改良小鼠骨髓间充质干细胞培养方法及长效荧光标记的可行性
小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是骨髓中除造血干细胞外另一重要的干细胞。
MSC 具有自我更新、多向分化、免疫调控和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果。
虽然MSC临床应用广泛，但许多关键问题如免疫调控的具体机制等并未解决。
小鼠是重要的实验动物之一，广泛用于基础实验研究。
在体外成功分离培养MSC，并得到大量纯化的MSC是研究其分化及功能调控机制的前提。
目前分离小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓贴壁法、骨片消化法、流式或磁珠分选法等。
然而全骨髓贴壁法获得的细胞往往含有不少造血细胞；骨片消化法需要进行胶原酶消化，步骤多且消化时问不好控制；流式或磁珠法虽然获得细胞较纯，但程序复杂，花费高且获得的细胞相对少。
骨髓MSC的分离目前常用的方法有全骨髓贴壁法、骨片消化法和流式细胞术或磁珠分选法。
全骨髓贴壁法即根据MSC的贴壁性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
然而该方法获得的MSC往往含有较多基质细胞和造血细胞污染。
我们的结果也显示，全骨髓贴壁法原代培养的细胞有75％为CD45阳性的细胞，传至第3代，MSC中仍有5％的CD45阳性细胞，即造血细胞。
骨片消化法，是先将骨髓冲干净，将股骨和胫骨剪碎，然后进行胶原酶消化。
虽然该方法获的MSC纯度较高，但是程序复杂，且不同鼠龄骨片胶原酶消化时间不同，不容易掌握。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有研究者利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法对其进行分离纯化旧191；虽然这些方法可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性；而且实验条件要求高，需要骨髓量大，加之耗费较大和技术难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
本研究采用骨髓加骨片法分离小鼠MSC，即将股骨和胫骨肌肉去干净后，不需冲骨髓，不需消。
间充质干细胞免疫荧光染色
间充质干细胞免疫荧光染色间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一种多功能的基因细胞类型，它们可以分化成多种不同的成体细胞类型，包括成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。
除了这些基本功能以外，MSCs还表现出了重要的移植和免疫活性，因此成为治疗各种疾病的研究热点之一。
本文就介绍一种关于MSCs的免疫荧光染色技术。
1. MSCs的免疫学特性对于MSCs的免疫学特性，有两个方面值得关注。
一方面，MSCs在诱导免疫抑制反应上表现出了很强的能力，这一点在治疗自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、红斑狼疮等方面得到了证实。
MSCs可以抑制T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等的免疫反应，并且还可以产生细胞因子，如转化生长因子β和间质细胞来源的生长因子-1等，以缓解炎症反应和促进胶原合成等。
另一方面，MSCs本身也存在着免疫反应。
MSCs表达有多种受体，如CD105、CD73和CD90等，同时不表达免疫原表面分子，如CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19或HLA-DR等，因此不会引起免疫排斥反应。
然而，当MSCs 获得免疫激活性的信号，如干扰素-γ或巨噬细胞刺激因子等，它们可以表达HLA-I和HLA-DR等抗原呈递分子，从而激发免疫反应。
2. MSCs免疫荧光染色技术为了研究MSCs在免疫反应中的定位和免疫学特性，我们需要一种可以对MSCs进行免疫荧光染色的技术。
这种技术主要包括以下步骤：（1） MSCs培养和处理： MSCs在完全培养基下培养，处理方式因实验目的而异；（2）细胞固定：使用4%的聚甲醛对细胞进行固定处理，可以利用甲醛代替，但固定剂不能是乙醛，以免影响细胞膜的完整性；（3）细胞膜透性处理：使用0.1%的Triton X-100或其他细胞膜透性处理剂，使得抗体可以渗透到细胞内部，增强免疫荧光信号；（4）免疫反应和荧光标记：使用特异性抗体针对MSCs的表面标记，如CD105、CD73和CD90等，或染色体水平的标记，如Oct4或Nanog等，进行免疫反应，并用荧光标记二抗进行信号检测；（5）显微镜观察和成像：使用激光共聚焦显微镜或荧光显微镜等，观察MSCs标记的荧光信号，并进行成像和分析。
