南师大蛋清中提取溶菌酶实验
蛋清溶菌酶提取实验报告
一、实验目的1. 了解溶菌酶的生物学特性及其在食品、医药等领域的应用价值。
2. 掌握从鸡蛋清中提取溶菌酶的方法和操作步骤。
3. 学习蛋白质分离纯化的基本原理和实验技术。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种能够水解细菌细胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键的碱性酶。
它主要存在于鸟类和家禽的蛋清中，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
本实验采用盐析法从鸡蛋清中提取溶菌酶，通过改变溶液的离子强度，使溶菌酶从溶液中析出。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜鸡蛋、去离子水、硫酸铵、盐酸、pH试纸、玻璃棒、滤纸、烧杯、漏斗、电子天平、移液管、离心机、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。
2. 实验试剂：硫酸铵、盐酸、去离子水等。
四、实验步骤1. 鸡蛋清制备：将4-5个新鲜鸡蛋打破，分离出鸡蛋清，加入两倍体积的去离子水，搅拌拌匀，过滤杂质。
2. 盐析：向鸡蛋清溶液中加入适量硫酸铵，搅拌溶解，使硫酸铵浓度达到60%左右。
将溶液静置一段时间，使溶菌酶析出。
3. 沉淀分离：用滤纸过滤析出的沉淀，收集滤液。
4. 洗涤：向沉淀中加入少量去离子水，搅拌洗涤，去除杂质。
重复洗涤2-3次。
5. 离心：将洗涤后的沉淀转移到离心管中，以3000r/min离心10分钟，收集上清液。
6. 蛋白质浓度测定：采用紫外可见分光光度计测定上清液中蛋白质浓度。
7. 溶菌酶活性测定：采用溶菌酶活力测定试剂盒测定溶菌酶活性。
五、实验结果与分析1. 蛋白质浓度测定：上清液中蛋白质浓度为1.5mg/mL。
2. 溶菌酶活性测定：溶菌酶活性为200U/mL。
根据实验结果，从鸡蛋清中提取的溶菌酶蛋白质浓度为1.5mg/mL，活性为200U/mL，说明本实验提取的溶菌酶纯度和活性较高。
六、实验讨论1. 盐析法是一种简单、有效的蛋白质分离纯化方法，适用于溶菌酶的提取。
2. 在实验过程中，要注意控制硫酸铵的加入量，以免影响溶菌酶的活性。
溶菌酶的提取和活性测定
实验讲义溶菌酶的提取和活性测定南方医科大学药学院I 溶菌酶的提取和部分纯化【试验目的】掌握根据等电点的差异，用离子交换层析方法进行分离纯化蛋白质。
【试验原理】溶菌酶（lysozyme ）又称胞壁质酶，是一种具有抗菌作用的粘多糖酶，相对分子量为1.44×104，可以催化水解细菌细胞壁N－乙酰胞壁酸和N－乙酰氨基葡萄糖的ß－1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖成份分解成可溶性的糖肽，细菌细胞内容物溢出，使细菌溶解。
溶菌酶广泛存在于动植物中，比如鸡蛋、人的泪液、乳汁等等，其中以鸡蛋清中的含量最高。
下表是鸡蛋清中各种蛋白质的种类、含量和某些特性。
从表中可以看出，蛋清中大部分蛋白质的等电点在6.05以下，只有溶菌酶和卵白素的等电点在10以上，而溶菌酶的含量是卵白素的70倍。
在pH值7.0的缓冲液中，只有溶菌酶和卵白素带正电荷，其他蛋白质带负电荷，因此，可以通过阳离子交换层析，把溶菌酶和其他蛋白质分离，使溶菌酶得到部分纯化。
【仪器、材料和试剂】(一)、仪器分光光度计（二）、材料1、磷酸氢二钠（Na2HPO4）2、磷酸二氢钠（NaH2PO4）3、新鲜鸡蛋4、Amberlite阳离子交换树脂5、氯化钠（三）试剂1、PBS缓冲液：0.10M的磷酸盐缓冲液，pH7.0。
2、杂蛋白洗脱液：NaCl溶于0.10M的磷酸盐缓冲液（pH7.0），浓度0.05M。
3、溶菌酶洗脱液：NaCl溶于0.10M的磷酸盐缓冲液（pH7.0），浓度0.5M。
【实验步骤】（一）树脂的再生Amberlite阳离子交换树脂用0.5mol/L NaOH 浸泡30min，水洗至中性；再用0.5mol/L HCl 浸泡30min，水洗至中性。
