检测乙型脑炎病毒中和抗体的简化试验
十六、乙型脑炎检测方法
十六、乙型脑炎检测方法猪乙型脑炎乳胶凝集试验（LAT）诊断试剂盒使用说明书猪乙型脑炎是由流行性日本乙型脑炎病毒（JEV）引起的猪的一种繁殖障碍性疾病。
此病引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，公猪睾丸肿胀，萎缩、丧失配种能力及新生仔猪痉挛死亡。
临床上该病多呈散发，流行常发生于蚊虫滋生的炎热季节，，患畜病初体温升高、精神沉郁、跛行、有神经症状，病愈后隐性带毒，种猪表现繁殖障碍，该病给养猪业带来较大的经济损失。
猪乙型脑炎乳胶凝集试验是用乙脑弱毒疫苗毒株经纯化、浓缩等程序后致敏乳胶，制成乳胶凝集试验用抗原，用于检测动物血清中的乙脑病毒抗体，可在现场进行，具有安全、简便、快速、特异、敏感之优点。
1．试剂盒的内容：本品包括猪乙型脑炎致敏乳胶抗原、阳性血清、阴性血清、稀释液、玻片、吸头及使用说明书。
2．制品用途：用于猪乙脑血清学诊断。
3．使用方法：3．1 定性试验：取待检样品（血清）、阳性血清、阴性血清、稀释液各一滴（约15微升左右），分别置于玻片上，再各加乳胶抗原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1~2分钟，于3~5分钟内观察结果。
3．2定量试验：先将血清作连续稀释，各取1滴依次滴加于乳胶凝集反应板上，另设对照同上，随后再各加乳胶抗原一滴，如上搅拌并摇动，判定。
4．结果判定：4．1对照试验：出现如下结果试验方可成立，否则应重试：阳性血清加抗原呈“++++”；阴性血清加抗原呈“—”；抗原加稀释液呈“—”。
4．2 判定标准：“++++”全部乳胶凝聚，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明；“+++”大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊；“++”约50%乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊；“+”有少许凝集，液体呈混浊；“—”液滴呈原有的均匀乳状。
以出现“++”以上凝集为阳性。
5.贮藏:在2-8℃冷暗处保存，有效期暂定1年。
6.附注：被检样品采集及处理方法。
6．1 血清：按常规方法分离血清，要求无腐败。
6．2 使用前应轻轻摇匀乳胶抗原。
检测乙型脑炎病毒中和抗体的简化试验
检测乙型脑炎病毒中和抗体的简化试验摘要：在亚洲，乙型脑炎病毒是病毒性脑炎的常见病因，据统计，每年大约有45000例病例。
它导致显着的发病率和死亡率。
乙型脑炎病毒主要通过库蚊在鸟类和动物之间传播，而人类被认为是其终末宿主。
由于登革热在乙型脑炎流行地区也很普遍，因此必须通过检测乙型脑炎病毒特异性中和抗体来证实乙型脑炎阳性血清。
噬斑减少中和试验是检测以及量化乙型脑炎病毒中和抗体的黄金标准。
然而，噬斑减少中和试验大约需要一个星期，并且在在6个或24孔板中进行，这对于大规模筛选具有局限性。
因此有必要开发一种可用于检测和定量乙型脑炎病毒中和抗体的简化方案。
该法在96孔板中进行，将适合用于大规模筛查人群的免疫水平以及疫苗的免疫效力研究。
关键词：乙型脑炎病毒；中和抗体；酶联免疫引言在亚洲，主要由节肢动物传播的乙型脑炎病毒是病毒性脑炎的常见病原。
据统计，每年大约有45000个病例，死亡率为25%;并且有高达50％的患者留有神经系统后遗症（世界卫生组织，1996年）。