CM-Dil标记示踪间充质干细胞可行性的体外试验
CM-Dil标记示踪间充质干细胞可行性的体外试验陈小莹;李欣然;王清;付霞霏【摘要】Objective To investigate feasibility of CM-Dil labeling mesenchymal stem cells in vitro.Methods We separate,culture and identify rat bone marrow mesenchymal stem cells,after labeling MSCs with CM-Dil concentration respectively in 1,2,4μg/mL,observe label rate of MSCs after 15 min,24 h,48 h,72 h,5 passage and 8 passage,then detect cell cycle with FCM and cell proliferation capability with CCK8.Results MSC cultured with the whole bone marrow adherent method were strongly positive forCD44,CD29 and negative for CD34,CD45.The label rates of MSC 15 min after labeled with CM-Dil 1,2,4 μg/mL were respectively(31.60±1.25)％,(88.73±1.79)％,(96.89±1.31)％,and there has statistically difference (F=1 757.21,P=0.000);the growth curve of the 4 groups was similar,and the percentages of G1 phase,S phase and G2/M phase between the 4 groups have no statistically difference (P＞0.05).Conclusion CM-Dil in concentration 4 μg/mL has high label rate and low cytotoxicity,therefore could be a efficient and stable method of labeling MSCs.%目的探讨氯苯甲酰氨-1,1'双十八烷基-3,3',3',3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸盐(CM-Dil)体外标记骨髓间充质干细胞的可行性.方法分离培养并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞,分别用1、2、4 μg/mL的CM-Dil标记间充质干细胞,观察标记后15 min、24 h、48 h、72h、传5代、传8代的标记率;用流式细胞仪检测标记前后细胞周期的变化;用细胞计数Kit-8 (CCK8)法检测细胞增殖能力.结果采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞CD44、CD29表达阳性,CD34、CD45表达阴性.1、2、4μg/mLCM-Dil标记15 min后标记率分别为(31.60±1.25)％、(88.73±1.79)％、(96.89±1.31)％,差异有统计学意义(F=1 757.21,P=0.000);4组间生长曲线趋势大致相同,且4组间G1期、S期及G2/M期细胞百分比差异无统计学意义(P＞0.05).结论4μg/mL CM-Dil细胞标记率高,无细胞毒性,可作为一种高效而稳定的体外标记间充质干细胞的方法.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2018(047)011【总页数】4页(P1436-1439)【关键词】骨髓间充质干细胞;CM-Dil;细胞标记示踪【作者】陈小莹;李欣然;王清;付霞霏【作者单位】南方医科大学珠江医院妇产科,广州510282;南方医科大学珠江医院妇产科,广州510282;南方医科大学珠江医院妇产科,广州510282;南方医科大学珠江医院妇产科,广州510282【正文语种】中文【中图分类】R394.2干细胞是一类能自我增殖、具有多向分化潜能的细胞，由于其临床应用的可行性及其生物学的重要特性，干细胞治疗成为现代医学研究领域的热点[1]。
小鼠骨髓基质干细胞的培养