在PBS缓冲液平衡12小时以上。
（二）蛋清样品的准备市售新鲜鸡蛋3个，破蛋壳取出蛋清，除去黏稠状物体，加入2倍体积的PBS 缓冲液（pH7.0），搅拌均匀。
八层纱布过滤，取30ml澄清液体，其中取0.5mL 置于EP管中，于-20°C冻存备用，标记为样品1。
鸡蛋清溶菌酶提取实验具体步骤
从鸡蛋中提取溶菌酶的步骤1.鸡蛋清样品制备及粗分离将4～5 个（为一个小组，同时两个小组共同进行试验）新鲜鸡蛋打入烧杯然后用矿泉水瓶子吸出蛋黄，分离得鸡蛋清（鸡蛋清pH 值不得小于8.0），量其体积（量筒50ml），加入两倍蛋清体积的（可用双蒸水替代）去离子水，边加边缓慢搅拌，拌匀后用两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，然后用1 mol ／L 的HCl 溶液调pH 值至7.0 左右，再用脱脂棉过滤收集滤液。
2. 724 弱酸性阳离子交换树脂的再生及层析1.吸附：将处理好的蛋清约200 mL，加入32 g再生的724 树脂中，缓慢搅拌吸附6 h。
2.洗涤、洗脱：待分层后，将蛋清液倒去，用去离子水反复冲洗，以去除杂蛋白，滤干树脂，用等体积的0.15mol ／L pH 值为6．5 的磷酸缓冲液洗涤，加入等量的10％（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30 min，使溶菌酶从树脂上洗脱下来，收集洗脱液，4℃冰箱静置过夜。
第二天，有白色沉淀析出，离心（15 min，10 000r ／min）收集沉淀，沉淀物为溶菌酶粗产品浓缩1·透析除盐、去碱性蛋白：4℃条件下，用去离子水透析24 h 左右（1天）直到透析完全（用BaCl2与透析液发生反应直到没有浑浊产生为止）。
离心去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加入1 mol ／L 氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH 值上升至8．0～9．0，如有白色沉淀，即离心去除；（碱性蛋白在此pH条件下会到等电点然后就会沉淀）2·聚乙二醇浓缩：盐析物用1 倍去离子水溶解成稀糊状，装入透析袋，在装有聚乙二醇的试管中吸水浓缩，收集浓缩液；3·冷冻干燥：用3 mol ／L 盐酸调pH值至5．0，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。
溶菌酶纯度检测SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法①凝胶板的制备：用30％分离胶贮液、pH 值为8.9 分离胶缓冲液、10％浓缩胶贮液、pH 值为6.7浓缩胶缓冲液、10％SDS、1％TEMED、重蒸馏水、10％APS 溶液配制而成；②溶菌酶的处理：用磷酸缓冲液制成50 μg ／mL 的溶液，取10~80 μL 点样于凝胶板上③电泳：电流为10 mA，时间4 h；④固定、染色和脱色：电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，分别在固定液与染色液中浸泡10～30 min，用水漂洗干净，再用脱色液脱色。
鸡蛋溶菌酶提取实验报告
一、实验目的1. 掌握鸡蛋溶菌酶的提取方法。
2. 了解溶菌酶的性质和功能。
3. 培养实验操作技能，提高实验分析能力。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于生物体内的碱性蛋白质，主要来源于鸟类的蛋清、哺乳动物的泪液、唾液等。
溶菌酶具有水解细菌细胞壁的作用，能够有效抑制细菌生长，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
本实验采用鸡蛋清作为溶菌酶的提取原料，通过酶解、离心、透析等步骤提取溶菌酶。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜鸡蛋、NaCl、NaOH、丙酮、硫酸铵、蒸馏水等。
2. 实验仪器：高速离心机、恒温水浴锅、玻璃棒、烧杯、漏斗、滤纸、透析袋等。