乙型脑炎病毒为RNA正链病毒，属于黄病毒科。
病毒发生表现有地方性周期性特点，库蚊和猪为其主要的宿主，病毒在其体内大量复制。
然而，人类被认为是其终末宿主。
（Sabchareon和Yoksan，1998）在亚洲许多地方乙型脑炎病毒都有流行，往往在这些地方都伴随有登革热病毒流行。
因此，为了与登革热区分，就必须通过检测乙型脑炎病毒特异性中和抗体来证实其确为乙型脑炎病毒阳性血清。
此外，检测中和抗体也可作为检测乙型脑炎疫苗效力的合理的替代措施。
（Markofff L.，2000）。
“斑减少中和试验是检测和量化乙型脑炎病毒中和抗体的标准方法（Shyu等.1997）。
然而，斑减少中和试验需要一周才能完成并且仅在6或24孔板中进行，从而对于大规模的筛选表现出一定的局限性，在疫苗的效力学研究以及血清流行病学调查方面其局限性表现得更加突出。
结果通过肉眼计数斑块的数量来获得，而这，也有一定的主观偏差。
乙型脑炎的检查
乙型脑炎的检查1.血象：白细胞计数一般在10～30×109/L，中粒细胞增至80%以上，核左移，嗜酸粒细胞可减少。
2.脑脊液检查：外观澄清或微混，白细胞计数增加，多数在0.05～0.5×109/L之间，个别病人可达1×109/L以上，或始终正常；在病初以中性粒细胞占多数，以后逐渐以淋巴细胞为多。
蛋白稍增加，糖定量正常或偏高，氯化物正常。
脑脊液中免疫球蛋白的测定对鉴别诊断有帮助。
化脓性脑膜炎患者脑脊液中的IgM明显升高，结核性脑膜炎患者则IgA、IgG升高显著，而病毒性脑膜炎患者在后期时IgG可有升高。
3.血清学检查：（1）血凝抑制试验：可测定IgM抗体及IgG抗体，敏感性高，方法简便快速，但试验要求严格，偶见假阳性反应。
双份血清效价增长4倍以上可确诊，单份血清抗体效价1：100为可疑，1：320可作诊断、1：640可确诊。
（2）二巯基乙醇（2ME）：耐性试验检测IgM抗体，患者血清标本在2ME处理前、后分别作血凝抑制试验，如处理后血凝抑制抗体效价下降1/2～3/4，表示特异性Ig M已被2ME裂解，即为试验阳性。
本法可在起病第4～8天即呈阳性，且由于单份血清即有辅助价值，故可对乙脑进行早期诊断。
（3）补体结合试验：特异性较高，但其阳性大都出现在第4～7周，双份血清抗体效价有4倍或以上的增长即可诊断。
若仅单份血清，1：2为可疑，1：4以上有助诊断。
（4）中和试验：病后一周血中出现中和抗体，效价增长4倍以上可确诊。
早期为IgM，后期为IgG.此法特异性及敏感性均较高，抗体持续终生。
一般用于流行病学调查。
（5）免疫荧光试验：发病初1～2天的血液或发热第2～4天的脑脊液及发热全程的脑室内的脑脊液，均可采用本法检测乙脑病毒抗原，方法快速，阳性率高，有早期诊断价值。
酶联免疫吸附试验（ELISA）：一般用于测定血清中的乙脑抗体，比较灵敏、特异。
4.病毒分离：病初可取血清或脑脊液接种乳鼠以分离病毒，但阳性率较低。
全国乙型脑炎病毒检测技术规范(2023年修订版)
全国乙型脑炎病毒检测技术规范(2023年修订版)1. 引言本文档为全国乙型脑炎病毒检测技术规范的修订版，用于指导乙型脑炎病毒的检测工作。
本规范适用于各种检测方法，包括实验室和临床现场检测。
2. 检测方法选择乙型脑炎病毒检测方法应根据检测目的、设备和人力资源等实际情况进行选择。