小鼠骨髓基质干细胞的培养学号122010000178，2010级硕士同仁医院，严森骨髓基质干细胞( marrow st romal stem cell,MSC)是一种来源于骨髓的成体干细胞, 本实验通过小鼠骨髓基质干细胞的培养及对其进行体外细胞特性的研究。
目的: 取小鼠股骨骨髓进行骨髓基质干细胞的原代培养,通过相差显微镜、光镜及扫描电镜观察, 了解骨髓基质干细胞的生长情况及其特点。
练习血细胞计数器的使用方法1 材料与方法1．1 材料，小白鼠(实验动物部提供) , 培养瓶，α-MEM 培养基5ml, 20ml空离心管，hanks 液近50ml，胎牛血清（一小离心管）0.2ml ,，双抗（青霉素+庆大霉素）0.2ml，碳酸氢钠0.2ml,10ml注射器，无菌器械包括:镊子两把(无齿镊，有齿镊，组织剪大小两把)，吸管三只（有刻度两只）酒精棉若干，酒精灯1．2 基质干细胞的培养1.2.1操作者洗手戴鞋套在通风柜中保证无菌操作，点燃酒精灯，把三只试管纸套取下，从高压灭菌的套筒中取三只吸管于试管中，并妥善放在试管架上1..2.2取0.1ml单抗于hanks液中，剩余单抗倒入α-MEM培养基中，并吸取碳酸氢钠液一滴于hanks液中，使溶液呈碱性（红色）。
1.2.3取1 月龄小白鼠1只,雌雄不限,体重约20g, 断颈脱臼处死, 无菌条件下暴露股骨, 在培养皿中去除皮肤，附带的肌肉和骨膜,切断股骨,切断上肢，并将每一肢上下剪下两个小口便于冲洗，剥离四肢时用hanks 液进行冲洗,1.2.3分次取12mlhanks液于10ml注射器中，分别灌洗四肢骨髓，一肢骨髓用去3ml，反复上下冲洗，用空的大离心管(20ml)收集冲洗液，并将冲洗液收集好后加盖离心，1000转，5分钟1.2.4弃掉上述离心好的细胞液上清，再加入12mlhank液，并用吸管反复吹打后再次离心1000转，5分钟1.2.5弃掉上述离心好的细胞液上清，加入5ml的α-MEM 培养基，加胎牛血清，，再加入12mlhank液，并用吸管反复吹打后再次离心1000转，5分钟1.2.6弃上清，加样抢取0.1ml于小离心管中，再加入0.7ml（相当于7倍稀释）的Trypan 染料，在相差显微镜下将盖玻片盖好在计数池上开始计数，剩余细胞悬液加入培养瓶中在适宜环境下进行接种培养可见细胞数目：四大个细胞总数/4*稀释倍数*1042.结果：四个大格是50个细胞的，计算的结果：8.75×105/ml个，3.注意事项：3.1无菌操作下进行，如组织材料遗落在非无菌区则弃之，3.2不要让液体漫过计数池，并且让标本在格子架上流动，计数池液体要充分，不要让碎片或者气泡进入到细胞计数池中，在格子上的细胞不用记数在内，要数在小格中的细胞，3.3小鼠处死后要迅速制作股骨标本，皮下剪开时切勿伤及腹腔，及大血管，影响标本制作3.4吹打时不要产生气泡，。
临床研究用人间充质干细胞质量评价
临床研究用人间充质干细胞质量评价人间充质干细胞（human mesenchymal stem cells, hMSCs）在临床研究和应用中具有广泛的潜力。
然而，为了确保其安全性和疗效，对hMSCs的质量评价非常关键。
本文将探讨临床研究中hMSCs质量评价的重要性，并介绍一些常用的评价策略。
hMSCs作为一种多能性细胞，具有自我更新和分化为多个细胞类型的能力。
在临床上，hMSCs被广泛应用于再生医学、免疫治疗和组织工程等领域。
然而，hMSCs的质量差异可能会影响其治疗效果。
因此，临床研究中对hMSCs的质量评价非常重要，可以为临床应用提供更可靠的数据。
hMSCs的质量评价通常包括以下几个方面：细胞鉴定、细胞扩增、细胞防污染和细胞功能。
首先，细胞鉴定是评价hMSCs的重要环节。
常用的鉴定方法包括表面标记物分析、细胞特异性基因表达和细胞功能特性等。
表面标记物分析可以使用免疫细胞化学或流式细胞术来检测hMSCs的特定标记物，如CD73、CD90、CD105等。
此外，通过检测细胞特异性基因的表达，如MSC标记物CD44、CD166，可以进一步确认hMSCs的鉴定。
细胞功能特性的评价，如多向分化和抗炎能力等，也是评价hMSCs质量的重要指标之一细胞扩增过程是hMSCs质量评价的另一个关键环节。
细胞扩增能力影响到hMSCs的数量和质量，因此需要严格监测细胞扩增的效率和稳定性。
常用的评价指标包括细胞增殖速率、达到稳定生长状态的时间和细胞倍增时间等。
细胞防污染是确保hMSCs质量的重要环节。
在临床研究中，细胞防污染控制主要针对细胞培养环境和原料的无菌性。
采取合理的无菌技术和操作规范，如灭菌培养器具、无菌操作台和严格的质量控制流程，可以有效避免污染。
最后，细胞功能的评价是hMSCs质量评价的重要环节。
细胞功能通常包括抗炎、免疫调节和组织修复等。
通过in vitro和in vivo实验，如淋巴细胞抑制实验、小鼠模型等，可以评估hMSCs的功能特性。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。
小鼠活体内hMSCs干细胞生物发光示踪监测