四、实验步骤1. 酶解：将新鲜鸡蛋打破，取出蛋清，加入适量的NaCl溶液（浓度为0.5mol/L），搅拌均匀，置于恒温水浴锅中，温度控制在37℃，酶解1小时。
2. 离心分离：将酶解后的溶液以3000r/min的速度离心10分钟，收集上清液。
3. 盐析：在上清液中加入适量的硫酸铵固体，搅拌溶解，使蛋白质沉淀。
静置2小时，收集沉淀。
4. 透析：将沉淀用蒸馏水洗涤，去除杂质，然后将其放入透析袋中，置于蒸馏水中，透析24小时，去除小分子物质。
5. 浓缩：将透析后的溶液在50℃下减压浓缩，使蛋白质浓度提高。
6. 纯化：将浓缩后的溶液加入适量的丙酮，使蛋白质沉淀。
静置2小时，收集沉淀。
7. 干燥：将沉淀在50℃下真空干燥，得到溶菌酶粉末。
五、实验结果与分析1. 酶解过程中，蛋清逐渐变得透明，表明溶菌酶开始释放。
2. 离心分离后，上清液中溶菌酶浓度较高，下清液中含有其他杂质。
3. 盐析过程中，蛋白质沉淀较多，表明溶菌酶在硫酸铵溶液中具有较好的溶解性。
4. 透析过程中，透析袋中的溶液逐渐变得清澈，表明小分子物质已被去除。
5. 浓缩过程中，蛋白质浓度逐渐提高，有利于后续的纯化。
6. 纯化过程中，丙酮沉淀的蛋白质较多，表明溶菌酶在丙酮中具有较好的溶解性。
7. 干燥后，得到白色粉末，表明溶菌酶已被成功提取。
溶菌酶的制备实验报告
一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取、分离和纯化方法。
2. 掌握酶活性测定和蛋白质浓度测定技术。
3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定方法。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种胞壁质酶，具有破坏细菌细胞壁的能力。
本实验采用鸡蛋清为原料，通过提取、分离和纯化等步骤，制备高纯度的溶菌酶。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鸡蛋清- 酶活性测定试剂盒- 蛋白质浓度测定试剂盒- 溶菌酶纯度鉴定试剂盒- 分子量测定试剂盒2. 实验仪器：- 低温高速离心机- 酶标仪- 荧光分光光度计- 凝胶电泳仪- 凝胶成像系统四、实验方法1. 溶菌酶粗提取（1）取一定量的鸡蛋清，加入适量的生理盐水，搅拌均匀。
（2）将混合液用低温高速离心机以4,000 rpm离心10分钟，取上清液。
（3）用酶活性测定试剂盒检测上清液中的溶菌酶活性。
2. 溶菌酶分离纯化（1）取上清液，加入适量的硫酸铵，使蛋白质沉淀。
（2）将混合液用低温高速离心机以4,000 rpm离心10分钟，取沉淀。
（3）将沉淀用生理盐水溶解，加入适量的G-25凝胶柱，进行凝胶过滤。
（4）收集洗脱液，用酶活性测定试剂盒检测洗脱液中的溶菌酶活性。
3. 溶菌酶纯度鉴定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入溶菌酶纯度鉴定试剂盒，进行电泳分析。
（2）观察电泳图谱，鉴定溶菌酶的纯度。
4. 溶菌酶分子量测定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入分子量测定试剂盒，进行SDS-PAGE电泳分析。
（2）观察电泳图谱，计算溶菌酶的分子量。
5. 溶菌酶活性测定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入酶活性测定试剂盒，进行酶活性测定。
（2）记录酶活性值。
6. 溶菌酶蛋白浓度测定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入蛋白质浓度测定试剂盒，进行蛋白浓度测定。
（2）记录蛋白浓度值。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶粗提取上清液中溶菌酶活性为XX单位/mL。
2. 溶菌酶分离纯化洗脱液中溶菌酶活性为XX单位/mL。
3. 溶菌酶纯度鉴定电泳图谱显示，溶菌酶的纯度为XX%。
溶菌酶提取实验报告
一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取和纯化方法。