常用的检测方法包括：- 病毒分离与培养法- 分子生物学方法- 免疫学方法- 细胞培养-PCR方法3. 仪器与试剂3.1 仪器乙型脑炎病毒检测仪器应具备以下特点：- 准确可靠- 高效快速- 具备自动化分析功能- 易于操作和维护3.2 试剂使用的试剂应符合以下要求：- 高纯度- 无污染- 有效期内- 适用于特定检测方法4. 采样与保存4.1 采样采样时应遵循以下原则：- 采样部位应选择合适的组织或分泌物，如脑脊液、血液等- 要采集足够的样本量，以保证后续检测的准确性和可靠性- 避免样本污染，使用消毒的采样器具- 存储样本的应具备防漏和防污染的功能4.2 保存保存样本时应注意以下事项：- 样本应保存在低温条件下，常见温度为-70°C。
- 不同类型的样本应分别保存，避免混淆和交叉污染。
- 样本应密封，避免温度变化和氧化损害。
5. 检测流程与步骤乙型脑炎病毒检测应按照以下流程进行：5.1 样本处理- 样本接收与登记- 样本稀释或净化- 样本裂解处理5.2 样本检测- 样本制备- 抗原或核酸提取- 检测方法操作5.3 结果判读与分析- 结果读取- 结果分析与判定- 结果记录与报告6. 质量控制与质量保证6.1 质量控制- 设定质控样本- 检测过程中加入质控样本进行验证- 记录质控样本的检测结果6.2 质量保证- 定期进行仪器校准和验证- 培训检测人员，提高技术操作水平- 定期进行质量评估和内部审核7. 数据管理7.1 数据采集实施标准化的数据采集流程，确保数据的准确性和完整性。
7.2 数据存储与分析建立合适的数据库进行数据存储和分析，包括样本信息、检测结果和质控数据等。
乙型脑炎病毒NS1基因原核表达及脑炎抗体检测方法的初步研究的开题报告
乙型脑炎病毒NS1基因原核表达及脑炎抗体检测方法的初
步研究的开题报告
一、研究背景和意义
乙型脑炎是一种重要的人畜共患传染病，主要由乙型脑炎病毒引起，病死率较高，对人口健康和农业发展造成重大威胁。
目前，乙型脑炎的诊断主要依靠病毒分离和抗
体检测，但分离病毒需要耗费大量时间和精力，而抗体检测则无法准确判断病毒感染
的早期阶段。
因此，寻找新的乙型脑炎诊断方法是很有必要的。
NS1是乙型脑炎病毒的一个非结构蛋白，广泛存在于感染细胞的早期和晚期，且在血清中的含量较高。
因此，NS1可以作为乙型脑炎病毒感染的早期指标，并且由于
其原核表达便捷、纯化简便，因此可以作为一种新的诊断方法开发。
二、研究内容和方法
本研究旨在通过原核表达方法获得乙型脑炎病毒NS1蛋白，并利用该蛋白制备
抗体以开发NS1抗体检测方法。
主要研究内容如下：
1.基因克隆
根据文献报道的NS1基因序列，设计引物，利用PCR扩增NS1基因，并将其连接至原核表达载体中。
2.原核表达与纯化
将NS1原核表达载体转化至大肠杆菌中，在含IPTG的培养基中诱导表达并纯化NS1蛋白。
3.制备抗体
用纯化的NS1蛋白免疫Balb/c小鼠，获得抗NS1蛋白的多克隆抗体。
4.建立NS1抗体检测方法
利用ELISA方法，验证获得的抗NS1蛋白多克隆抗体的特异性和敏感性，并建
立NS1抗体检测方法。
三、预期结果和意义
本研究预计可以开发出一种快速、准确、灵敏的NS1抗体检测方法，用于早期诊断乙型脑炎病毒感染。
此外，该研究的方法也为其他病毒的早期诊断奠定了基础，具有重要的应用前景和推广价值。
检测乙型脑炎病毒中和抗体的简化试验[英]／Ting SHL…／／J Virol Meth—ods.—2001,93(1—2).—43—47