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Ｈ ａｔ Ｌ ｎ ｅｒ， ｕｇ＆ Ｂ ｏ ｄ Ｖｓ ｌ ｉ ａ ｅ， ｅｉｇ １０ ２ ， ｈｎ ｌ ｅ ｅ Ｄ ｓ ｓｓ Ｂ ｒｎ ０ ０ ９ Ｃ ｉａ ｏ ｓ ｅ
［ ｂｔａｔ Ｂ ｃ ｇｏ ｎ Ｂ ｎ ￣ ｗ ｄｒ ｅ ｅｅｃｙ ａ ｓ ｍ ｃｌ Ｍ Ｃ ）ｈ ｖ ｅｎｐｏｅ ｎ Ａ ｓ ｃ］ ａｋ ｒｕ ｄ：ｏ ｅ ｒ ｍａ ｏ —ｅ ｖｄｍ ｓｎｈｍ ｌ ｔ ｅｌ ｉ ｅ ｓ（ Ｓ ｓ ａｅｂｅ ｒｖｄｉ
有影 响 ；．小鼠活体 内生物发光强度与注射细胞数量成正 比（ ．８ ６ ；．小 鼠活体 内生物发光 时 ３ Ｒ ＝０ ９２ ） ４
间持 续 ６ｄ 。结 论 ： 利 用 慢 病毒 载体 转 染 Ｌ Ｃ对 小 鼠活 体 内移 植 的 ｈ Ｃ 进 行 生 物 发 光示 踪 监 测 。 可 Ｕ ＭＳ ｓ
［ 关键词 ］ 慢病毒载体 ； 荧光素酶 ； 骨髓间充质 干细胞 ；生物发光成像 ［ 中图分类号］ Ｒ ４ ５ 【 文献标识码］ Ａ ［ 文章编号 ］ １０ －０ ２ ２ １ ）４３ ２０ ０ ７５６ （０ ０ ０ －２ －７
送检中检验实验室间充质干细胞质量标准
送检中检验实验室间充质干细胞质量标准1. 引言充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）作为一种多功能的细胞类型，具有广泛的临床应用前景。
随着充质干细胞的应用越来越广泛，不同实验室之间对于充质干细胞质量标准的一致性要求也逐渐提升。
本文旨在确立送检中检验实验室间充质干细胞质量标准，以促进充质干细胞研究的进一步发展。
2. 充质干细胞质量标准的选择为了确保实验室间充质干细胞质量标准的一致性，需要选择合适的评估指标。
以下是一些常用的充质干细胞质量标准指标：- 表面标记物：CD105、CD73、CD90阳性；CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19阴性。
- 多向分化潜能：具备成骨、成脂、成软骨等分化能力。
- 增殖能力：具备较高的增殖速度和活力。
- 免疫抑制功能：能够抑制免疫细胞的活化和增殖。
3. 充质干细胞质量标准的实验方法为了确定充质干细胞质量标准的实验方法，可以参考以下步骤：1. 充质干细胞的培养和扩增：选择合适的培养基和培养条件，确保充质干细胞的良好扩增。
2. 充质干细胞的表面标记物鉴定：通过流式细胞术或免疫荧光染色法，鉴定充质干细胞的表面标记物。
3. 充质干细胞的多向分化潜能鉴定：通过体外培养分化实验，观察充质干细胞在不同诱导条件下的分化能力。
4. 充质干细胞的增殖能力评估：通过MTT法等细胞增殖实验，评估充质干细胞的增殖能力。
5. 充质干细胞的免疫抑制功能评估：通过淋巴细胞增殖实验或ELISA法，评估充质干细胞的免疫抑制功能。
4. 实验室间质检的建立和维护为了确保实验室间充质干细胞质量标准的一致性，需要建立和维护质检体系。
以下是一些建议：- 建立标准化的实验操作流程和质检标准，确保每个实验室的操作规范一致。
- 定期组织质检活动，通过对比不同实验室的质检结果，发现和解决质检过程中的问题。
- 建立质检记录和数据库，记录每次质检的结果和不良事件的处理情况。
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万方数据 万方数据王美华．等ｉ改龟小鼠骨髓阉充凌干细瞻培养杰法瑟长敬荧赶标记的可行性液。
２４ｈ后再次换液，培养液小心冲洗贴壁细胞，此时观察贴壁细胞较均一。
以后每３ｄ更换细胞培养液１次，１０ｄ左右细胞生长，片状克隆融合，准备传代。
小鼠Ｍｓｃｓ的传代培养：待细胞长至瓶底的９０％后，进行传代培养。
吸出培养液，用ＰＢＳ洗涤２次。
加入３ｍＬ混合液（０．２５％胰酶＋０．０２％ＥＤＴＡ），消化３—５ｍｉｎ。
显微镜下观察，见梭形细胞回缩变圆，快速加入３ｍＬ含血清的培养基，终止胰蛋白酶作用。
用吸管吹打贴壁细胞，使细胞从培养壁脱离，制成细胞悬液。
离心去除上清，加入含体积分数为１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ完全培养基，混匀计数，以１×１０？，ｃｍ２的密度传代接种于７５ｍＬ培养瓶中，置于体积分数为５％Ｃ０２饱和湿度３７℃培养。
３ｄ更换培养基，８ｄ左右细胞生长达到瓶底的８０％一９０％后，进行再次传代培养。
Ｍｓｃｓ的细胞表型测定【１１１：供体小鼠ＭＳＣｓ鉴定按以下方法标记抗体进行流式细胞仪检测：第２代ＭＳＣｓ，Ｏ．２５％的胰酶消化细胞，胎牛血清中和，离心洗涤。
重悬于含体积分数为０．１％胎牛血清和０．５％ＮａＮ３的ＰＢＳ，再次离心洗涤。
重悬并进行抗体标记，所标记细胞每份不少于５ｘ１０。