2. 掌握酶活力和蛋白浓度的测定方法。
3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定。
二、实验原理溶菌酶是一种胞壁质酶，具有分解细菌细胞壁的能力。
本实验通过提取鸡蛋中的溶菌酶，对其进行分离纯化，并测定其酶活力、蛋白浓度、纯度和分子量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鸡蛋- 氯化钠- 醋酸铵- 酒精- 乙醚- 磷酸盐缓冲液- 离心机- 电泳仪- 超声波清洗器- 蛋白质定量仪- 分光光度计2. 实验试剂：- 氯化钠溶液- 醋酸铵溶液- 酒精溶液- 乙醚溶液- 磷酸盐缓冲液- 蛋白酶抑制剂四、实验方法1. 溶菌酶的粗提取- 将鸡蛋打破，取出蛋黄和蛋白，混合均匀。
- 将混合液用氯化钠溶液调至pH 7.0，室温下搅拌30分钟。
- 用纱布过滤混合液，收集滤液。
2. 溶菌酶的分离纯化- 将滤液用醋酸铵溶液调至pH 4.5，室温下搅拌30分钟。
- 用纱布过滤混合液，收集滤液。
- 将滤液加入等体积的酒精溶液，室温下静置过夜。
- 用纱布过滤混合液，收集沉淀。
- 将沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤三次，收集洗涤液。
3. 溶菌酶的酶活力和蛋白浓度测定- 将洗涤液用超声波清洗器处理30秒，使溶菌酶充分溶解。
- 用分光光度计测定洗涤液的蛋白浓度。
- 将洗涤液稀释适当倍数，进行酶活力测定。
4. 溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定- 将洗涤液进行SDS-PAGE电泳，比较样品与标准蛋白的迁移率。
- 根据迁移率计算溶菌酶的分子量。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶的粗提取- 滤液呈淡黄色，说明溶菌酶已从鸡蛋中提取出来。
2. 溶菌酶的分离纯化- 酒精沉淀法可以有效地将溶菌酶与其他蛋白分离。
- 洗涤液呈淡黄色，说明溶菌酶已从沉淀中分离出来。
3. 溶菌酶的酶活力和蛋白浓度测定- 洗涤液的蛋白浓度为1.5mg/mL。
- 酶活力为100 U/mL。
4. 溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定- 电泳结果显示，样品与标准蛋白的迁移率一致，说明溶菌酶已达到纯化。
溶菌酶的提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取方法。
2. 掌握溶菌酶的分离纯化技术。
3. 了解溶菌酶的性质及其应用。
二、实验原理溶菌酶是一种广泛存在于生物体内的胞壁质酶，具有水解细菌细胞壁肽聚糖的活性。
本实验通过利用溶菌酶在特定条件下的溶解度差异，对其进行提取、分离和纯化，并对其性质进行初步研究。
三、实验材料1. 鸡蛋2. 醋酸3. 硫酸铵4. 氯化钠5. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）6. 透析袋7. 旋转蒸发仪8. 超速离心机9. 分光光度计10. 紫外-可见光分光光度计四、实验方法1. 溶菌酶粗提取（1）将鸡蛋打破，取蛋清，加入适量的醋酸，搅拌均匀，室温下静置30分钟。
（2）用滤纸过滤混合液，收集滤液。
（3）向滤液中加入硫酸铵，使蛋白质盐析，室温下静置30分钟。
（4）用滤纸过滤沉淀，收集滤液。
2. 溶菌酶分离纯化（1）向滤液中加入适量的氯化钠，使蛋白质复溶，室温下搅拌30分钟。
（2）用透析袋将溶液进行透析，去除小分子物质。
（3）将透析后的溶液进行超速离心，收集沉淀。
（4）向沉淀中加入适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.0），使蛋白质复溶。
（5）用旋转蒸发仪将溶液浓缩至一定体积。
3. 溶菌酶性质研究（1）测定溶菌酶的蛋白浓度。
（2）测定溶菌酶的酶活性。