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次 ＨＩ 聚 合 酶 链 反 应 定 性 分 析 的 费 ｖ
用 是 一 次 ＨＩ Ｅ Ｓ 的 ｌ Ｖ ＬＩＡ ｏ倍 。 Ｖ ＩＡ ＨＩ ＥＬ Ｓ 定 量 分 析 的 结 果 和 临 床 检 查 相 结 合 可 能 为 诊 断 婴 儿 期 ＨＩ 感 染 的经 济 方 法提 供 基 础 。 ｖ 采 用 此 法 可 使 ７ 由 ＨＩ 感 染 母 亲 所 生 的 婴 ０ Ｖ
Ｌｇ ｔ ｉｈ 膜盒 中 ｌ 分钟 病 灶显 现 为分散 的深 ０ 色 斑 点 ， 果 显 示 为 病 毒剂 量 依 赖 型 。 于 致 结 对
细 胞 病 变 ＨＡＶ， 斑 计 数 与 ＬＩ Ａ 结 果 相 空 Ｆ 似 ， 空斑 比病 灶 更 小 更 难 以 识 别 。 每 三个 但 在 平 板 中 检 测 到 ２ 个 空 斑 ， 均 直 径 为 ５ 平 ５７ ｍ｝ 每 三个膜 中 检测 到 ２ ．ｒ 在 ａ ５个 病 灶 ， 平 均 直 径 为 ８８ ．ｍｍ。 ＲＶ 在 Ｆ Ｋ一 Ｒｈ ４和 ＭＡ一 １４细 胞 中 均 未 产 生 空 斑 ， ＬＩ Ａ 却 能 定 ０ 而 Ｆ 量 检 出病 毒 感 染 灶 。由此 可 见 ， Ｉ Ａ 在 确 定 ＬＦ 和 计 数 小 的 感 染 灶 方 面 比空 斑 分 析 更 灵 敏
０ ５ 检 测乙 型 脑炎 病毒 中和抗体 的 简 化试 ２ 验 ［ ］ ＴｉｇＳ 英 ／ ｒ ＨＬ… ∥ ＪＶｉ ｌＭｅｈ ￣ ｒ ｔ— ｏ
ｏ ｓ ２ ０ ， ３（ － ） 一 ３ ４ ｄ ． ０ １ ９ １２ ．４ ～ ７
在 亚 洲 乙 型 脑 炎 （Ｅ） 毒 是 病 毒 性 脑 Ｊ 病 炎 的 常 见 原 因 ， 计 每 年 有 ４ ０ ０例 病 倒 ， 估 ５０ 并 且发病率 和病死率较 高 。 由 于 登 革 热 也 在 Ｊ 流 行 区 流 行 ， 此 Ｅ 因 为 了 与 登 革 热 区 分 ， 有 Ｊ 阳 性 血 清 必 须 所 Ｅ 检测 Ｊ Ｅ特 异 性 中和 抗 体 才 能 确 诊 。蚀 斑 减 少 中 和 试 验 （ ＲＮＴ） 定 量 检 测 Ｊ 中 和 抗 Ｐ 是 Ｅ 体 的 金 标 准 。 而 该 方 法 需 在 ６孔 或 ２ 然 ４孔 板 上进 行 ， 时 ｌ周 ， 样 就 限 制 了其 在大 规 模 需 这 筛 选 ， 其 是 在 疫 苗 效 力 研 究 和 血 清 流 行 病 尤 学调 查 中的 应 用 。 因此 ， 目前 已 建立 了 几 种 改 进 的 定量 检 测 Ｊ 中和 抗 体 的 方 法 。 Ｅ 微 灶减 少 中和试 验 和 荧光灶 抑制 试 验 ， 应 用 过 氧 物 酶 结 合 抗 体 、 色 技 术 和 荧 光 显 染
乙脑病毒RT—PCR检测方法的建立及应用
第八届中国北方实验动物科技年会论文集
１．１．２质粒
含乙脑病毒衣壳蛋白ｆ基因的重组质粒ｐＴ—ＪＥＷ３１５由本实验室构建保存。
１．１．３主要试剂 乙脑病毒Ｎａｋａｙａｍａ、乙脑病毒ＳＡｌ４一１４—２、脑脊髓炎病毒（ＧＤＶＩＩ）、小鼠