细胞，用ＦＩＴＣ标记兔抗鼠的ＣＤ３４，ＣＤ４５，ＣＤｌ０５，ＣＤ４４按１Ｕｇ抗体，１０６细胞分别标记细胞，于室温、避光放置３０ｍＩｎ。
并悬浮在５００ｕＬ的ＰＢＳ中洗涤去上清。
ＣＤｌ０５继续标记二抗，各抗体取同型对照。
空白和其余各管细胞加入４０ｇ／Ｌ多聚甲醛３００江置于酱℃，上流式细胞仪检测。
Ｍｓｃｓ分化功能的鉴定：检测标记与未标记的第２代细胞分化潜能，成骨诱导体系为ａ－ＭＥＭ、体积分数为１０％胎牛血清、Ｂ一甘油磷酸１０ｍｍｏｌ，Ｌ、维生素Ｃ５０Ｕｍｏｌ，Ｌ、地塞米松０．２５ＵｍｏＩ，Ｌ，细胞按５ｘ１０一ｃｍＺ接种，诱导３周Ｖ６ｎＫｏｓｓａ染刨１ＺＪ；成脂肪诱导体系为ａ—ＭＥＭ、体积分数为１０％胎牛血清、地塞米松０．１ｕｍｏＩ，Ｌ、Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ（吲哚美辛）５０ＵｍｏＩ，Ｌ、１－ｍｅｔｈｙＩ一３．ｉｓｏｂｕｔｙＩ熵ｎｔｈ（１一甲基＿３一异丁基黄嘌呤）０．５ｍｍｏＩ，Ｌ，细胞按１ｘ１０４，ｃｍ¨接种，隔天更换新培养基培养１周左右油红Ｏ染色¨川。
ｃＭ．ＤｉＩ干细胞标记及检测：ＣＢ６Ｆ１小鼠的第２代ＭＳＣｓ９０％融合后，胰酶消化，用ＰＢＳ稀释二甲基亚砜溶解ＣＭ．Ｄ¨染剂，５０陶的ＣＭ．ＤｉＩ，用５００ＵＬ二甲基亚砜溶解，配为Ｏ．１ｇ，Ｌ，０．４ｍＬ体积中每６ｘ１０。
细胞需０．４—０．８ｕａＣｌ惟ＤｉＩ。
６ｘ１０。
ＭＳＣｓ加７５ＵＬＣＭ—ＤｉＪ溶液，放３７℃５ｍｉｎ，加ＤＡＰｌ（１ｍｇ，Ｌ）４℃１５ｍｉｎ。
ＰＢＳ洗２遍，悬浮。
计数，传代培养。
每次传代时取少量作标记率检测，加体积分数为１０％甲醛固定，滴少量于玻片，荧光电子显微镜观察照相。
取标记细胞，流式细胞仪检测细胞标记率Ｉ川。
主要观察指标：原代及传代小鼠骨髓ＭＳＣｓ形态变化；流式细胞仪测定培养第２代ＭＳＣｓ的细胞表型；ＭＳＣｓ多向分化功能的鉴定；流式细胞仪检测ＣＭ·Ｄ¨细胞标记率。
设计、实施、评估者：实验设计为第一作者，干预实施及评估为第二作者，经过正规培训，行双盲对照评估。
统计学分析：由第一作者采用ＳＡＳ９．０软件完成统计处理。
２结果２．１小鼠ＭＳＣｓ细胞形态学观察与人或大鼠的ＭＳＣｓ形态不同，小鼠ＭＳＣｓ体形小，最初几代形态呈多形性。
原代培养在接种４８ｈ后可见贴壁细胞，形态为小圆形、多角形、梭形、扁平形，见图１。
培养第７天细胞多数伸展呈梭形，也有三角形、多角形和扁平形，见图２。
细胞在３代后形态趋于统一，融合状态时细胞排列呈束状、漩涡状或放射状，梭形细胞胞浆丰富，核大，见图３。
８９３１ 万方数据王美华．等．改良小鼠骨髓姻充疆于细氍培养方法及长教荧光标记的可行性２．２小鼠ＭＳＣｓ的免疫表型测定用流式细胞仪检测培养第２代ＭＳＣｓ的细胞表型：ＭＳＣｓ特异性抗原高表达ＣＤｌ０５：（６５．００±６．００）‰ＣＤ“：（％．６６±８．００）‰造血系抗原低表达ＣＤ３４：（０．４０±０．１０）％，ＣＤ４５：（２５．９９±５．００）％，见图４。
２．３小鼠ＭＳＣｓ多向分化特性鉴定结果ＭＳＣｓ向成骨分化过程中，细胞形态发生明显变化，纺锤形的突起逐渐消失，胞体增大，形态近方形或多边形，培养１０ｄ后，部分细胞呈聚集生长，随细胞生长密度的增长形成多层的结节结构，逐渐形成ｖｏｎＫｏｓ鞠阳性的骨结节，见图５。
在脂肪诱导体系中，可见细胞由成纤维样逐渐缩短，９ｄ后胞浆中出现脂肪滴，脂肪滴逐渐增大、增多，充满整个细胞胞浆，油红Ｏ染色可见红色的脂肪颗粒，见图６。
标记细胞未影响ＭＳＣｓ的多向分化。
２．４ＣＭ—Ｄ¨标记细胞检测结果首次标记，荧光显微镜观察可见ＣＭ—Ｄ¨标记在细胞膜发橙色光，对比常规光镜计数，标记率在８０％以上。
第４代培养细胞流式细胞仪检测ＣＭ－Ｄ¨细胞标记率可到４７％以上，证明ＣＭ—Ｄ¨标记方法稳定、高标记率可作体内细胞示踪，见图７，８。
只０Ｉ胁ｆ观湘煳＂删饥碘碰啪 万方数据王美牮．等。
改良小鬣骨镳阚宽质干细胞培养方法及长彀荧光标记的魂行性酰２～一叼３讨论骨髓ＭＳＣｓ中胚层发育的早期细胞是近年来医学和生物学领域中最引人注目的热点之一。
这类细胞可以通过体外贴壁培养加以分离，分化为多种造血以外的组织细胞，特别是中胚层和外胚层来源组织的细胞。
同时，ＭＳｃｓ还易于外源基因的转染和表达，因而可能是细胞治疗和基因治疗的理想靶细胞ＩⅧ。
到目前为止，对于ＭＳＣｓ的表面标志尚不确定。
利用流式细胞仪的研究显示，ＭＳＣｓ的表面抗原具有非专一性，它表达了问质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。
主要包括：①黏附分子，如ＣＤｌ６６、ＣＤ５４、ＣＤｌ０２、ＣＤ４４、ＣＤｌ０６等。
②生长因子和细胞因子受体，如白细胞介素１受体、白细胞介素３受体、白细胞介素４受体、白细胞介索６受体、白细胞介素７受体、ａ—干扰素受体、肿瘤坏死因子ａ等。
③整合素家族成员，包括ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ２９、ＣＤｌ０４等。