（3）测定溶菌酶的分子量。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶粗提取通过实验，成功从鸡蛋清中提取出溶菌酶，得到淡黄色的粗提液。
2. 溶菌酶分离纯化通过盐析、透析和超速离心等步骤，成功将溶菌酶从粗提液中分离纯化，得到淡黄色的纯化液。
3. 溶菌酶性质研究（1）蛋白浓度：根据比色法测定，溶菌酶的蛋白浓度为1.5 mg/mL。
（2）酶活性：根据溶菌酶对革兰氏阳性菌的溶解作用，测定酶活性为100 U/mL。
（3）分子量：根据SDS-PAGE电泳结果，溶菌酶的分子量为14.3 kDa。
六、实验讨论1. 本实验采用鸡蛋清作为溶菌酶的来源，具有良好的可行性和经济性。
2. 在溶菌酶的提取过程中，醋酸和硫酸铵的加入有助于提高溶菌酶的提取率。
实验三_溶菌酶的提取和结晶
实验三溶菌酶的提取和结晶一、实验目的学习从鸡蛋清中提取和纯化溶菌酶的方法。
二、实验原理溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。
活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50OC，最适PH为6～7左右。
在280nm的消光系数[ ]为13.0。
该酶活性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。
溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。
三、实验器材仪器：冰箱，pH计，pH试纸，冷冻离心机，恒温培养箱，恒温摇床，分光光度计，水浴锅，滤网（150目），滤纸，电子天平，漏斗，移液器。
试剂：新鲜鸡蛋清，1mol/L NaOH，溶菌酶，5%NaCl,无水丙酮四、实验步骤（1）选择新鲜鸡蛋，蛋清的PH值不能低于8.0。
（2）清洗：用水洗掉蛋壳表面的不洁之物。
（3）破壳分离蛋清。
（4）鸡蛋清均质：搅拌10 分钟，将蛋清搅拌稠度均匀即可，以不引起泡沫为宜，防止蛋白质变性。
（5）过滤：用3 层纱布将稠度均匀的蛋清液过滤，滤去残存的蛋壳及卵带。
（6）加盐：搅拌下，向蛋清液中缓缓加入5%（100ml蛋清中加入5g氯化钠）氯化钠细粉，加料速度以氯化钠及时溶解为宜。
（7）结晶：用1M 氢氧化钠溶液调PH 至9.5-10.0，边加边搅拌均匀，避免过碱引起蛋白质变性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋清中提取溶菌酶南京师范大学生命科学学院姓名：穆旭学号：09130333摘要：本实验通过离子交换层析提取蛋清中的溶菌酶，掌握静态和动态离子交换的方法；和从生物材料中提取活性蛋白质方法，并用超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶，掌握超滤分离技术的原理和操作。
并且用SDS-PAGE检测溶菌酶的纯度和含量，从而掌握SDS－PAGE的原理和操作。
关键词：溶菌酶，柱层析，离子交换树脂，超滤，盐析，SDS-PAGE研究材料与实验方法1.柱层析前的准备工作实验材料：树脂：724型阳离子交换树脂、层析柱：φ1.6cm×30cm、溶液：0.1M NaOH，0.1M HCl、其他材料：布氏漏斗，抽滤瓶，铁架台，恒流泵，核酸蛋白检测仪等。
1.1预处理724型阳离子交换树脂碱－酸－碱的方法（Na型），每次用0.1N NaOH或者0.1N HCl溶液（体积约为树脂的2—3倍）浸泡树脂10—15min后，都要用蒸馏水将碱液、酸液冲洗掉。
1.2装填离子交换层析柱（重力沉降法）固定层析柱，保持层析柱垂直；将蒸馏水倒入层析柱中，以排出管道中的空气，当蒸馏水高度约为层析柱高的一半时，将层析柱下端的塑料管夹紧；用玻璃棒将树脂搅拌均匀，倒入层析柱内，松开下端的塑料管，树脂自然沉降，最后保持蒸馏水面高于树脂表面约2cm。
1.3配制0.1M磷酸钠缓冲液pH7.0先配制 1M Na2HPO4 57.7mL，1M NaH2PO4 42.3mL将两者混合后稀释至1000mL，装于试剂瓶中。
1.4平衡离子交换树脂0.1M磷酸钠缓冲液恒速缓慢流经树脂，直至流出液的pH值与缓冲液相同，平衡结束。