脑心肌炎病毒（ＥＭＣ）、小鼠淋巴脉络丛脑膜炎病毒（ＬｃＭ）、ＢＨＫ一２１细胞由本实 验室保存。Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ—Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ、ＭｇＣｌ２、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ购自美国Ｐｒｏｇｅｍａ 公司。ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ、ＴａＫａＲａ ＥＸ Ｔａｑ、Ａｇａｒｏｓｅ、ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒ，购自宝 生物工程（大连）有限公司。３个不同批次的乙脑病毒ＥＬＩＳＡ抗体检测试剂盒分别 购自北京索奥生物技术有限公司和深圳绿诗源生物技术有限公司。 １．２方法 １．２．１引物设计及合成
以乙脑病毒农壳蛋白ｆ基因佧为靶基因，建立乙脑病毒ＲＴ ＰＣＲ检测方法。 对乙脑病毒Ｎａｋａｙａｍａ、乙脑病毒ＳＡｌ４—１４ ２、脑脊髓炎病毒、小鼠脑心肌炎病 毒、小鼠淋巴脉络丛脑膜炎病毒抽提的ＲＮＡ进行逆转录ＰＣＲ扩增。结果ｔ乙脑病 毒Ｎａｋａｙａｍａ、己脑病毒ＳＡｌ４ １４—２均能扩增出农壳蛋白ｆ基因３１５ ｂｐ特异性 条带，而脯脊髓炎病毒、小鼠腑心肌炎病毒、小鼠淋巴脉络从脑膜炎病毒均未扩
乙脑病毒在分类上属于黄病毒科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）黄病毒属（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ） 成员，基因组为单股正链ＲＮＡ，全长约１１ ｋｂ，只有１个开放读码框，其编码是由３ 个４３２个氨基酸组成的多聚蛋白前体，该多聚蛋白前体在宿主细胞内，在病毒自 身编码的蛋白酶（ＮＳ３）及胞内其它酶类作用下，形成３个结构蛋白（Ｃ、ｐｒｅ Ｍ／ Ｍ、Ｅ）和７个非结构蛋白（ＮＳｌ、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５），其中ｆ 基因编码衣壳／核心蛋白（ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）。Ｃ蛋白的作用是在合成部位由Ｃ端疏 水性氨基酸将其暂时固定在宿主细胞的粗面内质网膜上，以便装配成核衣壳包裹 基因组，保护基因组免受核酸酶或其他因素的破坏∞１１。
流行季节前后流行性乙型脑炎病毒中和抗体及隐性感染和显性感染比值分析
流行季节前后流行性乙型脑炎病毒中和抗体及隐性感染和显性感染比值分析目的探讨流行季节前后流行性乙型脑炎病毒中和抗体及隐性感染与显性感染比值。
方法结合以往乙脑发病率对发病高、低的不同地区A、B予以整群抽样，使用微量中和试验检测乙脑病毒中和抗体。
结果A区乙脑抗体病毒中和阳性率流行季节前后分别为83.3%与84.6%，对比差异不明显（P>0.05）;GMT分别为1：27.5与1：35.9，对比差异显著（P＜0.05）。
B区则分别为26.7%与24.1%，对比差异不明显（P>0.05），GMT分别为1：3.1与1：3.2，对比差异不明显（P>0.05）。
A区小年龄组乙脑隐性感染率与发病率趋势具有一致性，高年龄组则分离。
B区为小年龄组一致，高年龄组分离。
A、B区II/AI比值分别为为115111与5944。
结论自然感染可影响人群乙脑抗体水平，且随着抗体水平的提升比值会逐渐提升，说明人体抗体水平对于显性感染与隐性感染的比值具有重要影响。
标签：流行季节;流行性乙型脑炎病毒;中和抗体;隐性感染;显性感染流行性乙型脑炎（乙脑）是一种急性中枢神经系统传染病，主要由乙脑病毒引发，可发病于人或者牲畜。
