溶菌酶提取
蛋清溶菌酶提取实验报告
一、实验目的1. 了解溶菌酶的生物学特性及其在食品、医药等领域的应用价值。
2. 掌握从鸡蛋清中提取溶菌酶的方法和操作步骤。
3. 学习蛋白质分离纯化的基本原理和实验技术。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种能够水解细菌细胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键的碱性酶。
它主要存在于鸟类和家禽的蛋清中，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
本实验采用盐析法从鸡蛋清中提取溶菌酶，通过改变溶液的离子强度，使溶菌酶从溶液中析出。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜鸡蛋、去离子水、硫酸铵、盐酸、pH试纸、玻璃棒、滤纸、烧杯、漏斗、电子天平、移液管、离心机、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。
2. 实验试剂：硫酸铵、盐酸、去离子水等。
四、实验步骤1. 鸡蛋清制备：将4-5个新鲜鸡蛋打破，分离出鸡蛋清，加入两倍体积的去离子水，搅拌拌匀，过滤杂质。
2. 盐析：向鸡蛋清溶液中加入适量硫酸铵，搅拌溶解，使硫酸铵浓度达到60%左右。
将溶液静置一段时间，使溶菌酶析出。
3. 沉淀分离：用滤纸过滤析出的沉淀，收集滤液。
4. 洗涤：向沉淀中加入少量去离子水，搅拌洗涤，去除杂质。
重复洗涤2-3次。
5. 离心：将洗涤后的沉淀转移到离心管中，以3000r/min离心10分钟，收集上清液。
6. 蛋白质浓度测定：采用紫外可见分光光度计测定上清液中蛋白质浓度。
7. 溶菌酶活性测定：采用溶菌酶活力测定试剂盒测定溶菌酶活性。
五、实验结果与分析1. 蛋白质浓度测定：上清液中蛋白质浓度为1.5mg/mL。
2. 溶菌酶活性测定：溶菌酶活性为200U/mL。
根据实验结果，从鸡蛋清中提取的溶菌酶蛋白质浓度为1.5mg/mL，活性为200U/mL，说明本实验提取的溶菌酶纯度和活性较高。
六、实验讨论1. 盐析法是一种简单、有效的蛋白质分离纯化方法，适用于溶菌酶的提取。
2. 在实验过程中，要注意控制硫酸铵的加入量，以免影响溶菌酶的活性。
高中生物溶菌酶知识点总结大全
高中生物溶菌酶知识点总结大全溶菌酶是一种在生物体中广泛存在的酶类，它在高中生物课程中占有重要地位，因为其在生物防御机制中的作用以及在科学研究中的应用。
本文将对溶菌酶的结构、功能、分类、生物学意义以及在工业和医学上的应用进行详细的总结。
一、溶菌酶的结构溶菌酶是一种基本不受糖基化影响的酶，其结构主要由氨基酸序列决定。
人类溶菌酶由130个氨基酸残基组成，具有一个明显的β-折叠结构。
这种结构使得溶菌酶能够紧密地结合到细菌细胞壁的多糖上，从而破坏细胞壁的结构完整性。
二、溶菌酶的功能溶菌酶的主要功能是作为生物体的防御机制，对抗外来细菌的侵袭。
它通过水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4-糖苷键，导致细胞壁破裂，细菌最终溶解死亡。
这种抗菌作用对于人体的免疫系统尤为重要，尤其是在皮肤和黏膜表面，溶菌酶能够帮助抵御病原体的入侵。
三、溶菌酶的分类根据溶菌酶的来源和特性，可以将溶菌酶分为几类：1. 鸡蛋溶菌酶：从鸡蛋清中提取，是最常用的溶菌酶之一。
2. 人类溶菌酶：存在于人的唾液、泪液和其他体液中，对维护人体健康起到重要作用。
3. 植物溶菌酶：在某些植物中也发现有溶菌酶的存在，如菠萝和木瓜。
4. 微生物溶菌酶：由某些微生物产生，用于对抗其他微生物。
四、生物学意义溶菌酶在生物体中具有重要的生物学意义。
首先，它是天然免疫系统的一部分，帮助生物体抵御细菌感染。
其次，溶菌酶还能够调节炎症反应，因为它能够影响免疫细胞的活性。
此外，溶菌酶的存在也能够帮助生物体清除死亡的细胞和细胞碎片，维持组织的健康状态。
五、工业和医学应用溶菌酶在工业和医学领域有着广泛的应用。
在工业上，溶菌酶可用于食品保鲜，防止食品变质和延长保质期。
在医学上，溶菌酶可用于治疗某些细菌感染，尤其是在对抗生素有耐药性的细菌面前，溶菌酶提供了另一种治疗选择。
此外，溶菌酶也被用于化妆品和清洁产品中，利用其抗菌特性来保持产品的卫生和安全性。
六、溶菌酶的提取和纯化溶菌酶的提取通常采用物理和化学方法相结合的方式。