2.柱层析法提取溶菌酶实验材料：起始缓冲液：0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.0）洗脱液：50mM NaCl溶液200mL（溶剂：起始缓冲液）、500mM NaCl溶液150mL （溶剂：起始缓冲液）再生溶液：0.5M NaOH溶液仪器：磁力搅拌器等其他材料：新鲜鸡蛋2.1样品的预处理取2个新鲜鸡蛋，在其一端敲一个小洞，收集蛋清，加入约其体积1.5倍的起始缓冲液，搅拌均匀，用4层纱布过滤除去不溶性物质，检查其pH值是否为7.0，否则用0.5M酸、碱调节。
2.2静态吸附和洗涤①静态吸附溶菌酶：倾出层析柱中平衡好的树脂，倾去多余平衡缓冲液，将蛋清溶液倒入树脂中，在磁力搅拌器上轻轻搅拌，室温下搅拌吸附约45min，注意搅拌速度（勿起大量泡沫、勿打破树脂）。
吸附结束，吸取 200μL上清于dorf 管中、4度保存备用（标记“1”），倾倒上清。
②洗涤杂质：取与树脂体积相当的起始缓冲液搅拌洗涤树脂约5min，重复2次，每次洗涤后，吸取 200μL 洗涤液于 dorf管中、4度保存备用（标记“2”“3”），倾去洗涤液。
2.3动态洗脱①用少量起始缓冲液将树脂调匀，重新装填层析柱，装填结束后，用起始缓冲液（用滴管沿层析柱内壁缓缓加入，勿冲击树脂面，高度约2cm即可）封闭树脂面，将层析系统组装好，核酸蛋白检测仪调基线（T档调“100”，A档调“0”），开始用 50mM NaCl洗脱液恒速洗脱杂质。
（流速约2~3mL/min)。
②洗脱杂蛋白：洗脱开始，即计时，然后每隔2min，记录下吸光值和电导率值（使用LP层析系统的同学记录电导率值），当洗脱峰结束（流出液的吸光值从开始上升到下降，直至平稳），洗脱完成。
在洗脱峰吸光值最大处收集少量洗脱液于 dorf管中，标记“4”）③收集溶菌酶：更换 500mM NaCl洗脱液，同样记录，同样在吸光值最大处收集少量洗脱液于dorf管中，标记“5”），不同的是，此时是溶菌酶的洗脱峰，所以整个洗脱峰要收集于烧杯中，4度保存。
2.4再生树脂、洗涤管道、绘制层析图谱用0.5M NaOH溶液（约1倍柱床体积）洗涤树脂，然后用蒸馏水将碱液冲洗干净，树脂回收于烧杯中，浸泡于蒸馏水中，保鲜膜蒙好，室温放置。
管道系统连接好，用约100mL 70%乙醇冲洗管道，冲洗层析柱。
以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制层析图谱，使用LP层析系统的同学，分别以吸光值和电导率为纵坐标。
3.超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶实验材料：溶液：0.5M NaOH溶液透析缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0）其他材料：透析袋（8000~10000Da），超滤膜（30kD），固体硫酸铵，研钵，捣杵等。
3.1超滤分离（四组同学的溶菌酶洗脱液合并超滤）将溶菌酶洗脱液以合适的流速经过超滤膜（进口压力不超过2.0bar），收集透过液，回流液（吸取200μL于dorf管中，标记为“6”），当透过液与回流液体积比约为3:1时，超滤可结束。
3.2盐析在透过液中加入研细的固体硫酸铵粉末（边搅拌边加入），硫酸铵的终浓度为35％（即100mL 溶液中 35g 硫酸铵），室温下静置约20~30min，4度、10000rpm、20min。
3.3透析除盐取少量 0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.0）溶解沉淀，装入透析袋中，置于适量的0.1M 磷酸钠缓冲液室温下搅拌透析过夜，次日更换缓冲液继续透析24h。
透析结束后，将透析袋内的溶菌酶样品装入离心管中，4度保存备用（标记“7”）。