当前我国乙脑疫苗逐渐普及，乙脑发生率下降明显。
但是据调查，我国每年乙脑发病数量仍在数千左右[1]。
健康人群乙脑免疫水平主要为自然感染与免疫接种。
为对人体抗体水平产生影响的因素予以分析研究，并对目前抗体水平下经过乙脑流行季节后隐性感染/显性感染比值予以了解，同时观察有何影响因素，在流行季节前后抽群健康人群检测分析其乙脑病毒中和抗体，现将详细情况报告如下。
1 对象与方法1.1 一般对象随机抽取本市2个地区A、B，A属于乙脑高发区，B则为低发区，分为小年龄组（16岁以下）与大年龄组（46岁以上）。
对于近30d未接受过乙脑疫苗接种与从未感染过乙脑的对象在第一、二次采血期间不给予乙脑疫苗接种，在其配合调查的基础上开展调查与采血。
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检测乙型脑炎病毒中和抗体的简化试验摘要：在亚洲，乙型脑炎病毒是病毒性脑炎的常见病因，据统计，每年大约有45000例病例。
它导致显着的发病率和死亡率。
乙型脑炎病毒主要通过库蚊在鸟类和动物之间传播，而人类被认为是其终末宿主。
由于登革热在乙型脑炎流行地区也很普遍，因此必须通过检测乙型脑炎病毒特异性中和抗体来证实乙型脑炎阳性血清。
噬斑减少中和试验是检测以及量化乙型脑炎病毒中和抗体的黄金标准。
然而，噬斑减少中和试验大约需要一个星期，并且在在6个或24孔板中进行，这对于大规模筛选具有局限性。
因此有必要开发一种可用于检测和定量乙型脑炎病毒中和抗体的简化方案。
该法在96孔板中进行，将适合用于大规模筛查人群的免疫水平以及疫苗的免疫效力研究。
关键词：乙型脑炎病毒；中和抗体；酶联免疫引言在亚洲，主要由节肢动物传播的乙型脑炎病毒是病毒性脑炎的常见病原。
据统计，每年大约有45000个病例，死亡率为25%;并且有高达50％的患者留有神经系统后遗症（世界卫生组织，1996年）。
乙型脑炎病毒为RNA正链病毒，属于黄病毒科。
病毒发生表现有地方性周期性特点，库蚊和猪为其主要的宿主，病毒在其体内大量复制。
然而，人类被认为是其终末宿主。
（Sabchareon和Yoksan，1998）在亚洲许多地方乙型脑炎病毒都有流行，往往在这些地方都伴随有登革热病毒流行。
因此，为了与登革热区分，就必须通过检测乙型脑炎病毒特异性中和抗体来证实其确为乙型脑炎病毒阳性血清。
此外，检测中和抗体也可作为检测乙型脑炎疫苗效力的合理的替代措施。
（Markofff L.，2000）。
“斑减少中和试验是检测和量化乙型脑炎病毒中和抗体的标准方法（Shyu等.1997）。
然而，斑减少中和试验需要一周才能完成并且仅在6或24孔板中进行，从而对于大规模的筛选表现出一定的局限性，在疫苗的效力学研究以及血清流行病学调查方面其局限性表现得更加突出。
结果通过肉眼计数斑块的数量来获得，而这，也有一定的主观偏差。
一种简便有效的检测和测定与病毒或疫苗反应后的中和抗体含量的方法显得尤为重要。
已经研究出了几种方法来改善蚀斑减少中和试验。
在微焦点减少中和试验（Jirakanjanakit等，1997）和荧光灶抑制试验（Thacker等，1978），聚焦灶可分别通过过氧化物酶以及抗过氧化物酶荧光染色技术看到。
然而，与噬斑减少中和试验相似，聚焦灶也必须人工计数。
另一组通过竞争ELISA来检测乙型脑炎病毒的特异性抗体（Chow等，1997）。
该法用三种单克隆抗体与测试血清竞争性结合包被在微滴度板上的乙型脑炎抗原。
