病毒中和试验测定法
中和试验方法操作规程
中和试验方法操作规程1.目的：建立中合实验法，统一操作标准，确保产品质量。
2.适用范围：公司生物制品效价测定的中合实验。
3.责任：质检人员有按此程序进行操作的责任，质量管理部经理有检查监督的责任。
4.程序：4.1：实验前准备①、9-10日龄的SPF鸡胚、病毒。
②、样品稀释管、病毒稀释管、打孔器、镊子、5ml吸头、1ml、200ul吸头各一盒、废弃物缸、烧杯，以上物品均需灭菌处理③、照蛋器、电炉、旋涡混合器、5ml微量移液器、1ml微量移液器、200ul微量移液器、记号笔、酒精棉球、碘棉、打火机、蜡、玻璃棒、无菌手套④、实验开始前记得要使房间温度达到30摄氏度左右，房间要紫外照射30min，生物安全柜紫外照射30min准备要用的检测用品同步放在生物安全柜里紫外照射。
4.2：稀释①、将样品用生理盐水2倍系列稀释，使之成1:2;1:4;1:8;1:1;,1:32;1:64;1:128;1:256；1:512；1:1024......。
②、病毒的稀释：将病毒稀释成每单位剂量含200ELD50.。
例如：病毒ELD50=10-8.375/0.1ml,将病毒稀释成每单位剂量含200ELD50的稀释倍数=108.375/200=1.2*106。
即将病毒稀释 1.2*106倍即为200ELD50/0.1ml。
③、准备七根试管（或EP管），编号1-7，在1号管中加入0.2ml 灭菌生理盐水，2-7号管中各加入9ml 灭菌生理盐水.再将ELD50=108.375/0.1ml 的病毒取1ml加入1号管中震荡混匀，再从1号管中取1ml加入2号管中震荡混匀,依次10倍系列稀释至第7管。
(依据最后接种量和接种鸡胚数计算出中和抗体用病毒的量,7号管可以多稀释几支备用。
)4.3：中和:将稀释成每单位剂量含200 ELD50的病毒与等量的2倍系列稀释的待检样品混合,37度中和1小时,准备接种鸡胚。
4.4：在中和的一个小时里准备工作:①、照蛋,弃掉发育不好的和活力不强的鸡胚,②、在血管较少的部位画出气室,③、然后消毒鸡胚(先用碘棉酒毒再用酒精格脱碘),④、随机分组,、编号:一个样品稀释度为一组,每个稀释度3~6枚鸡胚,进行编号。
中和抗体测定
——中和抗体测定
目的
➢评价人群中抗脊灰病毒的免疫状态。 ➢评价OPV的有效性和免疫效果。
适用范围
➢人群脊髓灰质炎中和抗体效价的测定。 ➢免疫成功率的监测。
病毒分离技术（四）
——中和抗体测定
必备材料
必备材料
➢ 待检血清（灭活处理） ➢ 96孔微量板
➢ 稀释液（MM）
➢ 细胞悬液5～10×104/ml
血清5
Ⅰ型板
血清2
血清3
○○○○
○○○○
◎○◎○
◎○◎○
◎○◎○
◎○◎○
○○○○
○○○○
◎○◎○◎○◎○Fra bibliotek◎○◎○
◎○◎○
血清6
血清7
血清4 ○○ ○○ ◎○ ◎○ ◎○ ◎○ ○○ ○○ ◎○ ◎○ ◎○ ◎○
血清8
病毒分离技术（四）
——中和抗体测定
待检血清稀释方法示例：
稀释度
1：4 1：16 1：64 1：256
❖每个对照设两孔，血清、抗原的量各为0.025ml/孔， 补加稀释液0.025ml/孔，细胞对照孔的稀释液应为 0.05ml，然后全部加细胞悬液0.1ml/孔，密封后放 34.5℃培养5～7天。
病毒分离技术（四）
——中和抗体测定
结果判定
当100CCID50的抗原对照出现完全病变时，判定 最终结果
当最高稀释度的血清病毒混合液接种的2孔细胞中 有1孔不出现CPE，该稀释度的倒数即为该血清标 本的中和抗体滴度。
➢1.5～2.5的反对数： 31.62～316.2（32～320 CCID50/0.025ml ）
题外话
感谢大家多年来对免 疫预防工作的支持
中和试验
第十三章 中和试验（neutralization test）学习要点：毒价滴定； 终点法中和试验； 空斑减少试验。
病毒或毒素与相应的抗体结合，抗体中和了病毒或毒素，失去了对易感动物的致病力，这种试验称为中和试验。
