐利用试验
原理
某些细菌能利用枸橼酸钠作为唯一碳源 获得能量，并利用铵盐作为唯一氮源，因而 能在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐 生成碳酸钠和氨，使培养基变为碱性。
血清学诊断（协助诊断）
细菌的抗原物质：
1.表面抗原 荚膜多糖抗原 K抗原 Vi抗原
2. 菌体抗原（O抗原） 3.鞭毛抗原（H抗原） 4.菌毛抗原 目前尚未用于细菌鉴定 特异性抗原：细菌鉴定与分群（型）的主要依据 类属抗原或共同抗原：非特异性交叉反应的原因
一、血清学鉴定
（一）凝集反应
1.玻片凝集试验
红色：革兰阴性菌
抗酸染色法（acid-fast stain）
原理 方法 （Ziehl－Neelsen染色法）
– 初染：5％石碳酸复红 加温
– 脱色：3%盐酸酒精 – 复染：碱性美兰
染 3～5min ，水洗
1 min ，水洗 1 min ，水洗
结果


红色：抗酸性细菌
蓝色：非抗酸性细菌
主要用于观察细菌的动力及其运动状态
1.悬滴法
2.压滴法
3.毛细管法
4.暗视野显微镜检查法
5.相差显微镜检查法
（二）细菌染色标本的检查
细菌染色标本的制作程序
涂片 → 干燥 → 固定 → 染色
3.细菌常用的染色方法
（1）单染色法 （2）复染色法
革兰染色法（Gram stain） 抗酸染色法（acid-fast stain） （3）特殊结构染色法
4.甲基红（MR）试验
原理
葡萄糖
细菌
丙酮酸
醇、酮、醛等
培养基 pH＞5.4
甲酸、乙酸、乳酸等 培养基 pH＜4.4
甲基红指示剂 pH＜4.5 变为红色
pH＞5.4 变为黄色
• 用途
主要用于大肠埃希菌和产气肠杆
菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。
5.VP试验
葡萄糖
细菌
丙酮酸
脱羧
乙酰甲基甲醇 ＋ CO2

应用
本试验常用于肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、流感 嗜血杆菌、炭疽芽胞杆菌的检测及分型。
（三）制动试验

原理
抗鞭毛抗体与鞭毛抗原结合，使鞭毛强直、 相互粘着而失去动力，细菌运动停止。

方法
菌悬液 → 悬滴观察 细菌运动
抗血清
室温 5～10min
悬滴观察 细菌运动



结果 阳性 细菌运动停止，菌体凝集成块 阴性 细菌运动无改变 注意事项 抗血清中不能加防腐剂。 应用 常用于运动活泼细菌的快速鉴定，如霍乱弧 菌的鉴定。
用途
用于葡萄球菌的鉴定，常作为鉴定葡萄球菌致病性的 重要指标。
2.胆汁溶菌试验
原理
胆盐或胆汁能溶解肺炎链球菌。
用途
主要用于肺炎链球菌与草绿色链球菌的鉴别。肺
炎链球菌阳性，草绿色链球菌阴性。
血清学试验
血清学检测的原理：
Ag ＋ Ab
未知
已知
Ag-Ab
已知
未知
血清学鉴定（确诊，细菌定种、定型）
原理 用诊断血清（已知抗体）在载玻片上直接与待检菌混 合，若有相应细菌，则可出现肉眼可见的凝集颗粒，借 以鉴定细菌。

方法
诊断血清
生理盐水
混匀 1～3min
观察结果
细菌

结果
阳性——试验侧出现凝集颗粒，对照侧均匀混浊； 阴性——试验侧与对照侧均为均匀混浊； 自凝——试验侧及对照侧均出现凝集颗粒。
注意事项

一张玻片只能涂染一份标本
不能使用染色缸
染色关键：脱色时间的长短
特殊结构染色法

荚膜染色（capsule stain） 芽胞染色（spore stain） 鞭毛染色（flagellum stain）
细菌的接种与分离培养技术
一、培养基（culture medium）
（一）定义
细菌感染的病原学诊断
一、临床标本的采集与处理原则
（一）标本的采集
要求：
1.早期采集：尽量在发病早期、应用抗生素之前采集 2.根据标本的种类及可能的目的菌的特性选择不同的 标本采集方法 3.无菌采集：严格无菌操作，采集后标本置于无菌容 器，且不得接触任何抗菌物质和消毒剂 4.标本采集要足量 5.安全采集
二、血清学诊断
用已知抗原检测病人血清中的相应抗体，以诊断感 染性疾病的方法。

用途 作为某些传染病的辅助诊断，尤其对某些病原体 不能培养或难于培养的感染性疾病，可以提供诊断依据。 血清学诊断主要适用于病程较长的传染病的诊断。 结果判断 一般作血清学诊断时，需取患者急性期和恢 复期双份血清标本，若后者的抗体效价比前者有4倍或4 倍以增长上才有诊断意义。
2.硫化氢试验 原理
含硫氨基酸
细菌
硫化氢
Fe2+（或Pb2+）
FeS↓（ PbS↓） （黑色）

用途
常用于肠杆菌科菌属间的鉴定。
3.尿素酶试验

原理
细菌（脲酶）
NH2 O＝ C ＋2H2O NH2 （尿素）
(NH4)2CO3
2NH3＋CO2 ＋H2O （培养基pH↑）
（碳酸铵）
用途
主要用于肠道杆菌科的鉴定。 变形杆菌属为＋。

用于半固体培养基或KIA、 明胶等具有高层的培养基接 种。 半固体培养基的穿刺接种可 用于观察细菌的动力。

4. 液体接种法

用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、 糖发酵管等的接种。
5. 倾注平板法

细菌定量培养
6. 涂布法

L棒涂布。 增菌培养、活菌计数、药敏试验等。
四、细菌的培养方法
半固体观察
动力阳性
动力阴性
细菌在液体培养基中的生长现象



表面菌膜生长 均匀混浊生长 沉淀生长
细菌系统，对糖和蛋白质
的分解能力不同，因而其代谢产物也各异。据
此可利用生物化学方法检测这些代谢产物以区 别和鉴定不同细菌。
一、碳水化合物代谢试验
1. 糖（醇、苷）类发酵试验
产碱型
用途
发酵型
氧化型
• 主要用于革兰阴性杆菌的鉴别。肠杆菌科细菌均为发酵型， 非发酵菌通常为氧化型或产碱型。 • 葡萄球菌和微球菌的鉴别，前者为发酵型，后者为氧化型。
3.七叶苷水解试验
阳性 阴性 培养基变黑 培养基不变色
• 用途
主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别，前者 阳性，后者阴性。也可用于肠杆菌科、其他革兰阴性 菌及厌氧菌的鉴别。