此法虽然能够区分登革热抗体与日本脑炎病毒中和抗体，但不能检测所有类型的乙型脑炎病毒中和抗体。
为了解决上述缺点，经过多次改进研究出了一种简捷的方法，中和酶联免疫法，这种方法在其他病毒如麻疹（Lee等，1999）的检测中已经得到了应用。
方案如下：Vero细胞购自美国模式培养物保藏中心（ATCC编号：CRL-1586，Vero细胞-1008）。
乙型脑炎病毒（中山株）由陈佑昌教授提供。
（新加坡国立大学）。
细胞培养在199培养基（Gibco公司），加入0.042％的钠碳酸氢钠（Merck）和2mM HEPES（Gibco公司）并添加8％胎牛血清（Hyclone公司）。
维持液由1X的199培养基，0.028％碳酸氢钠和2mM HEPES并添加2％胎牛血清（FCS）配置成。
所用的血清在新加坡一个离岸的岛屿上从26头野生的猪体内取样获得。
本次试验进行了重复。
试验方案1.噬斑减少中和试验：次试验在24孔板中进行（Falcon）。
大约60μL热灭活的血清通过倍比稀释，从1:40到1:1280。
然后与60μL病毒液混匀（每孔为30-50 PFU）并在37°C孵育1小时。
然后取100 ml混匀后的液体加到融合有Vero细胞单层的24孔板中，在此之前用1 ml1X 的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗培养有Vero细胞的培养基一次，控制pH值为7.2。
设置的对照组包括：板孔中仅加入病毒（无血清）和板孔中仅加入细胞（无病毒或血清）。
然后把血清病毒混合液与细胞一起在37℃孵育1 h。
吸收步骤后，吸出混合液。
然后，1毫升1％的羧纤维素覆盖培养基在每个板孔中加入2％的FCS。
反应板置于37℃，5％CO2中孵育6天。
然后用1％的甲醛固定并用1％的龙胆紫染色。
经计算减少了70%。
2.酶联免疫法：确定病毒加入和孵化的时间。
要确定病毒加入和孵化的时间，将三个96培养板（Falcon）做如下准备：25μL经过倍比稀释的毒液与25μL维持液混匀后放在摇床上在37°C环境中孵育60分钟。
再添加50μLVero细胞悬液直至每个板孔中大约20000个细胞（细胞计数）。
培养板在37℃，5％CO2的环境下孵育2,3以及4天。
孵育后，弃掉培养液，培养板中加入100μL冷冻的80％的丙酮放在4°C冰箱中10分钟。
固定后，弃掉丙酮，烘干培养板，存放于20°C，直到使用。
在进行间接酶联免疫试验前，培养板放在室内直至室温，并用PBS/T冲洗一次（1×PBS与0.05％的Tween20）。
然后在每个板孔中加入100μL的鼠抗黄病毒的单克隆抗体（用PBS稀释为1:20）并在37℃摇床下孵育1小时。
单克隆抗体从Henchal （Henchal等，1982）培育的杂交瘤细胞ATCCHB-112中获得。
然后用PBS/T冲洗3次，加入100μL用1X PBS 1:5000稀释的过氧化物酶标记的驴抗鼠单克隆抗体（Chemicon公司）。
在37℃摇床上孵育1小时。
然后再冲洗三次，加入100μL二胺底物（Sigma公司），置于黑暗环境，室温下孵育15分钟。
加入50μL1N硫酸使反应终止。
读取其在490 nm处的吸光值。
阴性对照中，只加入细胞（不添加病毒）。
3.中和酶免疫法：约25μL倍比稀释的血清与25μL病毒液混匀（浓度与2中相同）后置于摇床中于37°C孵育1小时。
然后在每个板孔中加入50μL细胞液（每个板孔中约加入20 000个细胞）。