溶菌酶的提取分离和纯化实验报告
溶菌酶的提取分离和纯化实验报告生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定实验报告集班级生工1411学号组别7姓名实验室学生守则一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员的指导。
二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。
三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。
凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。
四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。
未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。
五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和吃东西。
六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管理人员报告。
七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。
预习报告（手写，可自行续页）溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定名称实验目的和要求：实验材料：主要仪器：主要步骤：教师签名：时间：实验报告溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定一、目的对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定二、原理鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。
1、溶菌酶分离纯化原理：（1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白（2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白2、溶菌酶鉴定分析（1）考马斯亮蓝法测蛋白含量（2）分光光度法测定酶活性（3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度三、实验材料与方法1、实验材料与试剂鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等2、实验仪器低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。
溶菌酶的提取工艺路线
溶菌酶的提取工艺路线1前言：1.1溶菌酶性质溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用0白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。
稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96℃，pH值为3条件下，15min后活力保持87%。
抑制剂：有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。
1%水溶液在281.5nm处的吸光系数为26.4。
通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌。
01.2溶菌酶来源该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。
从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。
它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。
可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。
1.2溶菌酶应用1．溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作天然的食品防腐剂。
现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。
2．溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，医用溶菌酶其适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等。
第一节 溶菌酶的提取
第一节溶菌酶的提取一、简介1.Lz的结构及组成溶菌酶(Lysozyme,EC 3.2.1.17)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶解酶（Muramidase），是由英国细菌学家弗莱明(Fleming)在1 92 2年在人的眼泪、唾液中发现的。
溶菌酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪液、唾液、血浆、尿、乳汁、其它体液（如淋液）中及白细胞和组织（如肝、肾）细胞内，而且部分植物、微生物中也含有此酶。
其中人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的3倍。
但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为0.3%-0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的。
人们根据溶菌酶的溶菌特性，将其应用于医疗、食品防腐及生物工程中，特别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有一定的潜在应用价值。
鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。
此酶为白色、无臭结晶粉末,味甜，易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚中。
其分子是由129个氨基酸残基排列构成的单一肽链（见图6-1），有四图5-1 溶菌酶的分子结构对二硫键，分子量为14300。
结晶形状随结晶条件而异，有菱形八面体、正方形六面体及棒状结晶等。
2.Lz的基本性质Lz是一种碱性球蛋白，广泛存在于鸟和家禽的蛋清中。
其酶蛋白性质稳定，热稳定性很高。
（1）Lz的热稳定性Lz在酸性pH下是稳定的，此时100℃的加热对Lz仅有较小的活力损失。
在pH4.5（100℃，3min）、pH5.29（100℃，3min）下加热，Lz是稳定的。
一般认为Lz在酸性条件下稳定，在碱性条件下不稳定。
糖和烯烃类能增加Lz的热稳定性，NaCL对Lz也有抗热变性作用，而且盐溶液的存在对Lz的活力是十分必要的。
在低盐浓度时，Lz的活化和离子强度密切相关，在高盐浓度时对Lz的活力受到抑制，阳离子的价态愈高则抑制作用愈强。
具有—COOH和—SH3OH基的多糖对Lz活力有抑制作用。
鸡蛋提取溶菌酶的方法
鸡蛋提取溶菌酶的方法鸡蛋白是一种丰富的蛋白质源，其中含有溶菌酶（lysosome），可以在细菌和真菌的溶解中发挥重要作用。
溶菌酶是一种具有溶菌、抗菌活性的酶类。
鸡蛋提取溶菌酶的方法主要包括以下几个步骤：1. 鸡蛋的分离：首先将新鲜的鸡蛋进行分离，只保留蛋清（蛋白质）部分，去除蛋黄。
2. 蛋清处理：将蛋清中的蛋白质与溶菌酶分离，可以采用酸碱沉淀法。
将蛋清加入适量的酸（如醋酸）中，使酸度下降到pH 4以下，随后使用碱（如氢氧化钠）中和酸性溶液，使溶液pH回升到中性左右。
这一过程中，溶菌酶会发生沉淀现象，可以方便地分离出来。
3. 溶菌酶的除杂：蛋清中可能还存在其他酶类或蛋白质，为了获得纯净的溶菌酶，可以进行一轮或多轮的洗涤与纯化。
例如，可以使用盐析法，通过逐渐增加溶液中的盐浓度来沉淀溶菌酶，然后用溶液洗涤沉淀物，最后得到纯净的溶菌酶。
4. 溶菌酶的浓缩与干燥：将纯净的溶菌酶溶液通过浓缩技术（如超滤或冷冻干燥）使溶液浓度增大，得到较为浓缩的溶菌酶溶液。
5. 溶菌酶的活性测定：对提取得到的溶菌酶进行活性测定，可以通过测定其对特定底物的溶解能力来评估溶菌酶的活性。
常见的测量方法包括显色法和滴定法等。
鸡蛋提取溶菌酶的方法相对简单，但有一些需要注意的注意事项：1. 鸡蛋的新鲜度对溶菌酶的提取效果有一定影响，新鲜的鸡蛋中溶菌酶的含量较高。
因此，在进行实验时应选择新鲜的鸡蛋。