一、简单定性中和试验——毒价滴定主要用于鉴定病料中病毒及病毒的类型，亦可用于毒素的鉴定。
试验方法：根据病毒的易感性选定试验动物（鸡胚或细胞）及接种途径。
将动物分为对照组与实验组。
试验组：取待检病料磨碎，加生理盐水稀释，加双抗，在冰箱中作用1h或经过滤器过滤，与已知的抗血清等量混合，置于37℃中作用1h后接种动物。
对照组则用正常血清加入稀释病料，作用后，接种另一种动物。
对照组动物发病死亡，而试验组动物不死，即证实病料中含有与已知抗血清相应的病毒。
二、终点法中和试验1、固定血清稀释病毒法将病毒用2倍递增稀释，分置二列试管：第一列加入正常血清（对照组）；第二列加入待检血清（试验组）。
二列试管分别振荡均匀，置370C中作用1h，将各管混合液分别接种试管动物，每管用3-5只动物。
接种后观察数目，并记录死亡数。
观察结束后，计算起LD50及中和指数。
2、固定病毒稀释血清法本法用以测定抗病毒的血清中和效价。
将待检血清稀释，加等量已知毒价的病毒液，在试管内中和湖接种动物，观察动物发病及死亡情况，计算其只能中和效价。
三、空斑减少试验在细胞培养时作中和试验可采用空斑减少法。
一种能使细胞致病变的病毒，在细胞培养上生长后，因其致病变作用使细胞单层脱落，pH与无病变地方也不一样，该处与周围明显不同的、一个局限性的变性细胞区称为空斑。
一个空斑可以当作一个病毒生长的集落，一个单位内空斑数多，病毒就多，故可测出病毒空斑形成单位。
这样，加抗血清与不加抗血清的病毒空斑形成单位之差，就称为空斑减少试验。
使空斑减少50%的血清西式度，就是该血清的中和价。
复习思考题：1、滴定毒价的常用单位？2、什么是中和价和中和指数？。
血清-病毒中和试验的标准操作规程
血清-病毒中和试验的标准操作规程（编号：034）
1、目的及使用范围
该SOP以PRRSV为例，测定血清中的病毒中和抗体滴度。
2、主要仪器及试剂
CO2细胞培养箱、普通光学显微镜、超净工作台（生物安全级别）、电动吸引器、移液器、水浴锅、DMEM培养基、胎牛血清、96孔细胞培养板
3、相关器皿的预处理
玻璃制品要高压灭菌
4、操作步骤
4.1按常规细胞培养方法培养Marc-145细胞
4.2胰酶消化Marc-145细胞，均分与96孔板中，100μL/孔，并保证细胞数为（2～8）×105/孔；CO2细胞培养箱培养16～24h；
4.3抗血清56℃水浴锅灭活30min，与含100 TCID50 PRRSV的DMEM（2%FBS）2倍倍比稀释，混匀后，37℃孵育1h；
4.4弃除96孔板中细胞培养基，加入血清-病毒混合物100μL/孔，置于CO2细胞培养箱中，吸附1h；
4.5弃除上清，用无菌PBS洗2次，吸干各孔中的残留液后，加入含2%FBS的DMEM，置于CO2细胞培养箱培养3～5d；
4.6第4天，于光学显微镜下观察细胞病变CPE，记录病变孔数目；
4.7计算中和抗体滴度，按照运用Reed-Muench法计算。
5、问题向导
5.1细胞病变不明显
根据细胞状态或病毒种类的不同，细胞病变时间会相应发生改变，一般而言，第3天就会出现CPE，第4天就可以计算其中和抗体滴度。
5.2 Reed-Muench法计算中和抗体滴度范例，见表1。
68。
中和实验方法
RSV特异性中和抗体滴度检测一、实验原理：抗体与相应的病毒粒子特异地结合，使后者失去对易感动物或细胞的致病力。
（该试验方法以测定抗病毒血清的中和价，将待检血清2倍递增稀释，加等量已知毒价的病毒液。
）二、实验分类：1. 固定血清--稀释病毒中和试验2. 固定病毒—稀释血清中和试验3. 简单定性中和试验4. 空斑减少法三、实验步骤：1.提前设定56 ℃水浴锅，将分装好的待测血清于56 ℃灭活（降低补体对实验结果的影响）30min 。
2.将加过双抗的培养基DMEM/F-12（用于Hep-2细胞；Vero细胞常用DMEM培养基）和BI血清进行37℃预热30min，与此同时灭好实验台（该准备3599细胞培养板灭过菌枪头以及15ml和50ml摇菌管）为后续实验做准备。