④其他，如ＣＤ９０、ＣＤｌ０５等。
不表达造血细胞的表面标志，如ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤｌ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８等，也不表达与人白细胞抗原（ＨＬＡ）识别有关的共刺激分子Ｂ７—１、Ｂ７－２及主要组织相容性复合物ＩＩ类分子如ＨＬＡ－ＤＲ抗原等。
目前，比较公认的ＭＳＣｓ鉴定方法，检测细胞表面ＳＨ．２、ＳＨ一３、ＳＨ４抗体，做成脂，成骨，成软骨等分化功能检测【１１，俘侧。
ＭＳＣｓ除了参与构成造血微环境外，还具有广泛的分化潜能。
大量的体内外实验证明，ＭＳＣｓ不仅可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等间质组织细胞，还可跨越胚层界限，分化为外胚层的神经元、神经胶质细胞及内胚层的肝细胞等１１刀。
体外实验初步显示ＭＳＣｓ有明显的抑制Ｔ细胞活化的作用¨纠，ＭＳＣｓ通过抑制树突状细胞成熟，抑制自然杀伤细胞和影响炎性细胞因子释放【１９１，从而降低炎性反应或诱导免疫耐受性表型的产生。
与人和大鼠的ＭＳＣｓ不同，小鼠ＭＳＣｓ培养难度较高，主要表现在：①小鼠体积小，为培养用于治疗目的同批ＭＳＣｓ数量，需要较多的骨髓细胞。
②小鼠ＭＳＣｓ对培养液中的血清要求较高，通常用于培养人或大鼠的胎牛血清无法使小鼠ＭＳＣｓ生长，故必须选用Ｈｙｄｏｎｅ顶级胎牛血清或专门为干细胞生长加工的胎牛血清。
③小鼠ＭＳＣｓ培养扩增时，最初贴壁细胞较杂，通常贴壁培养法筛除杂细胞效果不佳。
人和大鼠ＭＳＣｓ在第１或２代就可见规则梭形毛发状或漩涡状排列细胞，而小鼠ＭＳＣｓ要在３代以后才能出现单一规则排列的形态。
④小鼠ＭＳｃｓ扩增传代时要求细胞接种浓度较高。
⑤小鼠ＭＳＣｓ出现指数倍增和生长平台时间延后，一般在６—１０ｄ，要及时传代，否则容易老化。
⑥小鼠ＭＳＣｓ冻存复苏后干细胞损失较多，不易保存附＿¨。
作者参照以往人和猕猴ＭＳＣｓ培养经验，对小鼠ＭＳＣｓ培养血清选择Ｈｙｃｌｏｎｅ的顶级胎牛血清，控制血清为培养液的１０％。
选择４—６周龄的小鼠，用ＬＧ－ＤＭＥＭ培养液冲出骨髓细胞后，过２００目细胞筛，滤去骨渣和小肌肉碎块。
然后加在相对密度１．０８２的ｐｅ啪¨分离液上，提取单个核细胞，以１．５×１０６，ｃｍｚ浓度接种７５ｃｍｚ培养瓶。
首次４８ｈ换液（增加贴壁细胞数量），２４ｈ后再次换液，并用吸管吸取培养液轻轻吹打培养瓶的细胞贴壁层（可除去大多数造血等杂细胞），之后每３ｄ换液，１０ｄ左右细胞可呈集落分布，８０％曲０％的细胞融合，胰酶消化后，用含血清的培养液快速中和分离下的细胞，吹打均匀后１ｘ１０。
，ｃ一传代。
传代后细胞在７—１０ｄ可再次传代。
将第２代ＭＳＣｓ作干细胞活性鉴定。
培养细胞可以向脂肪和骨细胞诱导分化，细胞表面标志：不表达造血细胞标志，ＭＳＣｓ标志ＣＤ４４表达９６．６％，ＣＤｌ０５表达６５％。
反推证明实验培养的ＭＳＣｓ在第２代干细胞纯度较高。
考虑ＭＳＣｓ传代较多后会导致ＭＳＣｓ功能减退，同时考虑ＭＳＣｓ培养周期及细胞培养成本，决定以第２代ＭＳＣｓ作为下步实验的材料。
传统常用的细胞标记体内示踪剂有很多缺点，如ＤＡＰＩ，当标记细胞死亡后，释放出ＤＡＰＩ，将周围未标记的细胞标记，从而产生假阳性并且标记时间短哗《川。
ＰＫＨ２６红色荧光染料，能清晰地显现细胞的结构和内含物，随细胞分裂，荧光逐渐降低，并且在一定时期后将检测不到标记的细胞。
其他标记方法Ｂｒｄｕ，磁性细胞，绿色荧光蛋白标记等成本高，实验操作复杂，影响干细胞活性陋侧。
作者选择的四甲基吲哚羰基花青高氯酸盐（１，１’—ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ－３，３，３’，３’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏ．∞ｒｂｏｃｙａｎｉｎｅｐｅｒｃｈＩｏ阳ｔｅ，ＤｉＩ）是一种亲脂性碳花青染料，以类似于磷脂的方式通过嵌入生物质膜内与脂蛋白结合，并在膜内做定向扩散运动从而标记整个细胞。
被广泛用于脂蛋白受体结构与功能关系的研究。