2. 溶菌酶的活性与条件相关，如温度、酸碱度等。
在提取过程中需要控制好这些条件，以保证溶菌酶的稳定性和活性。
3. 提取得到的溶菌酶需储存于低温（通常-20C）下，否则易失活。
4. 鸡蛋中的蛋白质含量较高，在提取过程中需要留意对蛋白质的处理，避免产生其他影响或污染。
需要特别注意的是，提取溶菌酶并非只有上述方法，还可以根据实际需要结合其他技术和方法进行提取，例如离心、层析、电泳等。
总结起来，鸡蛋提取溶菌酶的方法包括鸡蛋的分离、蛋清处理、溶菌酶的除杂、溶菌酶的浓缩与干燥以及溶菌酶的活性测定等步骤。
溶菌酶的提取纯化及纯度测定
1.1试剂与仪器
1.1.1试剂250mL烧杯、玻璃棒、小漏斗、定性快速滤纸、50mL量筒、50mL离心管、鸡蛋1只、0.02mo1/LPBS（pH7.0、pH8.0、）,l mLEp管, pH计,移液管1m1、冰醋酸、5mo1/L NaOH,滴管,离心管，样品S1、S2、S-2, CM一纤维素高子交换介质., 0.02mo1/LpH8.0的PBS, 0.6mo1/LNaC1,烧杯（50mL, 250mL）、桔草芽胞杆菌过夜培养物（37℃,18h,160r/min,100/250mL）、0.02mo1/L pH8.0的PBS（测活缓 冲液,含50mmo1/LNaC1）, 0.2mo1/LpH8.0的PBS。
【关键词】溶菌酶，等电点沉淀法，离子交换层析，酶活，提纯【引 言】 对溶菌酶的研究始于20世纪初,人们发现人的唾液、眼泪中存在有 溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。1937年Abraham和Robinson从卵蛋白中分离出溶菌酶晶体,揭开了研究溶菌酶的历史篇章。 它广泛 存在于鸟类、家禽的蛋清中和哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁、胎盘以及体 液、组织细胞内,其中在蛋清中含量最丰富(约0.13% )在一些植物体如卷心菜、 萝卜、无花果和微生物体内也存在溶菌酶,只是含量差异较大。
溶菌酶的提取纯化以及纯度鉴定实验者：钟吴宇豪 绿药1501班201530360127同组者：连学帆 韩家鑫 实验地点：东配302实验日期：2017年5月26日-5月27日 报告完成日期：2017年5月28日 指导老师：易 喻
【摘要】溶菌酶是一种具有水解细菌细胞壁能力的蛋白质，工业上通常 以蛋清为原料，在pH6.5条件下用弱酸性阳离子交换树脂732吸附后，再用硫酸铵洗脱，经透析后冷冻干燥得 到，在医学及食品商具有广泛应用。 本文中我们通过等电点沉淀法对溶菌酶进行粗提取， 然 后通过离子交换层析进一步除去杂蛋白， 提纯所得的溶菌酶粗品， 并且通过紫外分光光度计 检测溶液吸光度来对最后的产品进行纯度及产率鉴定， 确认得到了纯化倍数较高但产率较低 的溶菌酶产品。
溶菌酶提取流程
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方法对比讲稿用2.1 结晶法溶菌酶具有耐热、耐酸的特性，并且易溶解在盐溶液，稳定性好，通过改变盐溶液的条件，可使溶菌酶以晶体形式析出而得以分离，结晶法也因此成为制备溶菌酶晶体最为传统的方法之一。
该方法的主要过程可简述如下，向富含溶菌酶的蛋清中加入(NH4)2SO4等中性盐，依据溶菌酶的等电点区，用氢氧化钠调节蛋清溶液的 pH，再加入溶菌酶晶体进行诱导，4℃放置大概 2 周，即可析出大部分的溶菌酶晶体，而与其它杂蛋白质得以分离。
如要得到到更高纯度的溶菌酶，可将析出的溶菌酶晶体过滤，重新溶解，再利用上述同样的方法进行重结晶即可。
结晶法操作简单、成本低，是目前从蛋清中提取分离溶菌酶的首选方法，但它要求溶菌酶的含量要相对高，因此不适宜溶液中微量溶菌酶的分离。
此外，晶体的形成，蛋白质结晶既受到自身分子结构的影响，又受到结晶条件的影响，结晶过程中只要有细微的差别，晶体的产量和质量都将受到很大影响（结晶过程不好控制），所以蛋白质结晶是一个宏观看似简单而实际微观极为复杂的物理化学过程。
为进一步完善结晶法分离纯化溶菌酶，研发人员越来越重视膜结晶法的研究与应用。
相比于常规结晶方法，膜结晶法对蛋白质初始浓度要求低、结晶诱导时间较短、尤其是结晶过程可控，因而具有明显优势。
2.2 离子交换法离子交换法是借助溶液中各种蛋白质等粒子的带电差异，而与离子交换剂之间具有强弱不一的结合力，达到分离纯化物质的操作技术。
依据原料及分离纯化的不同要求，可分别选择羧甲基琼脂糖、羧酸纤维素和羧甲基纤维素等离子交换剂。