3.实验台灭菌30min，灭好台子后进行实验，首先取1.5mlEP管，用DMEM/F-12培养基8倍稀释待测血清（每管中加培养基210µl，再加相应的血清30µl），拆开96孔培养板后在盖子进行设计（实验设计参考图1），最后向每孔中加入75µl的培养基，按照实验设计加入相应的稀释血清75µl，用排枪以两倍梯度稀释血清。
（注意：最终到256倍时吸出的多余的75µl血清并弃掉。
）4.实验孔以及阳性对照孔分别每孔加入25 µl（注意：加毒时应从血清低浓度到高浓度）的104 TCID50病毒混匀，4℃孵育2 h。
5.在实验剩余半小时左右进行消化细胞，镜检细胞汇合度为90%左右即可用，弃掉培养液后，用2-3 ml无血清培养吹洗几遍细胞（意图为去除死细胞或活性不好的细胞），加入2 ml 胰酶后开始计时，将细胞培养板置于37℃的CO2无菌培养箱培养消化2-3min，在镜检细胞间有间隙或细胞收缩为单个状态为好，加入等体积的无血清培养基终止，小心吸掉液体，加入有血清的培养基2-3ml轻轻地吹下皿底部的细胞，轻微用枪吹吸几次使其成为均匀的单细胞悬液后转移到新的15ml离心管中等待细胞计数。
中和试验步骤
中和试验步骤1、测定病毒TCID100µl50/2、制备细胞悬液，使细胞浓度约为1×105个/mL，加到96孔细胞培养板中，每孔100µl。
置37℃CO2培养箱中，直至细胞长至单层。
3、血清灭活：将待检测的血清放到56℃水浴30min（此时血清中的病原菌都已被灭活）。
4、100TCID50/50µl病毒液或者200TCID50/25µl病毒液的制备，这两者是等价的。
100TCID50/50µl病毒液制备方法：计算已测定了TCID50/100µl 的病毒原液稀释至100TCID50/50µl的稀释倍数:lg100TCID50/50µl=-log100-log(100/50)=-2.30103得100TCID50/50µl=10-2.30103，假设病毒TCID50/100µl=10-6.3，则稀释倍数=(100TCID50/50µl)÷(TCID50/100µl)=106.3÷102.30103≈9976倍。
5、取一块新的96孔板，1-10列每孔加50µl待检血清原液，再用8道孔排枪加每孔100TCID50/50µl病毒液50µl，稍微吹打使血清与病毒液混均。
11列先每孔加50µl维持液，再于11列的第一孔加50µl 标准阳性血清，将标准阳性血清往下作1:2、1:22至1:28倍稀释。
12列第1孔加标准阴性血清原液50µl，再加100TCID50/50µl病毒液50µl。
用维持液将100TCID50/50µl的病毒液作4次连续10倍稀释，稀释成10TCID50/50µl、1TCID50/50µl、0.1TCID50/50µl,依次加到第12列的3到6孔，每孔加50µl，再每孔加50µl维持液。
中和抗体的效价测定方法
中和抗体的效价测定方法引言：中和抗体是一种特殊的抗体，它能够与病原体结合并中和其活性，从而起到抵抗感染的作用。
中和抗体的效价测定是评估中和抗体活性的重要方法，对于疫苗研发、抗体治疗和免疫学研究具有重要意义。
本文将介绍常用的中和抗体效价测定方法。
一、细胞中和法细胞中和法是一种常用且准确的中和抗体效价测定方法。
其基本原理是将病原体与中和抗体共同作用于易感细胞，通过观察细胞的病变情况来评估中和抗体的效价。
具体步骤如下：1. 培养易感细胞：选择适合的易感细胞株，如Vero细胞，并进行培养。
2. 制备病原体：根据需求选择合适的病原体，如病毒或细菌，并进行培养和病毒滴度检测。
3. 中和抗体的稀释：将中和抗体按照一系列稀释倍数制备成不同浓度。
4. 细胞感染：将培养好的易感细胞接种至孔板中，并加入一定量的病原体。
5. 中和实验：将不同浓度的中和抗体与细胞感染体系共同处理，包括对照组和实验组。
6. 观察细胞病变：在一定时间后，观察细胞的病变情况，如细胞形态、细胞存活率等。
7. 计算效价：通过比较对照组和实验组的细胞病变情况，计算中和抗体的效价。