ＣＭ．ＤｊＩ是在传统ＤｉＩ基础上的改良产品，荧光表达不受组织细胞８９３３万方数据 万方数据改良小鼠骨髓间充质干细胞培养方法及长效荧光标记的可行性作者：王美华， 胡锴勋， 邱泽武， Wang Mei-hua， Hu Kai-xun， Qiu Ze-wu作者单位：解放军军事医学科学院附属医院消化内科,北京市,100071刊名：中国组织工程研究与临床康复英文刊名：JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH年，卷(期)：2009,13(45)1.Meirelles Lda S;Nardi NB Methodology,biology and clinical applications of mesenchymal stem cells 20092.Kode JA;Mukherjee S;Joglekar MV Mesenchymal stem cells:immunobiology and role in immunomodulation and tissue regeneration[外文期刊] 2009(04)3.Mizuno H Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration:ten years of research and a literature review 2009(02)4.Granero-Moltó F;Wels JA;Miga MI Regenerative effects of transplanted mesenchymel stem cells in fracture healing 2009(08)5.Solelmani M;Nadri S A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow[外文期刊] 2009(01)6.Eslaminejad MB;Nadri S Murine mesenchymal stem cell isolated and expanded in low and high density culture system:surface antigen expression and osteogenic culture mineralization 2009(08)7.Costa-Pinto AR;Salgado AJ;Correlo VM Adhesion,proliferation,and osteogenic differentiation of a mouse mesenchymal stem cell line (BMC9) seeded on novel melt-based chitosan/polyester 3D porous scaffolds 2008(06)8.Liu ZJ;Zhuge Y;Velazquez OC Trafficking and differentiation of mesenchymal stem cells 2009(06)9.Lelker M;Suzuki G;lyer VS Assessment of a nuclear affinity labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells[外文期刊] 2008(08)10.中华人民共和国科学技术部关于善待实验动物的指导性意见 200611.Bühring HJ;Treml S;Cerabona F Phenotypic characterization of distinct human bone marrow-derived MSC subsets 200912.Sugioka T;Ochi M;Yasunaga Y Accumulation of magnetically labeled rat mesenchymal stem cells using an external magnetic force,and their potential for bone regeneration 2008(03)13.Gnecchi M;Melo LG Bone marrow-derived mesenchymal stemcells:isolation,expansion,characterization,viral transduction,and production of conditioned medium 200914.Hemmrich K;Meersch M;von Helmburg D Applicability of the dyes CFSE,CM-Dil and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering[外文期刊] 2006(3-4)15.Patel SA;Sherman L;Munoz J Immunological properties of mesenchymal stem cells and clinical implications[外文期刊] 2008(01)16.Nauta AJ;Fibbe WE Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells 2007(10)17.Le Blanc K;Frassoni F;Ball L Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant,severe,acute