离子交换法操作简单，成本较低，可实现自动化连续操作，适用于大规模生产，是目前溶菌酶生产的常用方法。
（联用层析法因分离速度快、处理量大等优势而受到研发人员的广泛关注，包括膜亲和层析法、离子交换层析法等。
尤其是离子交换层析法 20 世纪 80 年代便开始广泛应用于溶菌酶地分离纯化。
此方法操作简便、成本低、高效、可实现自动化操作，是溶菌酶生产中的常用方法之一。
）2.3 色谱法以亲和力为基础，将不溶性的载体与可逆结合的配体相偶联，制备成具有特异亲和性的分离介质，选择性地吸附生物活性物质，依据待分离物质的特性再利用相应组成的溶液洗脱而达到分离提取需要物质的目的，这就是 20 世纪 80 年代末发展起来的亲和色谱技术。
亲和色谱技术是诸多色谱法的一种，选择性高、快速、高效，适合蛋清溶菌酶高效分离与纯化的需要。
随着生产对技术要求的提高，研发人员以传统的膜处理为基础，利用固定离子亲和色谱和膜分离相结合，制备固定金属亲和膜，因其具有良好的分离性能，可用于蛋白质的分离纯化。
多方研究结果表明固定金属亲和膜对溶菌酶的选择吸附性能良好。
如若将间歇式吸附与连续式脱附耦合亲和层析法相结合，用于溶菌酶分离纯化，蛋白质回收率和吸附剂利用率都会有明显提高。
2.4 亲和分离法亲和力为基础，借助物质间的特异性结合力，使目的物质或者杂质与相应的配基结合而达到分离纯化目的物的目的，即亲和分离法，包括亲和沉淀法、亲和膜分离法、亲和过滤法、亲和层析法等。
尤以亲和层析法和亲和沉淀法的应用广泛。
亲和层析法是利用蛋白质和酶的生物学特异性，即蛋白质或酶与其配体之间所具有的专一性亲和力而设计的色谱技术。
而亲和沉淀法既具有相当于亲和层析法的纯化效率，又克服了亲和层析法难以放大的缺点，是蛋白质等生物大分子的新型亲和技术之一。
溶菌酶用途广泛，其分离纯化工艺技术的研究一直是人们关注的热点。
溶菌酶的分离纯化技术多种多样，应依据原料的来源以及产品的要求而选择合适的分离纯化方法，以达到优质高产的效果。
例如，用结晶法生产溶菌酶时容易发生共晶问题；虽然亲和分离技术不存在共晶问题，但只能处理小量原材料，并且各种昂贵的亲和柱介质也会导致较高的生成成本。
而色谱技术因其选择性好、分离速度快、效率高，尤其是过程容易实现自动化控制，因而成为溶菌酶研发技术研究的重点。
尽管如此，单一分离纯化方法存在纯度和回收率低下的缺陷，因而依照一定顺序采用建立连续式的分离体系分离纯化溶菌酶可以满足大规模生产的需求。
例如，研发人员可以充分利用溶菌酶耐温耐酸、稳定性好、溶解性强的特性，将色谱分离法、沉淀法、结晶法等联合使用，定能有效地改进溶菌酶的分离纯化。
另外，鉴于膜分离技术具有操作条件温和且无相变化，基本不会破坏原料中的生物活性物质，因而由亲和层析与膜分离技术结合的亲和超滤等技术都将是溶菌酶分离纯化新型技术，有待进一步发展。
盐析原理高浓度的中性盐溶液中存在着大量的带电荷的盐离子，它们能中和生物分子表面的电荷，使之得以稳定的双电层受损，从而破坏分子外围的水化层；另外，大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，从另一方面压缩了水化层的浓度降低了它的亲水性，从而沉淀析出。
盐析沉淀法不仅是蛋白质初级纯化的常用手段，在某些情况下还可以用于蛋白质的高度纯化，但是利用盐析沉淀得到的目标产物中含盐量较高，一般盐析在沉淀后，需要进行脱盐处理，才能进行后续的分离操作。
与盐析相比，等电点沉淀的优点是无需后续的脱盐操作。
但是，如果沉淀操作的pH值过低，容易引起目标蛋白质的变性。
直接提取法是依据溶菌酶的理化性质，利用溶菌酶和杂蛋白等电点的差异，通过调节 pH 值来沉淀蛋白，达到分离溶菌酶的目的。
超滤法是根据膜孔径的大小，在压力的驱动下将分子大小不一的溶质分离，从而获得目标物。
离子交换原理离子交换剂与溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行，离子交换剂由基质、电荷基团或功能基团和反离子构成。
粗放大概就是不需要多么高深技艺的，增加投资、扩大厂房、增加劳动投入，来增加产量。
集约型也是现在提倡的，在生产规模不变的基础上，采用新技术、新工艺，改进机器设备、加大科技含量的方式来增加产量反胶束法2. 1 溶菌酶的提取鸡蛋清中溶菌酶的等电点11. 1，相对分子质量14 300，质量分数约占鸡蛋清总量的3% ～ 4%。
