杆状病毒对昆虫有什么危害.
杆状病毒——昆虫细胞表达系统
实验材料：1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。
2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。
抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自Roche。
实验步骤：一、昆虫细胞转染：1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。
2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。
b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。
c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。
3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。
4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。
加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。
5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。
27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。
二、病毒贮液的制备：1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。
即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。
2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。
长期保存分装冻存于-80℃。
3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量：感染所需病毒贮液量(ml)=[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。
4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下：a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。
昆虫杆状病毒诱导宿主行为变化及其分子机制
摘 要 最近的研究发现杆状病毒感染能够诱导宿主昆虫产生行为变化，典型的表现为寄主运动能力的增强。从生物学的
角度分析，这是杆状病毒有利于自身传播的操控策略。本文综述了 3 种典型杆状病毒诱导宿主昆虫行为发生变化的现象以
及其可能的分子机制。其中，舞毒蛾核型多角体病毒（ LdMNPV） 的 egt 基因能够引起吉普赛舞毒蛾（ Lymantria dispar） 出现异
常活跃的攀爬行为； 而家蚕（ Bombyx mori） 与甜菜夜蛾（ Spodoptera exigua） 幼虫分别被家蚕核型多角体病毒（ BmNPV） 和苜蓿银
纹夜蛾核型多角体病毒（ AcMNPV） 感染后，出现爬行异常活跃的行为则是由于病毒中 ptp 基因的存在。不同种类的杆状病毒
对宿主昆虫行为的操控策略不同，对杆状病毒操控宿主行为的分子机制的探索是一个新的研究领域，其研究成果不仅有助于
第5 期
王国宝等： 昆虫杆状病毒诱导宿主行为变化及其分子机制
1007
Hoover 等［7］推测这种“树高症”是由杆状病毒 的蜕皮甾体尿苷 5'-二磷酸（ UDP） 葡萄糖基转移酶 基因（ egt） 诱导产生的。egt 基因的产物———EGT 酶 能够通过 将 核 糖 供 体 的 糖 基 转 移 到 20-蜕 皮 激 素 （ 20E） 的羟基上而使 20E 失去活性［8］。为了验证这 种假设，他们还利用 2 种野生型病毒作为对照，并构 建了 4 种不同类型的 LdMNPV 突变体，包括 2 种 egt 基因缺失型病毒，以及另外 2 种在 egt 基因缺失型 的基础上重新修复过的 egt 修复型病毒。利用这 6 种类型病毒感染吉普赛舞毒蛾幼虫后发现，感染野 生型病毒的幼虫能够爬到高处后死亡； 感染 egt 缺 失型病毒的幼虫则与正常幼虫一样，不会出现爬高 行为； egt 修复型病毒则又可以使幼虫出现爬高后死 亡的症状（ 图 1-B） 。这种行为的变化可能与幼虫体 内 20E 的水平降低有关，因为带有 egt 基因的 LdMNPV 能够降低宿主体内 20E 的激素水平，而且被野 生型和修复型病毒感染的幼虫还会出现其它一些 现象，例如 发 病 率 降 低［7］，以 便 使 宿 主 幼 虫 能 够 持 续进食以满足病毒自身复制繁殖的需求。基于以 上分析，Hoover 等［7］认为 egt 基因对于 LdMNPV 感 染操控宿主的行为是必需的。