graft-versus-host disease:a phase Ⅱ study 2008(9624)18.Maitra B;Szekely E;Gjini K Human mesenchymal stem cells support unrelated donor hematopoietic stem cells and suppress T-cell activation 2000(06)19.Aggarwal S;Pittenger MF Human meaenchymal stem cells modulate allogenelc immune cell responses[外文期刊] 2005(04)20.Kretlow JD;Jin YQ;Liu W Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells 200821.Sung JH;Yang HM;Park JB Isolation and characterization of mouse meaenchymal stem cells 2008(08)22.Leiker M;Suzuki G;lyer VS Assessment of a nuclear affinity labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells 2008(08)23.Ocarino NM;Bozzi A;Pereira RD Behavior of mesenchymal stem cells stained with 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAP1) in osteogenic and non osteogenic cultures 2008(02)24.Sauerzweig S;Baldauf K;Braun H Time-dependent segmentation of BrdU-signal leads to late detection problems in studies using BrdU as cell label or proliferation marker 2009(01)25.Dyson JA;Genever PG;Dalgarno KW Development of custom-built bone scaffolds using mesenchymal stem cells and apatite-wollastonite glass-ceramics[外文期刊] 2007(12)26.Weir C;MoreI-Kopp MC;Gill A Meaenchymal stem cells:isolation,characterisation and in vivo fluorescent dye tracking 2008(05)27.Sch(a)fer R;Kehlbach R;Müller M Labeling of human mesenchymal stromal calls with superparamagnetic iron oxide leads to a decrease in migration capacity and colony formation ability 2009(01)28.Weir C;Morel-Kopp MC;Gill A Mesenchymal stem cells:isolation,characterisation and in vivo fluorescent dye tracking 2008(05)29.Farrell E;Wielopolski P;Pavljasevic P Effects of iron oxide incorporation for long term cell tracking on MSC differentiation in vitro and in vivo 2008(04)30.Karp JM;Leng Teo GS Mesenchymal stem cell homing:the devil is in the details 2009(03)31.Sordi V Mesenchymal stem cell homing capacity 2009(9 Suppl)32.Toma C;Wagner WR;Bowry S Fate of culture-expended mesenchymal stem cells in the microvasculature:in vivo observations of cell kinetics[外文期刊] 2009(03)本文链接：/Periodical_xdkf200945030.aspx。