在鸡蛋清中，溶菌酶与其他蛋白质的等电点差别较大，所以在提取缓冲液pH 9. 0 的条件下，只有包括溶菌酶在内的个别蛋白质带有正性电荷，很容易将其与大量带负性电荷的蛋白质分开。
利用pH 9. 0 的Tris-HCl缓冲液抽提鸡蛋清，通过离心法除去不溶物，获得溶菌酶的粗提液。
小心破碎鸡蛋有气室的一头，使蛋清缓慢流出并收集到一个干净的250 mL 烧杯中，用双层纱布过滤鸡蛋清，收集滤液，每10 mL 滤液中加入pH 9. 0 的Tris-HCl缓冲液20 mL，轻轻摇晃混合均匀，在冰箱冷藏室中静置20 min，转入离心管中，在转速4 000 r·min － 1的条件下离心15 min，得到的上层清澈溶液即为溶菌酶粗提取液。
2. 2 标准曲线制作及粗酶液的含量测定将溶菌酶晶体用0. 1 mol·L － 1 氯化钾溶液( pH 11) 配制成0. 1，0. 2，0. 4，0. 6，0. 8，1. 0g·L － 1 的溶液，以稀释液为空白对照，经全波长扫描可知溶菌酶在280 nm 处有最大吸收峰，确定在该波长测量吸光度A。
以A为纵坐标，溶菌酶质量浓度为横坐标，得回归方程Y = 0. 676 7X + 0. 015 5( r = 0. 982 9) 。
将溶菌酶粗提取液稀释100 倍，测定其在280 nm 处的A 0. 266，根据回归方程计算溶菌酶质量浓度0. 370 g·L － 1。
根据溶菌酶粗提取液中溶菌酶的含量，将溶菌酶粗提取液用不同质量分数KCl 稀释液稀释37 倍，即得1. 0 g·L － 1溶菌酶溶液。
2. 3 溶菌酶的提取将溶菌酶粗提取液与不同配比的反胶束溶液以一定体积比例进行混匀，在旋涡振荡混合器上充分混合5 min，使萃取过程达到平衡，将乳浊液倒入离心管中，于3 000 r·min － 1 离心4 min，取下相液，测定其在280 nm 处的A，根据回归方程计算溶菌酶的含量。
离子交换层析1． 2. 1 蛋白的盐析粗分离取新鲜鸡蛋，用双层灭菌纱布过滤得到水样成分，充分搅拌30 min( 搅拌剧烈程度以不起泡沫为准) 。
为了降低蛋清粘度以利后续实验，取5mL 蛋清用pH 9. 0 的0. 05 mol·L － 1 Tris-HCl缓冲液进行5 倍稀释，4℃下静置至少6 h。
静置稀释后的蛋清溶液在4℃，10 000 r·min － 1离心10 min，上清中加入硫酸铵粉末使饱和度达到50%，磁力搅拌使溶解，4℃静置过夜，于4℃，12 000 r·min － 1 离心10 min。
取上清，加入硫酸铵粉末，使其饱和度达到80%［7］，操作同50%饱和度硫酸铵，所得沉淀用pH 9. 0 的0. 05mol·L － 1 Tris-HCl缓冲液溶解，并于4℃ 0. 05 mol·L － 1 Tris-HCl 缓冲液中透析，期间换透析液2 ～ 4次，透析过夜。
1． 2． 2 蛋白质检测蛋白质含量参照Bradford 法测定［8，9］。
用BSA 蛋白标准液在595 nm 波长测得的吸光值绘制标准曲线。
不同饱和度盐析得到的蛋白样品在595 nm 波长测得的吸光值通过标准曲线计算含量并换算成质量。
1． 2. 3 离子交换层析分离溶菌酶1． 2. 3. 1 层析所需缓冲液Tris-HCl缓冲液( THB) : 0. 01 mol·L － 1 Tris-HCl缓冲液: 1. 211 4 g Tris-Base，溶于蒸馏水中，在900 mL 时调节pH，溶液平衡到室温时定容到1 000 mL，pH 9. 0。
溶液需用0. 45 μm 滤膜过滤后在超声仪中脱气30 min。
1． 2. 3. 2 层析条件AKTA explorer 900 层析系统: 装入HiTrapQ FF 预装柱，上样前用pH 9. 0 的0. 01 mol·L － 1Tris-HCl 缓冲液( THB) 平衡层析柱，直到流洗液经AKTA 检测各项指标回归基线。
上样后用缓冲液进行洗脱; 洗脱条件: 用pH 9. 0，0. 01 mol·L － 1 Tris-HCl缓冲液，流速1 mL·min － 1 进行洗脱。
1． 2. 3 蛋白质纯度测定收集各层析峰，检测蛋白浓度，纯度分析采用SDS-PAGE 电泳法，制板采用Laemmli 体系，即12 g·dL－ 1 的分离胶和5 g·dL－ 1 的浓缩胶。
采用考马斯亮蓝法染色。
1． 2. 5 溶菌酶酶活测定采用舒加法测溶菌酶酶活［10，11］，溶壁微球菌干粉复苏后，进行二次传代培养，富集得到50 mL菌液，4℃，3 000 r·min － 1 离心15 min，去上清后，沉淀用生理盐水重悬，重复此操作3 次。