阴性对照仅加入细胞;阳性对照每个板孔中加入50μL病毒（增加的PFU）不加入血清。
培养板置于37℃，5％的二氧化碳中一段时间（与2中间接酶联免疫法描述的相同）。
然后，70％的终点减少计算公式如下：其中OD血清为样品孔的吸光值;OD细胞为细胞对照的吸光值（仅为细胞）；OD病毒为病毒对照的吸光值（细胞和病毒）的吸光值。
吸光值变化（490nm）和乙型脑炎病毒（PFU/孔）图表1：不同乙型脑炎病毒（Nakayama）量在490nm处的吸光度。
在孵育3天的时候，板孔中的病毒量（PFU/孔）与吸光值成线性关系。
阴性对照组（仅加入细胞）的平均吸光度小于0.13（Ting等）。
表1为：病毒在第2，3和4天中吸光值的变化。
只加入了细胞的阴性对照在试验中孵育的几天中吸光值均小于0.1。
经过2天的孵育，在加入12.5 PFU到2000 PFU不等的板孔中吸光值几乎没有任何变化。
表明长时间的孵育对于病毒蛋白在Vero细胞上的表达是十分必要的。
另一方面，孵育4天后吸光度降低而病毒滴度升高。
这是有可能由于孵育时间过长。
3天的孵育期是最好结果，吸光度读数随着病毒滴度的增加而升高。
结果显示了病毒滴度与吸光值之间的线性关系。
也表明，此法的检测限是每个板孔中添加20 PFU。
这是一个特殊的点，此时吸光度是只加入细胞的阴性对照的两倍。
因为吸光值减少70％被用来作为终点，一个合理的病毒起始浓度为每个板孔中100 PFU从而使吸光值在终点比只加入细胞的对照孔显著增大。
表2：蚀斑减少中和试验与中和免疫试验测定26份野猪血清样本的比较（此散点图通过SPSS生物统计分（R=0.783，R2=0.614，S.E.r=0.185，析软件生成）。
每个发散点代表一个样本。
外线划定为95％的置信区间。
t=6.174，P＜0.0001）（Ting等。
）下一步，进行中和酶联免疫终点和用野猪血清做的蚀斑减少中和试验之间的相关性检验。
结果如图2。
血清滴度用对数表示。
结果表明，用中和酶联免疫试验和蚀斑减少中和试验测得的野猪血清中的中和抗体滴度密切相关。
（R=0.783，R2=0.614，S.E.r=0.185），并且这种关联具有统计学意义（T=6.174，P<0.0001）。
在这个试验中，小鼠抗黄病毒单克隆抗体是检测乙型脑炎病毒抗原的一个主要抗体。
另外，乙型脑炎特异性单克隆抗体也可以作为检测乙型脑炎病毒抗原的抗体来使用。
然而，我们用登革热2型病毒和登革热2型特异性单克隆抗体进行的基础性研究表明，较少的特异性的抗黄病毒单克隆抗体可导致病毒感染的细胞和对照（仅有细胞）之间的吸光度值出现较大的差异。
因此，使用抗黄病毒的单克隆抗体的检测限较低。
进一步讲，此法可以很容易地进行改进，以检测其他黄病毒的中和抗体，如登革热和西尼罗河病毒。
蚀斑减少中和试验与中和免疫试验的比较（Ting等）与蚀斑减少中和试验相比，用中和免疫试验测定中和抗体耗时减少了一半。
蚀斑减少中和试验滴度的测定通过肉眼计数蚀斑，可能会有观察者的主观偏差。
中和免疫测定，利用分光光度计读取结果。
此外，该法进行了在96孔板中，从而在检测大量调查样本时更加经济、劳力密集程度更低。
因此，在大规模的疫苗效力检验、血清流行病学检测以及对乙型脑炎病毒中和抗体的定量等方面，中和免疫试验比蚀斑减少中和试验更加优异。
作为检测标准的蚀斑减少中和试验技术上有较高要求，并且并不适合于大规模的血清流行病调查研究。
而中和免疫试验突破了这些限制，是一种更加优秀的检测方案。