杆状病毒介绍
杆状病毒介绍杆状病毒关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。
目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。
杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA 复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
用于害虫治理的重组杆状病毒
Ｎ Ｖ感染的幼虫有轻微的肿胀 ， Ｐ 并且 由于包 含体 病 毒 的积 累而 变 白 ， 感 染 的幼 虫 常 会 爬 到 宿 主植 物 被 的上层 叶片并 在 那里 死 去 。
后， 大量 的经 济 作物 ， 苜蓿 、 白菜 、 如 大 玉米 、 花 、 棉 莴
苣、 黄豆 、 草 和番 茄 ， 采 用 了杆状 病 毒 防治 害 虫 ， 烟 都 并 得到 了不 同 程度 的成 功 。其 中最 成 功 的可 能是 巴 西用 杆状 病毒 防治 黄 豆 田里 的黎 豆夜 蛾 ， 治 面 积 防
近 １０万 ｈ ０ ｍ 。在 美 国 ， 已有 数 种 杆 状 病 毒 作 为 生
物 农药 登记 ， 它 们 的商 业应 用较 为 困难 ， 分原 因 但 部
途载 体 。作 为 表 达 体 系 的载 体 ， 状 病 毒 具 有 表 达 杆 率高 和 生物 活 性 等众 多 优 点 。在 北 美 ， 状 病 毒 用 杆
表 １ 目前 害 虫 防 治 中 使 用 的 杆 状 病 毒 一 览 表
注 ：Ｐ 核多角体 病 ； Ｍ Ｐ 多 粒包 埋核 多角体病毒 ； Ｓ Ｐ 单粒包埋核多角 体病毒 ； Ｇ 颗粒体病毒 ； 、纹夜 蛾（ ｕｏｒ ｈ ｆ ４￣． Ｎ Ｖ， Ｎ Ｖ， Ｎ Ｖ， Ｖ， Ｍ－ ｒ Ａ ｔ ａ ａ ｄ／ｒ ｇｐ
防治 ， 而 杀 虫剂 抗 性 的 出现 和 环 境 保 护 的关 注 激 然 励 了生 物 防治 。虽然 作 为 昆 虫靶 标 位点 的 数量 是很
多的 ， 是 过 去 和现 在 生 产 的 化 学 杀 虫 剂 开 发 的靶 但
标位点是其中的少数几个（ 主要限于神经系统 ） 。当
今， 不仅 新 杀 虫 剂 的发 现 和登 记 费用 正 在增 加 ， 而且 还需 要 关 注新 活 性成 分 产 生 交互 抗 性 的可 能性 。因 此 ， 对 于 当代 昆虫 进 化 的步 伐 ， 于 害虫 防治 工 具 相 用 的有 效 性 和 多样性 没 有 增 加 。这 当然 限制 了人 们 治 理 害虫 种群 的能 力 。
重组杆状病毒表达Sf-caspase-1双链RNA对昆虫细胞凋亡的影响
重组杆状病毒表达Sf-caspase-1双链RNA对昆虫细胞凋亡的影响欧艳梅;许晓东【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(044)011【摘要】[目的]构建包含Sf-caspase-1反向重复序列的重组杆状病毒vAcMNPV-dsCasp,并在草地贪夜蛾(Sf9)细胞中表达Sf-caspase-1双链RNA,用以抑制Sf9细胞的凋亡,为未来优化杆状病毒表达系统提供试验依据.[方法]将Sf-caspase-1反向重复序列构建到pBac5上,与AcMNPV Bacmid共转染Sf9细胞产生重组杆状病毒,用RT-PCR和PI活细胞染色方法,分别检测Sf-caspase-1 mRNA含量及Sf9细胞的凋亡情况.[结果]PCR和双酶切检测结果表明,成功构建了重组质粒pBacS-dsCasp,并得到重组杆状病毒vAcMNPV-dsCasp.PI染色结果表明,相比野生型病毒v,AcMNPV,重组杆状病毒vAcMNPV-dsCasp能够抑制Sf9细胞的凋亡.RT-PCR结果表明,vAcMNPV-dsCasp感染的Sf9细胞中Sf-caspase-1 mRNA含量明显下降.[结论]在重组杆状病毒上表达Sf-caspase-1双链RNA确实能够沉默Sf-caspase-1,从而抑制细胞凋亡.【总页数】6页(P187-192)【作者】欧艳梅;许晓东【作者单位】西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.下调长链非编码RNA PVT1表达对胰腺癌BxPC-3细胞凋亡、侵袭及转移的影响 [J], 张行行;赵义;王珏;倪鑫;刘鑫;葛璐;徐岷2.转mapk双链RNA表达载体黄瓜对土壤线虫多样性的影响 [J], 赵晓曼; 赵松宇; 孙婷婷; 田雪亮; 弭宝彬3.长链非编码RNA PVT1在胃癌组织中的表达及对胃癌细胞凋亡的影响 [J], 王倩; 黄赛亚; 崔旭霞; 景琪越; 张笑添4.利用植物自生表达昆虫基因的双链RNA来抑制植食性昆虫防御基因 [J], 本刊编辑部5.抗汉滩病毒双链抗体重组杆状病毒在昆虫细胞中的表达 [J], 胡刚;徐志凯;张芳琳;吴兴安;阎岩;白文涛;于澜;王海涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