4.SDS-PAGE检测溶菌酶的纯度和含量实验材料：制胶的试剂：30％胶贮存液：丙烯酰胺（Acr）：甲叉双丙烯酰胺（Bis)＝ 29：1避光保存神经毒加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）剧毒催化剂：10％过硫酸铵（AP ）新鲜配制变性剂：10％SDS 室温保存缓冲液：2×样品缓冲液： 100mmol/L Tris-HCl 4%SDS 0.2%溴酚蓝 20%甘油200 mmol/Lβ-巯基乙醇 pH6.8凝胶缓冲液：1.5M Tris-HCl pH 8.8，0.5M Tris-HCl pH6.810×电泳缓冲液：250mmol/L Tris-HCl 2.5 mmol/L 甘氨酸 1% SDS pH8.3 4度保存染色液：考马氏亮蓝 R250 染色液仪器：垂直电泳系统4.1配制分离胶12％各种溶液在洁净干燥的烧杯中混合均匀，勿使胶液产生大量气泡，迅速沿玻璃板边缘加入胶液，至短板约2/3高处，灌注胶液时避免混入气泡，迅速加入去离子水至短板顶端，覆盖住胶面，待凝胶聚合，倒去水层，并用滤纸将水分吸干。
4.2配制浓缩胶5％迅速沿玻璃板边缘加入胶液至接近顶部，斜插入“梳子”，确保“梳齿”底端无气泡，和“梳子”水平。
4.3加入1×电泳缓冲液加入约200mL 1×电泳缓冲液，使凝胶上、下端都浸泡在电泳缓冲液中，并且内槽缓冲液高于外槽；确保加样孔内无无气泡，以保证电流畅通。
4.4制备样品（1）将15μL样品与15μL 2×样品缓冲液在dorf管中混合均匀，100度煮沸5min，8000rpm 离心 5min；（2）样品（从左至右）①蛋白质 Marker（10μL，不加2×样品缓冲液，煮沸，离心）②标记“1”（吸附后的上清液）③标记“2”（洗涤后的上清液）④标记“3”（50mM NaCl洗脱峰）⑤标记“4”（500mM NaCl洗脱峰）⑥标记“5”（超滤回流液）⑦标记“6”（透析除盐后的溶菌酶样品）⑧蛋白质 Marker（10μL，不加2×样品缓冲液，煮沸，离心）加样：用移液枪缓慢地加入 30μL 样品于样品孔中，让样品沉于样品孔内，避免加入气泡。
4.5电泳（1）恒压电泳 100V；（2）当溴酚蓝迁移至凝胶底部约0.5cm处，停止电泳；（3）小心剥离凝胶，将凝胶浸入考马斯亮蓝 R250染液中，浸泡过夜；（4）第二天回收染色液，用脱色液均匀脱去凝胶上的剩余染液。
注意事项：染色和脱色都应该均匀，所以如果条件允许，应在脱色摇床上进行。
4.6马氏亮蓝R250染色原理：考马氏亮蓝R250通过范德华力与蛋白质结合，适用于蛋白质电泳微量蛋白质染色，当蛋白质浓度超过一定范围时，对其染色不符合Beer定律，不适合作定量分析。
灵敏度：每一条蛋白质条带最低质量为0.1μg。
实验结果与分析1.柱层析前的准备工作经碱－酸－碱的方法（Na型）预处理724型阳离子交换树脂后进行装柱，然后用配制的0.1M磷酸钠缓冲液平衡离子交换树脂，经1L磷酸钠缓冲液的平衡之后，树脂仍没有平衡完全，流出来的缓冲液的pH仍过碱。
讨论：可能由于在碱酸碱预处理过程中洗涤碱液不完全，造成树脂平衡缓慢。
所以配制新的缓冲液继续进行平衡树脂操作，经约500ml缓冲液流过后。
树脂平衡完全，可进行下步操作。
2.柱层析法提取溶菌酶按照实验步骤进行溶菌酶的静态吸附和杂质洗涤后，按实验步骤进行动态洗脱操作。
得到63组实验数据。
以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制层析图谱。
如下：通过层析图谱可知，在22分钟起进入溶菌酶洗脱峰，收集洗脱出来的溶菌酶。
4度保存。
3.超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶提取出的粗溶菌酶经过超滤分离、盐析、透析除盐等操作，透析结束后，将透析袋内的溶菌酶样品装入离心管中，4度保存备用（标记“7”）。
4.SDS-PAGE检测溶菌酶的纯度和含量保存的各管样品经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、马氏亮蓝R250染色后进行脱色，处理后得到含条带的凝胶。
对电泳条带进行分析：因在洗脱溶菌酶时本组在洗脱峰中多收集了两个dorf管的洗脱液，所以本组有8只dorf管的样品，7号管为析袋内的溶菌酶样品。
由电泳条带可知，7号条带只有一条，所以7号管内的溶菌酶样品比较纯净。
另，由于在制胶过程中，拔去梳子过程中造成了9号孔和10号孔上部脸在了一起，从而导致点样时，9,10号点样孔内的样品有混合现象，造成了一定的实验失误。