二、中和试验中和试验是另一种常用的中和抗体效价测定方法，其基本原理是将病原体与中和抗体共同作用于体外体系，通过观察病原体活性的变化来评估中和抗体的效价。
具体步骤如下：1. 制备病原体：根据需求选择合适的病原体，如病毒或细菌，并进行培养和病毒滴度检测。
2. 中和抗体的稀释：将中和抗体按照一系列稀释倍数制备成不同浓度。
3. 中和实验：将不同浓度的中和抗体与病原体共同处理，包括对照组和实验组。
4. 检测病原体活性：通过合适的方法检测病原体的活性变化，如病毒滴度测定、细菌生长抑制等。
5. 计算效价：通过比较对照组和实验组的病原体活性变化，计算中和抗体的效价。
三、血清中和效价血清中和效价是一种常用的中和抗体效价测定方法，其基本原理是将病原体与中和抗体共同作用于动物体内，通过观察动物体内病原体感染情况来评估中和抗体的效价。
中和抗体的检测方法和原理
中和抗体的检测方法和原理
中和抗体是指能够中和病毒、细菌等病原体的抗体，其检测方法主要有以下几种：
1. 中和试验法：将待检样品与病原体混合，再加入一定量的中和抗体，观察病原体能否被中和。
如果病原体被中和，则样品中存在中和抗体。
2. 细胞中和法：将待检样品与病原体混合，再加入一定量的细胞，观察细胞是否能够阻止病原体侵入。
如果细胞阻止了病原体侵入，则样品中存在中和抗体。
3. 酶联免疫吸附法：利用病原体表面的抗原与中和抗体的结合来检测中和抗体的存在。
将待检样品加入到含有病原体抗原的酶标板中，加入一定量的中和抗体，观察是否有光学信号产生。
如果有光学信号产生，则样品中存在中和抗体。
中和抗体的原理主要是通过结合病原体表面的抗原阻止其侵入
细胞或者中和病原体的活性，从而起到保护作用。
检测中和抗体的方法可以用于疾病诊断、疫苗研制等领域。
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病毒中和试验测定法
1.固定病毒稀释血清法(α法) 本法用于抗血清的中和价。
试验需先滴定病毒
毒价，试验时将其稀释成每一单位剂量含200个TCID
50
，再将待检血清倍比稀释
加等量200个TCID
50
/ml的病毒液，混匀后37℃1h，每一稀释度接种24孔细胞
培养板4孔，每孔。
5%C0
2
培养箱培养一定时间后，记录出现CPE孔数，以不出现CPE数和接种数的比为中和比值。
按Karber法计算中和价。
其公式如下：
Log TCID
50
=L+d（）
（TCID50用对数计算，L为病毒最低稀释度的对数。
d为组距，即稀释系数，在10倍系列稀释则为-1，S为各组CPE与接种数比值之和）
50%中和试验举例
每一接种剂量含病毒 100TCID50或 100LD50或100EID50或100ID50
L=-1，d=，S=4/4+4/4+4/4+4/4+2/4=
代入Karber公式：LogND
50= -1－* 该抗血清ND
50
(半数中和单位)为，即1/160，
则其中和价为160 ND
50
/ml，可以简写成160。
2.固定血清稀释病毒法(β法) 本法用于测定抗血清的中和指数。
将病毒原液10倍系列稀释，分列于2排无菌管，第一排加等量正常血清（对照组）；第二排加待检血清（中和组），混匀后，置37℃1h，分别接种细胞板孔（或鸡胚、实验
动物）进行培养，记录CPE（鸡胚、动物死亡数），计算TCID
50（或LD
50
），按下
式计算中和指数。
中和组TCID
50（或LD
50
）
中和指数= ————————————
对照组TCID
50（或LD
50
）
查反对数，即得该待检血清的中和指数。
通常中和指数>50者判为阳性，
10-49为可疑，<10者为阴性。
例如：
对照组滴度的LD
=
50
=
中和组滴度的LD
50
中和指数=10 中和指数的对数Log=Log100=
一般来说，以10倍稀释进行滴度测定，Log10=1。
因此小于10（1<Log）则认为中和指数无意义，10-50之间的值（）则为可疑，超过50((Log>则是有意义的.。