昆虫病毒_精品文档
– 多角体病毒属(Nucleopolyhedrovirus) – 颗粒体病毒属(Granulovirus) – 非包埋杆状病毒属(Nonoccluded Baculoviruses)
构成
五、杆状病毒
➢ 通常BEVS由转移载体、亲本病毒和重组介质三 部分组成，其技术路线分以下几步：
➢ 先将外源片段克隆到载体质粒中，置于杆状病毒 启动子控制之下，上下游各有一段与亲本病毒 DNA相匹配的侧翼序列（flanking secquence)， 构建成转移载体；
➢ 把转移载体和野生型病毒共转染入昆虫细胞，通 过同源重组将外源片段插入到病毒基因组，再以 特定的筛选标记和方法获得重组病毒。
➢ 早期的BEVS有很多不足，如： • 重组率较低 • 筛选困难 • 操作周期长 • 产物不易纯化等
五、杆状病毒
➢ 短短20多年时间里，随着杆状病毒分子生物学研 究的不断深入，杆状病毒表达系统迅速发展，不 断完善，已成为当今基因工程领域四大表达系统 之一，在研究基因表达调控、蛋白质结构和功能 分析及各种生物活性物质的制备等方面发挥着越 来越重要的作用。
第七章 昆虫病毒
➢ 地球上的昆虫可能达1000多万种，约占地球生物多样性 的一半，已命名的约100万种。
➢ 中国估计有60-100万种，但已记载的只7万种左右。
第八章 昆虫病毒
一、昆虫病毒的研究 二、昆虫病毒的类型
三、昆虫病毒的一般特性
四、昆虫病毒对有益昆虫的危害
五、杆状病毒(Baculovirus)
五、杆状病毒
昆虫杆状病毒表达载体系统
Baculovirus Expression Vector System，BEVS
杆状病毒昆虫细胞表达系统：原理探微与常见问题解决指南
杆状病毒昆虫细胞表达系统：原理探微与常见问题解决指南在生物技术的广阔天地中，杆状病毒昆虫细胞表达系统以其独特的魅力和广泛的应用前景，正逐渐受到研究者们的青睐。
这一系统巧妙地利用经过改造的杆状病毒基因组，在大肠杆菌中高效复制，并通过精密的转座过程将目的基因精准地插入到bacmid的特定位点。
这一过程不仅展示了生物技术的精巧与奇妙，更为科研工作者提供了强大的工具，用以探索和研究蛋白质的功能与结构。
然而，任何技术在实际应用中总会遇到一些问题和挑战。
为了帮助大家更好地掌握和运用这一系统，本文将深入探讨其原理，并分享在实际操作中可能遇到的常见问题及其解决方案，以期为大家的科研工作提供有益的参考和指导。
杆状病毒昆虫细胞表达系统原理：经过精心改造的病毒基因组（即杆状病毒穿梭载体Bacmid）在此系统中展现了非凡的复制能力。
它们能在大肠杆菌如DH10Bac菌株中自如地繁衍。
这一复制过程得益于供体质粒中目的基因两侧所锚定的Tn7转座原件。
这些原件与DH10Bac菌株中的helper质粒所编码的转座酶活性相互作用，将目的基因精准地转座到bacmid的特定位点上。
当目的基因成功插入后，会导致bacmid上的LacZ基因发生移码，进而通过蓝白斑筛选法轻松鉴定出阳性重组bacmid。
经过提取后，这些bacmid便能转染昆虫细胞，开启其在昆虫细胞中的高效表达之旅。
昆虫-杆状病毒表达平台的常见问题解答1、义翘神州是否接受已构建的表达载体进行蛋白表达？对于众多常规蛋白表达项目，义翘神州确实欢迎并接受客户直接提供的表达载体，如pFastBac等，进行专业的蛋白表达。
我们深知每个蛋白的特性独一无二，因此，我们始终致力于与客户保持紧密的沟通，共同探讨并确定最佳的纯化方案，确保最终交付的产品符合客户的期望和需求。
我们承诺，通过我们的专业知识和丰富经验，将客户的表达载体转化为高质量的蛋白产品。
2、义翘神州是否接受包被好的杆状病毒直接进行蛋白表达？对于一些常规蛋白表达项目我们同样也可以直接使用客户制备好的杆状病毒进行蛋白表达，我们也会根据蛋白的实际特性与客户沟通交流纯化方案和最终交付形式。
昆虫杆状病毒组学研究进展
昆虫杆状病毒组学研究进展梁振普;李路军;张俊庆;刘雅静;吴慧;李鹏娟;冯文霞;张小霞【摘要】杆状病毒(baculoviruses)是一类专性感染无脊椎动物的共价闭合双链环状DNA昆虫病毒.由于杆状病毒对环境和人畜无害,其作为生物农药在生物防治方面发挥着重大作用.此外,杆状病毒还可作为一种真核表达载体,广泛用于药物研发、疫苗生产,以及作为基因转移载体用于基因治疗等方面.综述了杆状病毒的基因组学及蛋白质组学研究进展,对阐明病毒的感染机制具有重要意义,并且在此基础上可针对性地对其进行分子改良或开发高效的生物增效剂.%Baculoviruses is a kind of covalently closed double stranded circular DNA insect virus and specifically infects invertebrates.As baculovirus is harmless to the environment and human beings,it plays an important role in biological control as a biological pesticide.Baculovirus can also be used as a kind of eukaryotic expression vector,widely applied in drug development and vaccine production,as well as gene transfer vector applied in gene therapy.This paper reviewed the research progress of baculovirus genomics and proteomics,which had great significance to clarify the virus infection mechanisms and also would be helpful to carry on molecular modification or develop highly effective biological synergists.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2017(046)008【总页数】6页(P1-6)【关键词】基因组;蛋白质组;杆状病毒;生物防治【作者】梁振普;李路军;张俊庆;刘雅静;吴慧;李鹏娟;冯文霞;张小霞【作者单位】河南农业大学生命科学学院,河南郑州450002;河南农业大学生命科学学院,河南郑州450002;河南农业大学生命科学学院,河南郑州450002;河南农业大学生命科学学院,河南郑州450002;河南农业大学生命科学学院,河南郑州450002;河南农业大学生命科学学院,河南郑州450002;河南农业大学生命科学学院,河南郑州450002;河南农业大学生命科学学院,河南郑州450002【正文语种】中文【中图分类】S476.13杆状病毒(baculoviruses)是一类专性感染无脊椎动物的共价闭合环状双链DNA病毒，病毒粒子呈杆状，因此而得名。
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杆状病毒对昆虫有什么危害
杆状病毒感染会让昆虫患病，目前发现的有：
1.颗粒病体
根据39蜂疗网调查目前仅见于鳞翅目昆虫。
其自然侵染过程与细胞病变均类似于核型多角体病，但病虫症状与核型多角体病不同，病虫皮色变灰或乳黄，虫尸以腹部前端1～2对腹足握持植物枝条，虫尸以“∧”型倒挂。
幼虫被感染后至少至4日龄才发病，死于化蛹前，病虫生存期常大于21天。
2.核型多角体病
现已发现280余种核型多角体病，约占昆虫病毒病总数的40％，大多侵染鳞翅目昆虫。
核型多角体病的自然感染过程为：昆虫吞食了被病毒污染的食物，病毒即进入中肠，在昆虫中肠碱性消化液的作用下，多角体被溶解，释放出病毒粒子，游离病毒粒子的囊膜与中肠上皮细胞绒毛的膜融合，核衣壳侵入细胞中，脱壳后，病毒的DNA经细胞核膜的核孔侵入细胞核内，开始其增殖过程。
随病毒的增殖，细胞表现的病理变化为：细胞核内染色质凝集成块，核仁增大，数目增多，RNA合成旺盛，合成出的RNA不断转移到细胞质中；凝集的染色质块集中于细胞核中部形成网状结构的病毒发生基质，在病毒发生基质中病毒的DNA大量合成。
随后，在病毒发生基质表面核衣壳开始装配，并不断移到细胞核周围，大部分包入新形成的囊膜内，成为成熟的病毒粒子。
最后在病毒发生基质周围形成一个环状带，在带上开始多角体的结晶，病毒粒子随机地包入多角体中，多角体约到一定大小后停止生长，在其表面形成了一层难溶的多角体膜。
从多角体开始形成时起，病毒发生基质开始缩小，待多角体充满细胞核后，病毒发生基质消失，核膨大，破裂，细胞随之崩解。
小部分未被包入多角体的病毒粒子，可随细胞崩解进入昆虫血体腔。
血体胶中病毒粒子的靶细胞为：气管皮膜细胞，脂肪细胞，肌肉细胞，真皮细胞，血细胞及神经、生殖腺、丝腺等几乎所有组织的细胞。
最后新形成的大量多用体充满了昆虫整个血体腔。
蛀虫幼虫被感染后，4～5天体液是乳白色，厌食，不喜运动，多数移到植物枝条顶部后死亡，虫体软化，脚失去握持力，仅以1～2对臀足附着在植物枝条上，最后松弛倒挂死之。
体内组织完全溶解，变成黑褐色，表皮完整但脆弱易破裂。
从感染到处亡约1～2周。